Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الرئيسي لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ومشروع المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31670936، 82041045).

1. بناء البلازميد
<ol><li>أدخل تسلسل SpyCatcher لترميز الحمض النووي (الملف التكميلي 1) في بلازميد pThioHisA-ClyA المقاوم للأمبيسيلين (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و Sal I لبناء pThioHisA ClyA-SC البلازميد بعد تقرير منشور مسبقا20.</li>
	<li>قم بربط جين الاندماج SpyTag-RBD-Histag ال...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

لإنشاء منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" ، تم التعبير عن ClyA المنصهر SC في سلالات BL21 (DE3) ، والتي تعد واحدة من أكثر النماذج استخداما لإنتاج البروتين المؤتلف بسبب مزاياها في التعبير البروتيني24 ، بحيث يكون هناك ما يكفي من شظايا SC المعروضة على سطح OMVs أثناء عملية انتشار ال?...

كمنصة لقاح محتملة ، جذبت الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) المزيد والمزيد من الاهتمام في السنوات الأخيرة 1,2. OMVs ، التي تفرزها بشكل طبيعي البكتيريا سالبة الجرام3 ، هي جسيمات نانوية كروية تتكون من طبقة ثنائية دهنية ، عادة بحجم 20-300 نانومتر4. تحتوي OMVs على مكونات بكتيرية أبوية مختلفة ، بما في ذلك المستضدات البكتيرية والأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، والتي تعمل كمحفزات مناعية صلبة5. بالاستفادة من مكوناتها الفريدة ، وهيكل الحويصلة الطبيعية ، ومواقع تعديل الهندسة الوراثية الرائعة ، تم تطوير OMVs للاستخدام في العديد من المجالات الطبية الحيوية ، بما في ذلك اللقاحات البكتيرية6 ، والمواد المساعدة7 ، وأدوية العلاج المناعي للسرطان8 ، ونواقل توصيل الدواء9 ، والمواد اللاصقة المضادة للبكتيريا10.
تسبب جائحة SARS-CoV-2 ، الذي انتشر في جميع أنحاء العالم منذ عام 2020 ، في خسائر فادحة في المجتمع العالمي. يمكن أن يرتبط مجال ربط المستقبلات (RBD) في بروتين سبايك (بروتين S) بالإنزيم المحول للأنجيوتنسين البشري 2 (ACE2) ، والذي يتوسط بعد ذلك دخول الفيروس إلى الخلية11،12،13. وبالتالي ، يبدو أن RBD هو الهدف الرئيسي لاكتشاف اللقاح14،15،16. ومع ذلك ، فإن RBD الأحادي ضعيف المناعة ، ووزنه الجزيئي الصغير يجعل من الصعب على الجهاز المناعي التعرف عليه ، لذلك غالبا ما تكون المواد المساعدة مطلوبة17.
من أجل زيادة مناعة RBD ، تم إنشاء OMVs التي تعرض RBDs متعددة التكافؤ. عادة ما تدمج الدراسات الحالية التي تستخدم OMV لعرض RBD RBD مع OMV ليتم التعبير عنها في البكتيريا18. ومع ذلك ، فإن RBD هو بروتين مشتق من الفيروس ، ومن المرجح أن يؤثر التعبير بدائي النواة على نشاطه. لحل هذه المشكلة ، تم استخدام نظام SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) ، المشتق من Streptococcus pyogenes ، لتشكيل إيزوببتيد تساهمي مع OMV و RBD في نظام عازلة تقليدي19. تم التعبير عن مجال SC مع Cytolysin A (ClyA) كبروتين اندماج بواسطة الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا ، وتم التعبير عن ST باستخدام RBD عبر نظام التعبير الخلوي HEK293F. تم خلط OMV-SC و RBD-ST وحضنهما بين عشية وضحاها. بعد التنقية عن طريق الطرد المركزي الفائق أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، تم الحصول على OMV-RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

اجتذبت الجسيمات النانوية المحاكية بيولوجيا التي تم الحصول عليها من البكتيريا أو الفيروسات اهتماما كبيرا بالبحث والتطوير في مجال اللقاحات. تفرز الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) بشكل أساسي بواسطة البكتيريا سالبة الجرام أثناء متوسط النمو ، بقطر نانوي ونشاط مساعد ذاتي ، والذي قد يكون مثاليا لتوصيل اللقاح. عملت OMVs كنظام توصيل متعدد الأوجه للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الصغيرة. للاستفادة الكاملة من الخصائص البيولوجية ل OMVs ، تم استخدام OMVs المشتقة من الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا كحامل ومجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) كمستضد لبناء منصة لقاح "التوصيل والعرض". تم تطبيق نطاقات SpyCatcher (SC) و SpyTag (ST) في Streptococcus pyogenes على OMVs و RBD المرافقين. تمت ترجمة جين Cytolysin A (ClyA) مع جين SC كبروتين اندماج بعد نقل البلازميد ، تاركا موقعا تفاعليا على سطح OMVs. بعد خلط RBD-ST في نظام عازلة تقليدي بين عشية وضحاها ، تم تشكيل الربط التساهمي بين OMVs و RBD. وهكذا ، تم تحقيق لقاح OMV متعدد التكافؤ. من خلال الاستبدال بمستضدات متنوعة ، يمكن لمنصة لقاح OMVs عرض مجموعة متنوعة من المستضدات غير المتجانسة بكفاءة ، وبالتالي منع أوبئة الأمراض المعدية بسرعة. يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة لبناء منصة لقاح OMV ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

يوضح الشكل 1 المخطط الانسيابي لهذا البروتوكول. يمكن أن يكون هذا البروتوكول نهجا عاما لاستخدام OMVs كمنصة لقاح. يحتاج المرء فقط إلى اختيار أنظمة التعبير المناسبة بناء على نوع المستضدات.
يوفر الشكل 2 مخطط تصميم بلازميد ممكن. يرتبط جين SC بجين ClyA عب...

Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

يصف البروتوكول الحالي الهندسة الحيوية للحويصلات الغشائية الخارجية بأنها منصة لقاح "التوصيل والعرض" ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

يمكن لعلم النانو أن يعزز بشكل فعال الاستجابة المناعية الخاصة بالمستضد بعد عرض المستضدات على سطح الميزة الرئيسية في منصة اللقاح هذه يمكن أن تحقق الخروج من البلاك والعرض. بمعنى آخر ، فإن النظام الأساسي قادر على عرض مجموعة متنوعة من المستضدات في يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الجسيمات النانوية البيولوجية الأخرى لعرض المحرك على ناقلات بحجم النانو. لإجراء تحويل القسطرة التجسسية cytolysin A ، ابدأ بإضافة خمسة ميكرولتر من محلول البلازما إلى 50 ميكرولتر من سلالة BL 21 المختصة.ينفخ برفق ويترك ليبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة. ضع المحلول لمدة 90 ثانية في حمام مائي عند 42 درجة مئوية ، ثم ضع المحلول المختلط على الثلج لمدة ثلاث دقائق. أضف 500 ميكرولتر من وسط لوريا بيرتاني إلى المعلق البكتيري وبعد خلط الثقافة بمعدل 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك ، قم بلوحة كل لوحة أجار لوريا بيرتاني التي تحتوي على الأمبيسلين والثقافة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لإنتاج OMV spycatcher ، ابدأ بعزل مستعمرة واحدة من اللوحة إلى 20 ملليلتر من وسط لوريا بيرتاني واستزراع بين عشية وضحاها بمعدل 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. احتضان المحلول البكتيري في وسط سعة 2 لتر واستزراعه بمعدل 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات حتى يتم الوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي.أضف الأيزوبروبيل بيتا D-IPTG لجعل التركيز النهائي للمحلول البكتيري 0.5 مليمولار ثم استزرع بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإجراء تنقية OMV spycatcher. ابدأ بدمج المحلول البكتيري.قم بتصفية المادة الطافية بمرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بتركيزها باستخدام عمود ألياف مجوف. قم بتصفية المركز من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بدمجه مركزيا عند 150،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين باستخدام فتيل فائق الوسط ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أعد تعليق هطول الأمطار باستخدام PBS ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.لإجراء نقل RBD spytag ، ابدأ باختيار نظام تعبير حقيقي النواة مناسب وزراعة الخلايا طوال الليل بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بعد التعافي. أضف 20 ميكرولتر HEK 293F من محلول الخلية إلى عداد الخلايا الآلي. سجل عدد الخلايا ، واضبط التركيز على واحد في 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر.ثم استزرع الخلايا بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة سلزية لمدة أربع ساعات. قم بتصفية علامة تجسس RBD على البلازميد من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر وأضف 300 ميكروغرام من البلازميدات إلى وسط زراعة الخلية حتى يصبح الحجم النهائي 10 ملليلتر. يهز لمدة 10 ثوان.تسخين جزيرة الأمير إدوارد إلى 65 درجة مئوية في حمام مائي. امزج 0.7 ملليلتر من جزيرة الأمير إدوارد مع 9.3 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا ، ورجه بشكل متقطع لمدة 10 ثوان. أضف محلول البلازميد إلى محلول جزيرة الأمير إدوارد.يهز الخليط بشكل متقطع لمدة 10 ثوان ، ويحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف الخليط إلى 280 ملليلترا من وسط زراعة الخلايا ، واستزرع عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. بعد ذلك ، قم بإجراء تنقية RBD spytag.ابدأ بدمج الخلايا المركزية عند 6،000 مرة G عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية. املأ العمود بملليلتر من النيكل NTA agarose واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف إيميدازول إلى طافت الخلية لجعل التركيز النهائي 20 ملي مولار ، وقم بتحميل طافت الخلية.أضف ثلاثة أحجام أعمدة من PBS تحتوي على 20 مليمولار من إيميدازول للغسيل ، واجمع جزء الغسيل. التدرج الليوت مع ثلاثة أحجام أعمدة من PBS تحتوي على تركيزات منخفضة إلى عالية من إيميدازول إيلوت مرتين لكل تركيز. لتحديد تركيز البروتين بطريقة BCA ، قم بتخفيف محلول بروتين BSA القياسي بشكل متسلسل من 2 إلى 0.0625 ملليغرام لكل ملليلتر ، وقم بتخفيف مصيدة التجسس OMV المنقاة وعلامة تجسس RBD 10 مرات.ثم امزج حلول عمل BCA A و B بنسبة 50 إلى واحد. أضف محلول البروتين المخفف ، واخلطه مع محلول عمل BCA. احتضان في 37 درجة لمدة 30 دقيقة.قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر من كل بئر ، واحسب تركيز البروتين من المنحنى القياسي. لأداء الاقتران الحيوي ل OMV spycatcher وعلامة تجسس RBD ، امزج OMV spycatcher و RBD spytag و PBS بنسبة 40 إلى واحد. قم بتدويره عموديا لخلط الخليط طوال الليل بمعدل 15 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية.قم بإجراء تنقية OMV RBD باستخدام حل PBS باستخدام إجراء مشابه لتنقية OMV spycatcher. يظهر مخطط تصميم البلازما أن جين spycatcher مرتبط بالجين cly A عبر رابط مرن بينما يتصل spytag بالطرف الرئيسي الخمسة لجين RBD مع جين hys tag للتنقية والتحقق. بعد الطرد المركزي الفائق ، بقيت جميع علامات التجسس RBD غير المتفاعلة تقريبا في المادة الطافية.لم يوفر الطرد المركزي الفائق الثاني ميزة كبيرة أخرى على المرة الأولى. كان متوسط القطر الهيدروديناميكي z ل OMV spycatcher 133 نانومتر بينما كان 152.6 نانومتر ل OMV-RBD. قد تكون هذه الاختلافات بسبب RBD يزيد من حجم جسيمات OMV بعد العرض المكثف.تتوافق نتائج TEM مع توزيع حجم الجسيمات الذي تم الحصول عليه من نتائج DLS. دوران لمزج الخليط مهم جدا. يمكن أن تكون كفاءة التفاعل أقل بكثير بدون دوران.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

تلفيق من Functionalized المغناطيسي البكتيرية Nanocellulose مع أكسيد الحديد النانوية

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

منصة مختبر علي القرص المضغوط لتوليد خزان ثلاثي الابعاد متعدد الخلايا

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

منصة Microfluidics الرقمية المستندة إلى الكهربية للعينات المناعية المناعية المرتبطة بالإنزيمات الآلية

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

جيل من نموذج مبسط ثلاثي الأبعاد للبشرة على رقاقة في منصة Micromachined Microfluidic

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...