Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

이 연구는 충칭 자연 과학 재단의 핵심 프로그램 (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) 및 중국 국립 자연 과학 재단 프로젝트 (No. 31670936, 82041045).

1. 플라스미드 구성
<ol><li>SpyCatcher 서열을 코딩하는 DNA (보충 파일 1)를 BamH I 및 Sal I 부위 사이의 암피실린 내성 pThioHisA-ClyA 플라스미드 (재료 표 참조)에 삽입하여 이전에 발표 된 보고서20에 따라 플라스미드 pThioHisA ClyA-SC를 구축합니다.</li>
	<li>합성된 SpyTag-RBD-Histag 융합 유전자(보충 파일 1)를 BamH I 및 EcoR I 부위 사이의 pc...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

"플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼을 만들기 위해 SC 융합 ClyA는 단백질 발현24의 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 모델 중 하나인 BL21(DE3) 균주에서 발현되어 박테리아 증식 과정에서 OMV 표면에 충분한 SC 단편이 표시됩니다. 동시에, 항원과 OMV 사이의 화학적 결합을 위해 ST-융합 표적 항원을 제조하였다. 이 실험 계획의 장점과 향후 적용 전망?...

잠재적인 백신 플랫폼으로서 외막 소포(OMV)는최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다1,2. 주로 그람 음성 박테리아3에 의해 자연적으로 분비되는 OMV는 일반적으로 20-300 nm4 크기의 지질 이중층으로 구성된 구형 나노 스케일 입자입니다. OMV에는 박테리아 항원 및 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한 다양한 모 박테리아 구성 요소가 포함되어 있으며, 이는 고체 면역 강화제역할을 합니다5. OMV는 고유한 구성 요소, 천연 소포 구조 및 우수한 유전 공학 변형 부위의 이점을 활용하여 박테리아 백신6, 보조제7, 암 면역 요법 약물8, 약물 전달 벡터9 및 항균 접착제10을 포함한 많은 생물 의학 분야에서 사용하기 위해 개발되었습니다.
2020년부터 전 세계적으로 확산된 SARS-CoV-2 팬데믹은 글로벌 사회에 큰 타격을 입혔습니다. 스파이크 단백질 (S 단백질)의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2)와 결합 할 수 있으며, 이는 세포11,12,13으로의 바이러스 진입을 매개합니다. 따라서 RBD는 백신 발견14,15,16의 주요 표적인 것으로 보입니다. 그러나, 단량체 RBD는 면역원성이 좋지 않고, 분자량이 작기 때문에 면역계가 인식하기 어렵기 때문에 보조제가 종종 필요하다17.
RBD의 면역원성을 증가시키기 위해, 다가 RBD를 나타내는 OMV가 구축되었다. RBD를 표시하기 위해 OMV를 사용하는 기존 연구는 일반적으로 RBD를 OMV와 융합하여 박테리아18에서 발현됩니다. 그러나 RBD는 바이러스 유래 단백질이며 원핵 생물 발현이 그 활성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 스트렙토코커스 화농성으로부터 유래된 SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) 시스템을 사용하여 종래의 완충 시스템19에서 OMV 및 RBD와 공유 이소펩타이드를 형성하였다. SC 도메인은 생체 공학 대장균에 의한 융합 단백질로서 Cytolysin A (ClyA)로 발현되었고, ST는 HEK293F 세포 발현 시스템을 통해 RBD로 발현되었다. OMV-SC 및 RBD-ST를 혼합하고 밤새 배양하였다. 초원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 정제 후, OMV-RBD를 수득하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

박테리아 또는 바이러스로부터 얻은 생체 모방 나노 입자는 백신 연구 및 개발에 상당한 관심을 끌었습니다. 외막 소포(OMV)는 평균 성장 동안 주로 그람 음성 박테리아에 의해 분비되며, 나노 크기의 직경과 자가 보조 활성을 가지고 있어 백신 전달에 이상적일 수 있습니다. OMV는 단백질, 핵산 및 소분자에 대한 다면적 전달 시스템으로 기능했습니다. OMV의 생물학적 특성을 최대한 활용하기 위해 생체 공학 대장균 유래 OMV를 운반체로, SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)을 항원으로 활용하여 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼을 구축했습니다. 스트렙토코커스 화농성 내의 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인을 접합체 OMV 및 RBD에 적용하였다. Cytolysin A (ClyA) 유전자는 플라스미드 형질 감염 후 융합 단백질로서 SC 유전자와 함께 번역되어 OMV 표면에 반응 부위를 남겼습니다. 종래의 완충 시스템에서 RBD-ST를 밤새 혼합한 후, OMV와 RBD 사이에 공유 결합이 형성되었다. 따라서, 다가 표시 OMV 백신이 달성되었다. OMV 백신 플랫폼은 다양한 항원으로 대체함으로써 다양한 이종 항원을 효율적으로 표시하여 잠재적으로 전염병 전염병을 신속하게 예방할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산, 정제, 생체 접합 및 특성화를 포함하여 OMV 백신 플랫폼을 구성하는 정확한 방법을 설명합니다.

이 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 OMV를 백신 플랫폼으로 활용하는 일반적인 접근 방식일 수 있습니다. 항원의 유형에 따라 적절한 발현 시스템을 선택하기 만하면됩니다.
도 2는 실현 가능한 플라스미드 설계 스킴을 제공한다. SC 유전자는 유연한 링커를 통해 ClyA 유전자와 연결되고, ST는 정제 및 검증...

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A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

나노 과학은 표면에 항원을 표시 한 후 항원 특이 적 면역 반응을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.이 백신 플랫폼의 주요 장점은 플라크 및 디스플레이를 제거 할 수 있습니다. 즉, 플랫폼에서 다양한 항원을 표시할 수 있게 되어 이 방법은 나노크기의 담체에 다른 생체 나노입자를 디스플레이엔진으로 적용할 수도 있다. cytolysin A 스파이 카테터 변형을 수행하려면 50 마이크로 리터의 BL 21 적격 균주에 5 마이크로 리터의 혈장 용액을 첨가하는 것으로 시작하십시오.부드럽게 불어서 얼음에서 30 분 동안 식히십시오. 섭씨 42 도의 수조에 90 초 동안 용액을 넣은 다음 즉시 혼합 용액을 얼음에 3 분 동안 두십시오. 500 마이크로리터의 루리아 베르타니 배지를 박테리아 현탁액에 첨가하고, 혼합 배양 후 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 1시간 동안 배양한다.다음으로, 암피실린을 함유하는 모든 형질전환루리아 베르타니 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. OMV 스파이캐처 생산의 경우, 플레이트에서 단일 콜로니를 20밀리리터의 루리아 베르타니 배지로 분리하고 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 밤새 배양하는 것으로 시작합니다. 박테리아 용액을 2리터 배지에 넣고 대수 성장 단계에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 5시간 동안 배양합니다.이소프로필 베타 D-IPTG를 첨가하여 박테리아 용액의 최종 농도를 0.5밀리몰로 만든 다음 섭씨 25도에서 분당 220회전으로 밤새 배양합니다. 다음으로 OMV 스파이 캐처 정제를 수행하십시오. 박테리아 용액을 융합하는 센트리로 시작하십시오.0.22 마이크로 미터 멤브레인 필터로 상청액을 여과 한 다음 중공 섬유 컬럼을 사용하여 농축하십시오. 농축액을 0.22 마이크로 미터 멤브레인 필터를 통해 여과 한 다음 초 센트리 퓨즈를 사용하여 섭씨 4도에서 2 시간 동안 섭씨 150, 000 배 G에서 센트리 융합하고 피펫으로 상층액을 버립니다. PBS로 강수량을 다시 현탁하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.RBD 스파이태그 형질감염을 수행하려면 적절한 진핵생물 발현 시스템을 선택하는 것으로 시작하여 회복 후 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 밤새 세포를 배양합니다. 20마이크로리터 HEK 293F의 세포 용액을 자동 세포 카운터에 추가합니다. 세포의 수를 기록하고, 밀리리터당 6개의 세포에 10배로 농도를 조절한다.그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 4시간 동안 배양합니다. 0.22 마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 RBD 스파이 태그 플라스미드를 여과하고 최종 부피가 10밀리리터가 될 때까지 300마이크로그램의 플라스미드를 세포 배양 배지에 추가합니다. 10 초 동안 흔들어주십시오.수조에서 PEI를 섭씨 65도까지 가열합니다. 0.7 밀리리터의 PEI와 9.3 밀리리터의 세포 배양 배지를 혼합하고 10 초 동안 간헐적으로 흔든다. PEI 용액에 플라스미드 용액을 첨가한다.혼합물을 10초 동안 간헐적으로 흔들고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물을 280 밀리리터의 세포 배양 배지에 첨가하고, 5일 동안 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 배양한다. 다음으로 RBD 스파이 태그 정제를 수행하십시오.섭씨 25도에서 20 분 동안 6, 000 배 G에서 세포를 융합하는 중심에서 시작하고 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다. 컬럼에 2 밀리리터의 니켈 NTA 아가 로스를 채우고 PBS로 3 회 세척하십시오. 이미다졸을 세포 상청액에 첨가하여 최종 농도가 20밀리몰이 되도록 하고 세포 상청액을 적재합니다.세척을 위해 20 밀리몰의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3개의 컬럼 부피를 첨가하고, 세척 분획을 수집한다. 저농도에서 고농도의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3열 부피로 그래디언트 용리를 각 농도에 대해 2회 용리한다. BCA 방법으로 단백질 농도를 측정하려면 표준 BSA 단백질 용액을 밀리리터당 2에서 0.0625 밀리그램으로 연속 희석하고 정제된 OMV 스파이캐처 및 RBD 스파이 태그를 10배 희석합니다.그런 다음 BCA 작업 용액 A와 B를 50 대 1의 비율로 혼합하십시오. 희석 된 단백질 용액을 첨가하고 BCA 작업 용액과 혼합하십시오. 37도에서 30 분 동안 배양하십시오.각 웰의 562 나노미터에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선으로부터 단백질 농도를 계산한다. OMV 스파이캐처와 RBD 스파이 태그의 생체 접합을 수행하려면 OMV 스파이캐처와 RBD 스파이태그 및 PBS를 40:1 비율로 혼합합니다. 수직으로 회전하여 섭씨 4도에서 분당 15회전으로 혼합물을 밤새 혼합합니다.OMV 스파이캐처 정제와 유사한 절차를 사용하여 PBS 용액을 사용하여 OMV RBD의 정제를 수행합니다. 혈장 설계 방식은 스파이캐처 유전자가 유연한 링커를 통해 cly A 유전자와 연결되는 반면 스파이태그는 정제 및 검증을 위해 hys 태그 유전자로 RBD 유전자의 5개 프라임 말단에 연결됨을 보여줍니다. 초원심분리 후, 거의 모든 반응하지 않은 RBD 스파이태그가 상청액에 남아있었다.두 번째 초원심분리는 첫 번째에 비해 더 유의한 이점을 제공하지 않았습니다. OMV 스파이캐처의 z 평균 유체역학적 직경은 133나노미터인 반면 OMV-RBD의 경우 152.6나노미터였습니다. 이러한 차이는 RBD가 집중 표시 후 OMV 입자 크기를 증가시키기 때문일 수 있습니다.TEM의 결과는 DLS 결과로부터 수득된 입자 크기 분포와 일치한다. 혼합물을 혼합하기위한 회전은 매우 중요합니다. 반응 효율은 회전없이 훨씬 낮을 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

피부는 DNA 백신 배달을위한 새로운 접근 방식으로 문신

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

연구

생체공학

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

골연세포 메카노트랜스덕션 을 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과 분석을 위한 Lab-On-A-Chip 플랫폼

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...