Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e il progetto della Chinese National Natural Science Foundation (n. 31670936, 82041045).

1. Costruzione plasmidica
<ol><li>Inserire la sequenza di SpyCatcher codificante DNA (file supplementare 1) in un plasmide pThioHisA-ClyA resistente all'ampicillina (vedi Tabella dei materiali) tra i siti BamH I e Sal I per costruire il plasmide pThioHisA ClyA-SC seguendo un rapporto precedentemente pubblicato20.</li>
	<li>Collegare il gene di fusione sintetizzato SpyTag-RBD-Histag (File supplementare 1) in un plasmide ...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

Per creare una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "Plug-and-Display", ClyA fuso SC è stato espresso in ceppi BL21 (DE3), che è uno dei modelli più utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti a causa dei suoi vantaggi nell'espressione proteica24, in modo che ci sarebbe abbastanza frammento SC visualizzato sulla superficie degli OMV durante il processo di proliferazione batterica. Allo stesso tempo, è stato preparato un antigene bersaglio fuso ST per l'accoppiamento chimico tra gl...

Come potenziale piattaforma vaccinale, le vescicole della membrana esterna (OMV) hanno attirato sempre più attenzione negli ultimi anni 1,2. Gli OMV, principalmente secreti naturalmente dai batteri gram-negativi3, sono particelle sferiche su scala nanometrica composte da un doppio strato lipidico, di solito delle dimensioni di 20-300 nm4. Gli OMV contengono vari componenti batterici parentali, compresi gli antigeni batterici e i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), che fungono da potenziatori immunitari solidi5. Beneficiando dei loro componenti unici, della struttura naturale delle vescicole e dei grandi siti di modifica dell'ingegneria genetica, gli OMV sono stati sviluppati per l'uso in molti campi biomedici, tra cui vaccini batterici6, adiuvanti7, farmaci immunoterapici contro il cancro8, vettori di somministrazione di farmaci9 e adesivi antibatterici10.
La pandemia di SARS-CoV-2, che si è diffusa in tutto il mondo dal 2020, ha avuto un pesante tributo sulla società globale. Il dominio legante il recettore (RBD) nella proteina spike (proteina S) può legarsi con l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), che quindi media l'ingresso del virus nella cellula11,12,13. Pertanto, RBD sembra essere un obiettivo primario per la scoperta del vaccino14,15,16. Tuttavia, la RBD monomerica è scarsamente immunogenica e il suo piccolo peso molecolare rende difficile il riconoscimento per il sistema immunitario, quindi sono spesso necessari adiuvanti17.
Al fine di aumentare l'immunogenicità dei RBD, sono stati costruiti OMV che mostrano RBD polivalenti. Gli studi esistenti che utilizzano OMV per visualizzare RBD di solito fondono RBD con OMV per essere espresso nei batteri18. Tuttavia, RBD è una proteina derivata dal virus e l'espressione procariotica può influenzare la sua attività. Per risolvere questo problema, il sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivato da Streptococcus pyogenes, è stato utilizzato per formare un isopeptide covalente con OMV e RBD in un sistema tampone convenzionale19. Il dominio SC è stato espresso con la citolisina A (ClyA) come proteina di fusione mediante Escherichia coli bioingegnerizzato e ST è stato espresso con RBD tramite il sistema di espressione cellulare HEK293F. OMV-SC e RBD-ST sono stati miscelati e incubati durante la notte. Dopo la purificazione mediante ultracentrifugazione o cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), OMV-RBD è stato ottenuto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Le nanoparticelle biomimetiche ottenute da batteri o virus hanno suscitato un notevole interesse nella ricerca e nello sviluppo di vaccini. Le vescicole della membrana esterna (OMV) sono secrete principalmente da batteri gram-negativi durante la crescita media, con un diametro di dimensioni nanometriche e un'attività autoadiuvante, che può essere ideale per la somministrazione del vaccino. Gli OMV hanno funzionato come un sistema di consegna multiforme per proteine, acidi nucleici e piccole molecole. Per sfruttare appieno le caratteristiche biologiche degli OMV, gli OMV bioingegnerizzati derivati da Escherichia coli sono stati utilizzati come carrier e il dominio legante il recettore SARS-CoV-2 (RBD) come antigene per costruire una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display". I domini SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes sono stati applicati per coniugare OMV e RBD. Il gene della citolisina A (ClyA) è stato tradotto con il gene SC come proteina di fusione dopo trasfezione plasmidica, lasciando un sito reattivo sulla superficie delle OMV. Dopo aver miscelato RBD-ST in un sistema tampone convenzionale durante la notte, è stato formato un legame covalente tra OMV e RBD. Pertanto, è stato raggiunto un vaccino OMV polivalente. Sostituendo con antigeni diversi, la piattaforma vaccinale OMV può visualizzare in modo efficiente una varietà di antigeni eterogenei, prevenendo così potenzialmente rapidamente le epidemie di malattie infettive. Questo protocollo descrive un metodo preciso per costruire la piattaforma vaccinale OMV, compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

Il diagramma di flusso per questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Questo protocollo potrebbe essere un approccio generale all'utilizzo di OMV come piattaforma vaccinale; Basta scegliere i sistemi di espressione appropriati in base al tipo di antigeni.
La Figura 2 fornisce uno schema di progettazione plasmidica fattibile. Il gene SC è collegato con il gene ClyA tramite un linker flessibile, mentre ST si collega al terminale 5...

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A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

Una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "plug-and-display" basata su vescicole di membrana esterne che mostrano il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

La nanoscienza può migliorare efficacemente la risposta immunitaria antigene-specifica dopo aver visualizzato gli antigeni sulla superficie di Il vantaggio principale in questa piattaforma vaccinale può raggiungere la placca e il display di uscita. In altre parole, la piattaforma è in grado di visualizzare la varietà di antigeni in Questo metodo può essere applicato anche ad altre nanoparticelle biologiche per visualizzare il motore a vettori di dimensioni nanometriche. Per eseguire la trasformazione del catetere spia della citolisina A, iniziare con l'aggiunta di cinque microlitri di soluzione plasmatica a 50 microlitri di ceppo competente BL 21.Soffiare delicatamente e lasciare raffreddare sul ghiaccio per 30 minuti. Posizionare la soluzione per 90 secondi a bagnomaria a 42 gradi Celsius, quindi mettere immediatamente la soluzione mista sul ghiaccio per tre minuti. Aggiungere 500 microlitri di luria bertani mezzo alla sospensione batterica e dopo aver miscelato la coltura a 220 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per un'ora.Successivamente, placcare tutta la trasformazione luria bertani agar piastra contenente ampicillina e coltura durante la notte a 37 gradi Celsius. Per la produzione di acchiappaspia OMV, iniziare isolando una singola colonia dalla piastra a 20 millilitri di terreno di luria bertani e coltura durante la notte a 220 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius. Incubare la soluzione batterica in un mezzo da due litri e coltivare a 220 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per cinque ore fino al raggiungimento della fase di crescita logaritmica.Aggiungere isopropil beta D-IPTG per rendere la concentrazione finale della soluzione batterica di 0,5 millimolari e quindi coltivare durante la notte a 220 rotazioni al minuto a 25 gradi Celsius. Quindi, eseguire la purificazione dello spycatcher OMV. Inizia con centri che fondono la soluzione batterica.Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 0,22 micrometri, quindi concentrarlo utilizzando una colonna di fibra cava. Filtrare il concentrato attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri, quindi fonderlo a 150.000 volte G a quattro gradi Celsius per due ore usando un fusibile ultra centri e scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere le precipitazioni con PBS e conservarle a meno 80 gradi Celsius.Per eseguire la trasfezione di spytag RBD, iniziare con la selezione di un appropriato sistema di espressione eucariotica e coltivare le cellule durante la notte a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius dopo il recupero. Aggiungere 20 microlitri HEK 293F di soluzione cellulare nel contatore automatico delle celle. Registrare il numero di celle, regolare la concentrazione a una volta 10 alle sei cellule per millilitro.E poi coltivare le cellule a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per quattro ore. Filtrare il plasmide RBD Spy Tag attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri e aggiungere 300 microgrammi di plasmidi nel mezzo di coltura cellulare fino a quando il volume finale è di 10 millilitri. Agitare per 10 secondi.Riscaldare PEI a 65 gradi Celsius a bagnomaria. Mescolare 0,7 millilitri di PEI con 9,3 millilitri di terreno di coltura cellulare e agitare a intermittenza per 10 secondi. Aggiungere la soluzione plasmidica alla soluzione PEI.Agitare la miscela a intermittenza per 10 secondi e incubarla a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere la miscela a 280 millilitri di terreno di coltura cellulare e coltivare a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Quindi, eseguire la purificazione dello spytag RBD.Inizia con centri che fondono le cellule a 6.000 volte G a 25 gradi Celsius per 20 minuti e usa una pipetta per raccogliere il surnatante. Riempire la colonna con due millilitri di nichel NTA agarosio e lavarla tre volte con PBS. Aggiungere imidazolo nel surnatante cellulare per rendere la concentrazione finale di 20 millimolari e caricare il surnatante cellulare.Aggiungere tre volumi di colonna di PBS contenenti 20 millimolari di imidazolo per il lavaggio e raccogliere la frazione di lavaggio. Eluizione a gradiente con volumi a tre colonne di PBS contenenti concentrazioni da basse ad alte di imidazolo eluito due volte per ciascuna concentrazione. Per determinare la concentrazione proteica con il metodo BCA, diluire in serie la soluzione proteica BSA standard da due a 0,0625 milligrammi per millilitro, diluire lo spycatcher OMV purificato e il tag spia RBD 10 volte.Quindi mescolare le soluzioni di lavoro BCA A e B con un rapporto di 50 a uno. Aggiungere la soluzione proteica diluita e mescolare con la soluzione di lavoro BCA. Incubare a 37 gradi per 30 minuti.Misurare l'assorbanza a 562 nanometri di ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard. Per eseguire la bioconiugazione di OMV spycatcher e RBD spy tag, mescolare OMV spycatcher e RBD spytag e PBS con un rapporto di 40 a uno. Ruotare verticalmente per frullare la miscela durante la notte a 15 rotazioni al minuto a quattro gradi Celsius.Eseguire la purificazione di OMV RBD utilizzando la soluzione PBS utilizzando una procedura simile alla purificazione dello spycatcher OMV. Lo schema di progettazione del plasma mostra che il gene spycatcher è collegato al gene cly A tramite linker flessibile mentre lo spytag si collega ai cinque terminali principali del gene RBD con un gene hys tag per la purificazione e la verifica. Dopo l'ultracentrifugazione, quasi tutti gli spytag RBD non reagiti sono rimasti nel surnatante.La seconda ultracentrifugazione non ha fornito un ulteriore vantaggio significativo rispetto alla prima volta. Il diametro idrodinamico medio z dello spycatcher OMV era di 133 nanometri mentre era di 152,6 nanometri per OMV-RBD. Queste differenze possono essere dovute al fatto che RBD aumenta la dimensione delle particelle OMV dopo una visualizzazione intensiva.I risultati di TEM sono coerenti con la distribuzione granulometrica ottenuta dai risultati DLS. La rotazione per la miscelazione della miscela è molto importante. L'efficienza della reazione può essere molto più bassa senza rotazione.

Research

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