Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

この作業は、重慶自然科学基金会の主要プログラム(No.cstc2020jcyj-zdxmX0027)および中国国家自然科学財団プロジェクト(第31670936号、82041045)。

1. プラスミド構築
<ol><li>SpyCatcher配列をコードするDNA(補足ファイル1)を、BamH IサイトとSal Iサイトの間のアンピシリン耐性pThioHisA-ClyAプラスミド(材料表を参照)に挿入し、以前に発表された第20相に続いてプラスミドpThioHisA ClyA-SCを構築します。</li>
	<li>合成したSpyTag-RBD-Histag融合遺伝子(補足ファイル1)を、BamH Iサイトと...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームを作成するために、SC融合ClyAは、タンパク質発現24の利点のために組換えタンパク質生産に最も広く使用されているモデルの1つであるBL21(DE3)株で発現され、細菌増殖の過程でOMVの表面に十分なSCフラグメントが表示されます。同時に、抗原とOMVの間の化学的カップリングのためにST融合標的抗原を調製した。...

潜在的なワクチンプラットフォームとして、外膜小胞(OMV)は近年ますます注目を集めています1,2。主にグラム陰性菌3によって自然に分泌されるOMVは、通常20〜300nmのサイズの脂質二重層で構成される球状のナノスケール粒子です4。OMVには、細菌抗原や病原体関連分子パターン(PAMP)など、固形免疫増強因子として機能するさまざまな親細菌成分が含まれています5。OMVは、そのユニークな成分、自然な小胞構造、および優れた遺伝子工学修飾部位の恩恵を受けて、細菌ワクチン6、アジュバント7、癌免疫療法薬8、薬物送達ベクター9、および抗菌接着剤10を含む多くの生物医学分野で使用するために開発されてきました。
2020年以降世界中に広がったSARS-CoV-2のパンデミックは、グローバル社会に大きな打撃を与えました。スパイクタンパク質(Sタンパク質)の受容体結合ドメイン(RBD)は、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合することができ、次いで、細胞へのウイルスの侵入を媒介する11、12、13。したがって、RBDはワクチン発見の主要な標的であるように思われます14,15,16。しかし、単量体RBDは免疫原性が低く、分子量が小さいため免疫系が認識しにくいため、アジュバントが必要になることがよくあります17。
RBDの免疫原性を高めるために、多価RBDを示すOMVを構築した。RBDを表示するためにOMVを使用する既存の研究は、通常、RBDをOMVと融合させて細菌で発現させます18。しかし、RBDはウイルス由来のタンパク質であり、原核生物の発現はその活性に影響を与える可能性があります。この問題を解決するために、 化膿レンサ球菌由来のSpyTag(ST)/SpyCatcher(SC)系を用いて、従来の緩衝系においてOMVおよびRBDと共有結合性イソペプチドを形成した19。SCドメインは、バイオエンジニアリングされた 大腸菌による融合タンパク質としてCytolysin A(ClyA)で発現し、STはHEK293F細胞発現系を介してRBDで発現しました。OMV-SCとRBD-STを混合し、一晩インキュベートしました。超遠心またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製後、OMV-RBDが得られた。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

細菌またはウイルスから得られる生体模倣ナノ粒子は、ワクチンの研究開発において大きな関心を集めている。外膜小胞(OMV)は、平均的な成長中に主にグラム陰性菌によって分泌され、ナノサイズの直径と自己アジュバント活性を持ち、ワクチンの送達に理想的である可能性があります。OMVは、タンパク質、核酸、および低分子の多面的な送達システムとして機能してきました。OMVの生物学的特性を最大限に活用するために、バイオエンジニアリングされた 大腸菌由来のOMVをキャリアとして、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)を抗原として利用して、「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームを構築しました。 化膿レンサ 球菌のスパイキャッチャー(SC)ドメインとスパイタグ(ST)ドメインをコンジュゲートOMVとRBDに適用しました。Cytolysin A(ClyA)遺伝子は、プラスミドトランスフェクション後に融合タンパク質としてSC遺伝子とともに翻訳され、OMVの表面に反応部位を残しました。従来のバッファーシステムでRBD-STを一晩混合した後、OMVとRBDの間に共有結合を形成しました。このようにして、多価表示OMVワクチンが達成された。OMVワクチンプラットフォームは、多様な抗原に置き換えることで、さまざまな不均一な抗原を効率的に表示できるため、感染症の流行を迅速に防ぐことができます。このプロトコルは、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む、OMVワクチンプラットフォームを構築するための正確な方法を説明しています。

このプロトコルのフローチャートを 図 1 に示します。このプロトコルは、OMVをワクチンプラットフォームとして利用するための一般的なアプローチである可能性があります。抗原の種類に基づいて適切な発現システムを選択するだけで済みます。
図2は、実現可能なプラスミド設計スキームを示しています。SC遺伝子はフレキ?...

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A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

本プロトコルは、外膜小胞のバイオエンジニアリングを、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームとして説明しています。

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

ナノサイエンスは、表面に抗原を表示した後、抗原特異的免疫応答を効果的に強化することができます このワクチンプラットフォームの主な利点は、プラークとディスプレイのゴーオフを達成することができます。換言すれば、プラットフォームは、この方法において様々な抗原を表示することができ、他の生物学的ナノ粒子にも適用してエンジンをナノサイズの担体に表示することができる。サイトライシンAスパイカテーテル変換を実行するには、50マイクロリットルのBL 21コンピテント株に5マイクロリットルの血漿溶液を加えることから始めます。静かに吹き、氷上で30分間冷まします。溶液を摂氏42度の水浴に90秒間置き、次に混合溶液を氷上に3分間置く。500マイクロリットルのルリアベルターニ培地を細菌懸濁液に加え、毎分220回転で摂氏37度で1時間混合培養した後。次に、アンピシリンを含む形質転換ルリア・ベルタニ寒天プレートを全てプレートし、摂氏37度で一晩培養した。OMVスパイキャッチャーの生産では、プレートから単一のコロニーを20ミリリットルのルリアベルターニ培地に分離し、摂氏37度で毎分220回転で一晩培養することから始めます。細菌溶液を2リットルの培地にインキュベートし、摂氏37度で毎分220回転で対数増殖段階に達するまで5時間培養します。イソプロピルベータD-IPTGを加えて細菌溶液の最終濃度を0.5ミリモルにし、摂氏25度で毎分220回転で一晩培養します。次に、OMVスパイキャッチャーの精製を実行します。細菌溶液を遠心分離して融合することから始めます。上清を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、中空糸カラムを使用して濃縮します。濃縮液を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心ヒューズを使用して摂氏4度で2時間、150, 000倍Gで遠心融合し、ピペットで上清を廃棄します。沈殿をPBSで再懸濁し、摂氏マイナス80度で保存します。RBD spytagトランスフェクションを実行するには、適切な真核生物発現系を選択することから始め、回収後、細胞を摂氏37度で毎分130回転で一晩培養します。20マイクロリットルのHEK 293Fセル溶液を自動セルカウンターに追加します。細胞数を記録し、濃度を1ミリリットルあたり10〜6細胞に1倍に調整する。そして、細胞を摂氏37度で毎分130回転で4時間培養します。RBDスパイタグプラスミドを0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10ミリリットルになるまで300マイクログラムのプラスミドを細胞培養培地に加えます。10秒間振とうします。PEIを水浴中で摂氏65度に加熱する。0.7ミリリットルのPEIと9.3ミリリットルの細胞培養培地を混合し、10秒間断続的に振とうします。プラスミド溶液をPEI溶液に加える。混合物を10秒間断続的に振とうし、摂氏37度で15分間インキュベートします。この混合物を280ミリリットルの細胞培養培地に加え、摂氏37度で毎分130回転で5日間培養する。次に、RBDスパイタグの精製を実行します。摂氏25度で20分間、6, 000倍Gで細胞を遠心分離して融合させ、ピペットを使用して上清を収集します。カラムに2ミリリットルのニッケルNTAアガロースを入れ、PBSで3回洗浄します。細胞上清にイミダゾールを加えて最終濃度を20ミリモルにし、細胞上清をロードします。洗浄のために20ミリモルのイミダゾールを含むPBSを3カラム容量加え、洗浄画分を回収する。低濃度から高濃度のイミダゾールを含む3カラム容量のPBSによるグラジエント溶出は、各濃度に対して2回溶出します。BCA法によってタンパク質濃度を決定するには、標準BSAタンパク質溶液をミリリットルあたり2〜0.0625ミリグラムに連続的に希釈し、精製されたOMVスパイキャッチャーとRBDスパイタグを10倍に希釈します。次に、BCA作業溶液AとBを50対1の比率で混合します。希釈したタンパク質溶液を加え、BCA作業溶液と混合します。37度で30分間インキュベートします。各ウェルの562ナノメートルの吸光度を測定し、検量線からタンパク質濃度を算出する。OMVスパイキャッチャーとRBDスパイタグのバイオコンジュゲーションを実行するには、OMVスパイキャッチャーとRBDスパイタグとPBSを40対1の比率で混合します。垂直回転させて、摂氏4度で毎分15回転で一晩混合物をブレンドします。OMVスパイキャッチャー精製と同様の手順を使用して、PBS溶液を使用してOMV RBDの精製を実行します。血漿設計スキームは、スパイキャッチャー遺伝子がフレキシブルリンカーを介してcly A遺伝子に接続され、スパイタグが精製および検証のためにhysタグ遺伝子でRBD遺伝子の5つのプライム末端に接続することを示しています。超遠心後、ほとんどすべての未反応RBDスパイタグが上清に残った。2回目の超遠心分離は、1回目に比べてさらに大きな利点を提供しませんでした。OMVスパイキャッチャーのz平均流体力学的直径は133ナノメートルでしたが、OMV-RBDは152.6ナノメートルでした。これらの違いは、RBDが集中的な表示後にOMV粒子サイズを増加させるためである可能性があります。TEMの結果は、DLSの結果から得られた粒度分布と一致している。混合物をブレンドするための回転は非常に重要です。反応効率は回転なしでははるかに低くなる可能性があります。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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