Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e o Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 31670936, 82041045).

1. Construção do plasmídeo
<ol><li>Inserir a sequência SpyCatcher codificadora de DNA (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pThioHisA-ClyA resistente à ampicilina (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e Sal I para construir o plasmídeo pThioHisA ClyA-SC seguindo um relatóriopublicado anteriormente 20.</li>
	<li>Ligue o gene de fusão sintetizado SpyTag-RBD-Histag (Arquivo Suplementar 1) em um plasm...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

Para criar uma plataforma de vacina de nanopartículas "Plug-and-Display", a ClyA fundida por SC foi expressa em cepas BL21(DE3), que é um dos modelos mais utilizados para a produção de proteínas recombinantes devido às suas vantagens na expressão proteica24, de modo que haveria fragmento de SC suficiente exibido na superfície das OMVs durante o processo de proliferação de bactérias. Ao mesmo tempo, um antígeno-alvo fundido ST foi preparado para o acoplamento químico entre os antígeno...

Como potencial plataforma vacinal, as vesículas de membrana externa (OMVs) têm atraído cada vez mais atenção nos últimos anos 1,2. As OMVs, principalmente secretadas naturalmente por bactérias gram-negativas3, são partículas esféricas em nanoescala compostas por uma bicamada lipídica, geralmente no tamanho de 20-300 nm4. As OMVs contêm vários componentes bacterianos parentais, incluindo antígenos bacterianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), que servem como potencializadores imunológicos sólidos5. Beneficiando-se de seus componentes únicos, estrutura natural da vesícula e ótimos locais de modificação de engenharia genética, os OMVs foram desenvolvidos para uso em muitos campos biomédicos, incluindo vacinas bacterianas6, adjuvantes7, medicamentos de imunoterapia contra o câncer8, vetores de entrega de medicamentos9 e adesivos antibacterianos10.
A pandemia de SARS-CoV-2, que se espalhou por todo o mundo desde 2020, teve um pesado impacto na sociedade global. O domínio de ligação ao receptor (RBD) na proteína spike (proteína S) pode se ligar à enzima conversora de angiotensina humana 2 (ACE2), que então medeia a entrada do vírus na célula11,12,13. Assim, o RBD parece ser um alvo principal para a descoberta da vacina14,15,16. No entanto, o RBD monomérico é pouco imunogênico, e seu pequeno peso molecular dificulta o reconhecimento do sistema imunológico, de modo que os adjuvantes são frequentemente necessários17.
A fim de aumentar a imunogenicidade dos RBD, foram construídas OMVs exibindo RBDs polivalentes. Estudos existentes que utilizam a VMO para exibir a RBD geralmente fundem a RBD com a OMV para serem expressas em bactérias18. No entanto, o RBD é uma proteína derivada do vírus, e a expressão procariótica provavelmente afetará sua atividade. Para resolver esse problema, o sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, foi utilizado para formar um isopeptídeo covalente com OMV e RBD em um sistema tampão convencional19. O domínio SC foi expresso com Citolisina A (ClyA) como proteína de fusão por bioengenharia de Escherichia coli, e ST foi expresso com RBD através do sistema de expressão celular HEK293F. OMV-SC e RBD-ST foram misturadas e incubadas durante a noite. Após purificação por ultracentrifugação ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), OBTEVE-SE OMV-RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Nanopartículas biomiméticas obtidas de bactérias ou vírus têm atraído um interesse substancial na pesquisa e desenvolvimento de vacinas. As vesículas da membrana externa (OMVs) são secretadas principalmente por bactérias gram-negativas durante o crescimento médio, com um diâmetro nanométrico e atividade auto-adjuvante, o que pode ser ideal para a administração da vacina. Os OMVs têm funcionado como um sistema de entrega multifacetado para proteínas, ácidos nucleicos e pequenas moléculas. Para aproveitar ao máximo as características biológicas das OMVs, as OMVs derivadas de Escherichia coli de bioengenharia foram utilizadas como transportadoras e o domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 como antígeno para construir uma plataforma de vacina "Plug-and-Display". Os domínios SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) em Streptococcus pyogenes foram aplicados para conjugar OMVs e RBD. O gene da citolisina A (ClyA) foi traduzido com o gene SC como uma proteína de fusão após a transfecção do plasmídeo, deixando um sítio reativo na superfície das OMVs. Após a mistura do RBD-ST em um sistema tampão convencional durante a noite, formou-se ligação covalente entre as OMVs e o RBD. Assim, uma vacina OMV multivalente exibindo foi alcançada. Ao substituir por diversos antígenos, a plataforma de vacina OMVs pode exibir eficientemente uma variedade de antígenos heterogêneos, prevenindo assim potencialmente rapidamente epidemias de doenças infecciosas. Este protocolo descreve um método preciso para a construção da plataforma de vacina OMV, incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

O fluxograma desse protocolo é mostrado na Figura 1. Este protocolo poderia ser uma abordagem geral para a utilização de OMVs como uma plataforma de vacinas; basta escolher os sistemas de expressão apropriados com base no tipo de antígenos.
A Figura 2 fornece um esquema de projeto de plasmídeos viável. O gene SC está conectado com o gene ClyA através de um ligador flexível, enquanto ST se conecta ao terminal 5' do gene RBD c...

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A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

A nanociência pode efetivamente melhorar a resposta imune específica do antígeno após a exibição de antígenos na superfície da A principal vantagem nesta plataforma de vacina pode alcançar a placa de saída e a exibição. Em outras palavras, a plataforma é capaz de exibir a variedade de antígenos em Este método também pode ser aplicado a outras nanopartículas biológicas para exibir motor para portadores de tamanho nano. Para realizar a transformação do cateter espião de citolisina A, comece com a adição de cinco microlitros de solução plasmática a 50 microlitros de cepa competente BL 21.Sopre suavemente e deixe esfriar no gelo por 30 minutos. Coloque a solução por 90 segundos no banho-maria a 42 graus Celsius e, em seguida, coloque imediatamente a solução misturada no gelo por três minutos. Adicionar 500 microlitros de meio de luria bertani à suspensão bacteriana e após mistura cultura a 220 rotações por minuto a 37 graus Celsius durante uma hora.Em seguida, pratique toda a placa de ágar luria bertani de transformação contendo ampicilina e cultura durante a noite a 37 graus Celsius. Para a produção de espiões OMV, comece isolando uma única colônia da placa a 20 mililitros de meio luria bertani e cultura durante a noite a 220 rotações por minuto a 37 graus Celsius. Incubar a solução bacteriana em um meio de dois litros e cultivar a 220 rotações por minuto a 37 graus Celsius por cinco horas até que o estágio de crescimento logarítmico seja atingido.Adicionar o isopropil-beta D-IPTG para que a concentração final da solução bacteriana seja de 0,5 milimolar e, em seguida, cultivar durante a noite a 220 rotações por minuto a 25 graus Celsius. Em seguida, execute a purificação do espião OMV. Comece com centri fundindo a solução bacteriana.Filtre o sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 micrômetro e, em seguida, concentre-o usando uma coluna de fibra oca. Filtre o concentrado através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetros, depois funda-o a 150.000 vezes G a quatro graus Celsius por duas horas usando um fusível ultracentrista e descarte o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspeite a precipitação com PBS e armazene-a a menos 80 graus Celsius.Para realizar a transfecção de spytag RBD, comece com a seleção de um sistema de expressão eucariótica apropriado e cultive as células durante a noite a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius após a recuperação. Adicione 20 microlitros HEK 293F de solução celular no contador de células automatizado. Registre o número de células, ajuste a concentração para uma vez 10 para as seis células por mililitro.E então cultive as células a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius por quatro horas. Filtre o plasmídeo RBD spy tag através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetro e adicione 300 microgramas de plasmídeos no meio de cultura celular até que o volume final seja de 10 mililitros. Agite durante 10 segundos.Aqueça o PEI a 65 graus Celsius no banho de água. Misture 0,7 mililitros de PEI com 9,3 mililitros de meio de cultura celular e agite intermitentemente por 10 segundos. Adicionar solução plasmídica à solução PEI.Agite a mistura intermitentemente durante 10 segundos e incube-a a 37 graus Celsius durante 15 minutos. Adicione a mistura a 280 mililitros de meio de cultura celular e a cultura a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius durante cinco dias. Em seguida, execute a purificação do spytag RBD.Comece com a fusão centrírica das células a 6.000 vezes G a 25 graus Celsius por 20 minutos e use uma pipeta para coletar o sobrenadante. Encha a coluna com dois mililitros de níquel NTA agarose e lave-a três vezes com PBS. Adicione imidazol no sobrenadante celular para fazer a concentração final de 20 milimolares e carregue o sobrenadante celular.Adicionar três volumes de coluna de PBS contendo 20 milimolares de imidazol para lavagem e recolher a fracção de lavagem. Eluir gradiente com três volumes de coluna de PBS contendo concentrações baixas a altas de eluto de imidazol duas vezes para cada concentração. Para determinar a concentração de proteína pelo método BCA, diluir em série a solução padrão de proteína BSA de dois a 0,0625 miligramas por mililitro, diluir o espião OMV purificado e a etiqueta espiã RBD 10 vezes.Em seguida, misture as soluções de trabalho BCA A e B em uma proporção de 50 para um. Adicione a solução de proteína diluída e misture com a solução de trabalho de BCA. Incubar a 37 graus por 30 minutos.Meça a absorvância a 562 nanômetros de cada poço e calcule a concentração de proteína a partir da curva padrão. Para realizar a bioconjugação do espião OMV e da tag espiã RBD, misture o espião OMV e o espião RBD e PBS em uma proporção de 40 para um. Gire verticalmente para misturar a mistura durante a noite a 15 rotações por minuto a quatro graus Celsius.Realizar a purificação do RBD OMV usando a solução PBS usando um procedimento semelhante à purificação do espião OMV. O esquema de design do plasma mostra que o gene do espião está conectado com o gene cly A através de um ligador flexível, enquanto o espião se conecta aos cinco terminais primos do gene RBD com um gene hys tag para purificação e verificação. Após a ultracentrifugação, quase todos os espiões RBD não reagidos permaneceram no sobrenadante.A segunda ultracentrifugação não proporcionou uma vantagem mais significativa em relação à primeira vez. O diâmetro hidrodinâmico médio z do espião OMV foi de 133 nanômetros, enquanto foi de 152,6 nanômetros para OMV-RBD. Essas diferenças podem ser porque o RBD aumenta o tamanho da partícula OMV após a exibição intensiva.Os resultados do ETM são consistentes com a distribuição granulométrica obtida a partir dos resultados do DLS. A rotação para misturar a mistura é muito importante. A eficiência da reação pode ser muito menor sem rotação.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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