Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av nøkkelprogrammet til Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 31670936, 82041045).

1. Plasmid konstruksjon
<ol><li>Sett inn DNA-koding SpyCatcher-sekvens (tilleggsfil 1) i et ampicillinresistent pThioHisA-ClyA-plasmid (se materialtabell) mellom BamH I- og Sal I-stedene for å konstruere plasmidet pThioHisA ClyA-SC etter en tidligere publisert rapport20.</li>
	<li>Ligate det syntetiserte SpyTag-RBD-Histag-fusjonsgenet (Supplementary File 1) til et pcDNA3.1-plasmid (se Materialtabell) m...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

For å skape en "Plug-and-Display" nanopartikkelvaksineplattform ble SC-smeltet ClyA uttrykt i BL21 (DE3) stammer, som er en av de mest brukte modellene for rekombinant proteinproduksjon på grunn av fordelene i proteinuttrykk24, slik at det ville være nok SC-fragment som vises på overflaten av OMVene under prosessen med bakterieproliferasjon. Samtidig ble det fremstilt et ST-smeltet målantigen for den kjemiske koblingen mellom antigenene og OMV-ene. Denne eksperimentelle ordningens fordeler og...

Som en potensiell vaksineplattform har ytre membranvesikler (OMV) tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet de siste årene 1,2. OMV-er, hovedsakelig utskilt naturlig av gramnegative bakterier3, er sfæriske nanoskalapartikler sammensatt av et lipid-dobbeltlag, vanligvis i størrelsen 20-300 nm4. OMV-er inneholder forskjellige foreldrebakterielle komponenter, inkludert bakterielle antigener og patogenassosierte molekylære mønstre (PAMPs), som fungerer som faste immunpotensiatorer5. Ved å dra nytte av deres unike komponenter, naturlige vesikkelstruktur og gode genteknologiske modifikasjonssteder, har OMV-er blitt utviklet for bruk i mange biomedisinske felt, inkludert bakterielle vaksiner6, adjuvanser7, kreftimmunterapimedisiner8, legemiddelleveringsvektorer9 og antibakterielle lim10.
SARS-CoV-2-pandemien, som har spredt seg over hele verden siden 2020, har gått hardt utover det globale samfunnet. Det reseptorbindende domenet (RBD) i piggprotein (S-protein) kan binde seg til humant angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2), som deretter formidler virusets inntreden i cellen11,12,13. Dermed ser RBD ut til å være et hovedmål for vaksineoppdagelse14,15,16. Imidlertid er monomer RBD dårlig immunogen, og den lille molekylvekten gjør det vanskelig for immunsystemet å gjenkjenne, så adjuvanser er ofte nødvendig17.
For å øke immunogenisiteten til RBD ble OMV-er som viste polyvalente RBD-er konstruert. Eksisterende studier som bruker OMV for å vise RBD, smelter vanligvis RBD med OMV som skal uttrykkes i bakterier18. Imidlertid er RBD et virusavledet protein, og prokaryotisk uttrykk vil sannsynligvis påvirke aktiviteten. For å løse dette problemet ble SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) -systemet, avledet fra Streptococcus pyogenes, brukt til å danne et kovalent isopeptid med OMV og RBD i et konvensjonelt buffersystem19. SC-domenet ble uttrykt med Cytolysin A (ClyA) som et fusjonsprotein av bioengineered Escherichia coli, og ST ble uttrykt med RBD via HEK293F cellulære ekspresjonssystem. OMV-SC og RBD-ST ble blandet og inkubert over natten. Etter rensing ved ultrasentrifugering eller størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) BLE OMV-RBD oppnådd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Biomimetiske nanopartikler hentet fra bakterier eller virus har tiltrukket seg stor interesse for vaksineforskning og utvikling. Ytre membranvesikler (OMV) utskilles hovedsakelig av gramnegative bakterier under gjennomsnittlig vekst, med en nanostørrelsesdiameter og selvadjuvant aktivitet, noe som kan være ideelt for vaksinelevering. OMV-er har fungert som et mangefasettert leveringssystem for proteiner, nukleinsyrer og små molekyler. For å dra full nytte av de biologiske egenskapene til OMV-er, ble bioengineerte Escherichia coli-avledede OMV-er benyttet som bærer og SARS-CoV-2-reseptorbindende domene (RBD) som et antigen for å konstruere en "Plug-and-Display" vaksineplattform. Domenene SpyCatcher (SC) og SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes ble brukt på konjugerte OMVer og RBD. Cytolysin A (ClyA) -genet ble oversatt med SC-genet som et fusjonsprotein etter plasmidtransfeksjon, og etterlot et reaktivt sted på overflaten av OMVene. Etter blanding av RBD-ST i et konvensjonelt buffersystem over natten, ble det dannet kovalent binding mellom OMV-ene og RBD. Dermed ble en multivalent OMV-vaksine oppnådd. Ved å erstatte med forskjellige antigener, kan OMVs vaksineplattform effektivt vise en rekke heterogene antigener, og dermed potensielt raskt forhindre smittsomme sykdomsepidemier. Denne protokollen beskriver en presis metode for å konstruere OMV-vaksineplattformen, inkludert produksjon, rensing, biokonjugering og karakterisering.

Flytskjemaet for denne protokollen er vist i figur 1. Denne protokollen kan være en generell tilnærming til å bruke OMV-er som vaksineplattform; Man trenger bare å velge de riktige ekspresjonssystemene basert på typen antigener.
Figur 2 gir et gjennomførbart plasmiddesignskjema. SC-genet er forbundet med ClyA-genet via en fleksibel linker, mens ST kobles til 5 'terminalen av RBD-genet med et His-tag-gen for rensing og verifiseri...

Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Den nåværende protokollen beskriver bioengineering av ytre membranvesikler for å være en "Plug-and-Display" vaksineplattform, inkludert produksjon, rensing, biokonjugering og karakterisering.

En "plug-and-display" nanopartikkelvaksineplattform basert på ytre membranvesikler som viser SARS-CoV-2 reseptorbindende domene

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanovitenskap kan effektivt forbedre den antigenspesifikke immunresponsen etter å ha vist antigener på overflaten av Den største fordelen i denne vaksineplattformen kan oppnå å gå av plakk og skjerm. Med andre ord, plattformen er i stand til å vise forskjellige antigener i Denne metoden kan også brukes på andre biologiske nanopartikler for å vise motor til nanostørrelsesbærere. For å utføre cytolysin En spionkatetertransformasjon, start med å legge til fem mikroliter plasmaoppløsning til 50 mikroliter BL 21 kompetent stamme.Blås forsiktig og la avkjøles på is i 30 minutter. Plasser løsningen i 90 sekunder i vannbadet ved 42 grader Celsius, og legg deretter den blandede løsningen umiddelbart på is i tre minutter. Tilsett 500 mikroliter luria bertani-medium til bakteriesuspensjonen og etter blandingskultur ved 220 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius i en time.Deretter plate all transformasjon luria bertani agar plate som inneholder ampicillin og kultur over natten ved 37 grader Celsius. For OMV-spycatcherproduksjon, start med å isolere en enkelt koloni fra platen til 20 milliliter luria bertani-medium og kultur over natten ved 220 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius. Inkuber bakterieoppløsningen i et to liters medium og kultur ved 220 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius i fem timer til det logaritmiske vekststadiet er nådd.Tilsett isopropyl beta D-IPTG for å gjøre den endelige konsentrasjonen av bakterieoppløsningen til 0, 5 millimolar og deretter kultur over natten ved 220 rotasjoner per minutt ved 25 grader Celsius. Deretter utfører du OMV-spycatcher-rensing. Start med å smelte sammen bakterieoppløsningen.Filtrer supernatanten med et 0, 22 mikrometer membranfilter, konsentrer det deretter ved hjelp av en hul fiberkolonne. Filtrer konsentratet gjennom et 0,22 mikrometer membranfilter, sentri sikring det ved 150 000 ganger G ved fire grader Celsius i to timer ved hjelp av en ultra sentri-sikring, og kast supernatanten med en pipette. Stopp nedbøren på nytt med PBS, og oppbevar den ved minus 80 grader Celsius.For å utføre RBD-spytag-transfeksjon, begynn med å velge et passende eukaryotisk uttrykkssystem og kultur cellene over natten ved 130 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius etter utvinning. Tilsett 20 mikroliter HEK 293F celleoppløsning i den automatiserte celletelleren. Registrer antall celler, juster konsentrasjonen til en gang 10 til de seks cellene per milliliter.Og så dyrk cellene ved 130 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius i fire timer. Filtrer RBD spion tag plasmid gjennom et 0, 22 mikrometer membranfilter og tilsett 300 mikrogram plasmider i cellekulturmediet til det endelige volumet er 10 milliliter. Rist i 10 sekunder.Varm PEI til 65 grader Celsius i vannbadet. Bland 0,7 milliliter PEI med 9,3 milliliter cellekulturmedium, og rist periodisk i 10 sekunder. Tilsett plasmidoppløsning til PEI-løsningen.Rist blandingen periodisk i 10 sekunder, og inkuber den ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsett blandingen til 280 ml cellekulturmedium, og kultur ved 130 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius i fem dager. Deretter utfører du RBD spytag-rensing.Start med å smelte sammen cellene ved 6.000 ganger G ved 25 grader Celsius i 20 minutter, og bruk en pipette for å samle supernatanten. Fyll kolonnen med to milliliter nikkel NTA agarose og vask den tre ganger med PBS. Tilsett imidazol i cellesupernatanten for å gjøre den endelige konsentrasjonen på 20 millimolar, og last cellesupernatanten.Tilsett tre kolonnevolumer PBS som inneholder 20 millimolar imidazol for vask, og samle vaskefraksjonen. Gradient eluer med tre kolonnevolumer av PBS som inneholder lave til høye konsentrasjoner av imidazol eluert to ganger for hver konsentrasjon. For å bestemme proteinkonsentrasjonen ved BCA-metoden, fortynn serielt standard BSA-proteinoppløsning fra to til 0,0625 milligram per milliliter, fortynn den rensede OMV-spycatcheren og RBD-spionkoden 10 ganger.Bland deretter BCA-arbeidsløsninger A og B i forholdet 50 til en. Tilsett fortynnet proteinoppløsning, og bland med BCA-arbeidsløsning. Inkuber ved 37 grader i 30 minutter.Mål absorbansen ved 562 nanometer av hver brønn, og beregn proteinkonsentrasjonen fra standardkurven. For å utføre biokonjugering av OMV-spycatcher og RBD-spionmerke, bland OMV-spycatcher og RBD spytag og PBS i et forhold på 40 til ett. Roter vertikalt for å blande blandingen over natten ved 15 rotasjoner per minutt ved fire grader Celsius.Utfør rensing av OMV RBD ved hjelp av PBS-løsning ved hjelp av en prosedyre som ligner på OMV spycatcher-rensing. Plasmadesignskjemaet viser at spycatcher-genet er forbundet med cly A-genet via fleksibel linker mens spytag kobles til de fem primære terminalene til RBD-genet med et hys-taggen for rensing og verifisering. Etter ultracentrifugation forble nesten alle de ikke-reagerte RBD-spiontaggene i supernatanten.Den andre ultracentrifugeringen ga ikke en ytterligere betydelig fordel i forhold til første gang. Z-gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter på OMV-spycatcher var 133 nanometer mens den var 152,6 nanometer for OMV-RBD. Disse forskjellene kan skyldes at RBD øker OMV-partikkelstørrelsen etter intensiv visning.Resultatene av TEM er i samsvar med partikkelstørrelsesfordelingen oppnådd fra DLS-resultatene. Rotasjon for blanding av blandingen er svært viktig. Effektiviteten av reaksjonen kan være mye lavere uten rotasjon.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Skin tatovering som en ny tilnærming for DNA vaksine levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching Micropatterned Celler på en PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papirbaserte Enheter for isolering og karakterisering av Ekstracellulær Blemmer

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabrikasjon av en funksjon Magnetic Bakteriell Nanocellulose med jernoksid nanopartikler

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Målrettet plasmamembran Levering av en hydrofob Cargo innkapslet i en Liquid Crystal partikler Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tørr Film Photoresist-baserte elektrokjemisk Microfluidic Biosensor plattform: Enheten fabrikasjon, på prosessoren analysen forberedelser og systemdriften

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Elektrowetting-basert digital mikrofluidikkplattform for automatisert enzym-koblet immunosorbent analyse

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

En Lab-On-A-Chip-plattform for å stimulere osteocytter mechanotransduction og analysere funksjonelle resultater av beinremodellering

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering av en forenklet tredimensjonal hud-på-en-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...