Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Эта работа была поддержана Ключевой программой Чунцинского фонда естественных наук (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) и проект Китайского национального фонда естественных наук (No 31670936, 82041045).

1. Плазмидная конструкция
<ol><li>Вставьте ДНК, кодирующую последовательность SpyCatcher (дополнительный файл 1), в плазмиду pThioHisA-ClyA, устойчивую к ампициллину (см. Таблицу материалов) между сайтами BamH I и Sal I для построения плазмиды pThioHisA ClyA-SC после ранее опубликов...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

Для создания платформы вакцины против наночастиц «Plug-and-Display» SC-сплавленный ClyA был экспрессирован в штаммах BL21(DE3), который является одной из наиболее широко используемых моделей для производства рекомбинантного белка из-за его преимуществ в экспрессии белка24, так что на по...

В качестве потенциальной платформы вакцины везикулы наружной мембраны (OMV) привлекают все больше и больше внимания в последние годы 1,2. OMV, в основном секретируемые естественным образом грамотрицательными бактериями3, представляют собой сферические наноразмерные частицы, состоящие из липидного бислоя, обычно размером 20-300 нм4. OMV содержат различные родительские бактериальные компоненты, включая бактериальные антигены и патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), которые служат твердыми иммунными потенциаторами5. Используя свои уникальные компоненты, естественную структуру пузырьков и отличные участки модификации генной инженерии, OMV были разработаны для использования во многих биомедицинских областях, включая бактериальные вакцины6, адъюванты7, препараты иммунотерапии рака8, векторы доставки лекарств9 и антибактериальные адгезивы10.
Пандемия SARS-CoV-2, которая распространилась по всему миру с 2020 года, нанесла тяжелый урон глобальному обществу. Рецептор-связывающий домен (RBD) в спайковом белке (S-белок) может связываться с человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2), который затем опосредует проникновение вируса в клетку 11,12,13. Таким образом, RBD, по-видимому, является основной целью для открытия вакцин 14,15,16. Однако мономерный RBD плохо иммуногенен, а его малая молекулярная масса затрудняет распознавание иммунной системой, поэтому часто требуются адъюванты17.
С целью повышения иммуногенности RBD были построены OMV, отображающие поливалентные RBD. Существующие исследования с использованием OMV для отображения RBD обычно сплавляют RBD с OMV для экспрессии в бактериях18. Тем не менее, RBD является белком, полученным из вируса, и прокариотическая экспрессия, вероятно, влияет на его активность. Чтобы решить эту проблему, система SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), полученная из Streptococcus pyogenes, была использована для формирования ковалентного изопептида с OMV и RBD в обычной буферной системе19. Домен SC экспрессировали с помощью цитолизина А (ClyA) в виде белка слияния биоинженерной кишечной палочкой, а ST экспрессировали RBD через систему клеточной экспрессии HEK293F. OMV-SC и RBD-ST смешивали и инкубировали в течение ночи. После очистки ультрацентрифугированием или размерно-эксклюзионной хроматографией (SEC) получали OMV-RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Биомиметические наночастицы, полученные из бактерий или вирусов, привлекли значительный интерес к исследованиям и разработкам вакцин. Наружные мембранные везикулы (OMV) в основном секретируются грамотрицательными бактериями во время среднего роста, с наноразмерным диаметром и самоадъювантной активностью, которая может быть идеальной для доставки вакцины. OMV функционируют как многогранная система доставки белков, нуклеиновых кислот и малых молекул. Чтобы в полной мере использовать биологические характеристики OMV, биоинженерные OMV, полученные из Escherichia coli, были использованы в качестве носителя, а SARS-CoV-2 рецептор-связывающий домен (RBD) в качестве антигена для создания платформы вакцины «Plug-and-Display». Домены SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) в Streptococcus pyogenes применялись для сопряжения OMV и RBD. Ген cytolysin A (ClyA) транслировался с геном SC в виде белка слияния после трансфекции плазмиды, оставляя реактивный сайт на поверхности OMV. После смешивания RBD-ST в обычной буферной системе в течение ночи между OMV и RBD образовалось ковалентное связывание. Таким образом, была получена мультивалентная вакцина OMV. Заменяя их различными антигенами, платформа вакцин OMV может эффективно отображать различные гетерогенные антигены, тем самым потенциально быстро предотвращая эпидемии инфекционных заболеваний. Этот протокол описывает точный метод построения платформы вакцины OMV, включая производство, очистку, биоконъюгацию и характеристику.

Блок-схема для этого протокола показана на рисунке 1. Этот протокол может быть общим подходом к использованию OMV в качестве платформы вакцин; нужно только выбрать соответствующие системы экспрессии на основе типа антигенов.
На рисунке 2 пр?...

Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Настоящий протокол описывает биоинженерию везикул наружной мембраны как платформу вакцины "Plug-and-Display", включая производство, очистку, биоконъюгацию и характеристику.

Платформа вакцины против наночастиц «Plug-And-Display» на основе везикул внешней мембраны, отображающих рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Нанонаука может эффективно усиливать антиген-специфический иммунный ответ после отображения антигенов на поверхности Основное преимущество в этой вакцинной платформе может достигать выхода бляшки и отображения. Другими словами, платформа способна отображать разнообразие антигенов, этот способ также может быть применен к другим биологическим наночастицам для отображения двигателя на наноразмерных носителях. Чтобы выполнить цитолизин шпионскую катетерную трансформацию, начните с добавления пяти микролитров плазменного раствора к 50 микролитрам компетентного штамма BL 21.Осторожно поддуть и дать остыть на льду в течение 30 минут. Поместите раствор на 90 секунд на водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия, а затем сразу же положите смешанный раствор на лед на три минуты. Добавьте 500 микролитров среды luria bertani в бактериальную суспензию и после смешивания культуры со скоростью 220 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.Далее накладывают всю трансформационную агаровую пластину Лурия Бертани, содержащую ампициллин, и культивируют на ночь при 37 градусах Цельсия. Для производства ловцов-шпионов OMV начните с выделения одной колонии от пластины до 20 миллилитров среды luria bertani и культивируйте в течение ночи со скоростью 220 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия. Инкубировать бактериальный раствор в двухлитровую среду и культивировать со скоростью 220 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение пяти часов до достижения стадии логарифмического роста.Добавьте изопропил бета D-IPTG, чтобы конечная концентрация бактериального раствора составила 0,5 миллимоляра, а затем культивируйте в течение ночи со скоростью 220 оборотов в минуту при 25 градусах Цельсия. Далее выполните omv spycatcher очистку. Начните с центрирования бактериального раствора.Отфильтруйте супернатант мембранным фильтром 0,22 микрометра, затем сконцентрируйте его с помощью столба из полого волокна. Отфильтруйте концентрат через мембранный фильтр 0,22 микрометра, затем центри сплавьте его в 150 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение двух часов с помощью ультрацентрового предохранителя и выбросьте супернатант с пипеткой. Повторно приостановите осадки с PBS и храните их при минус 80 градусах Цельсия.Чтобы выполнить трансфекцию RBD spytag, начните с выбора подходящей системы экспрессии эукариот и культивируйте клетки в течение ночи со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия после восстановления. Добавьте 20 микролитров HEK 293F клеточного раствора в автоматизированный счетчик ячеек. Запишите количество клеток, отрегулируйте концентрацию в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр.А затем культивируйте клетки со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение четырех часов. Фильтруйте плазмиду шпионской метки RBD через мембранный фильтр 0,22 микрометра и добавляйте 300 микрограммов плазмид в среду клеточной культуры до тех пор, пока конечный объем не составит 10 миллилитров. Встряхните в течение 10 секунд.Нагрейте PEI до 65 градусов Цельсия на водяной бане. Смешайте 0,7 миллилитра PEI с 9,3 миллилитрами клеточной питательной среды и периодически встряхивайте в течение 10 секунд. Добавьте плазмидный раствор в раствор PEI.Встряхните смесь с перерывами в течение 10 секунд и инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Добавьте смесь к 280 миллилитрам клеточной питательной среды и культивируйте со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение пяти дней. Далее выполните очистку RBD spytag.Начните с центрирования клеток в 6000 раз G при 25 градусах Цельсия в течение 20 минут и используйте пипетку для сбора супернатанта. Наполните колонку двумя миллилитрами агарозы никеля NTA и трижды промыть ее PBS. Добавьте имидазол в клеточный супернатант, чтобы получить конечную концентрацию 20 миллимоляров, и нагрузите супернатант клетки.Добавьте три колонки тома PBS, содержащие 20 миллимоларов имидазола для промывки, и соберите промывочную фракцию. Градиентное элюдирование с трехколоночными объемами PBS, содержащими низкие и высокие концентрации элюдазола, элют дважды для каждой концентрации. Для определения концентрации белка методом BCA последовательно разбавляют стандартный белковый раствор BSA от двух до 0,0625 миллиграмма на миллилитр, разводят очищенный ловец OMV и rbD spy tag 10 раз.Затем смешать рабочие растворы БЦА А и В в соотношении 50 к одному. Добавьте разбавленный белковый раствор и смешайте с рабочим раствором BCA. Инкубировать при 37 градусах в течение 30 минут.Измерьте поглощение на 562 нанометрах каждой лунки и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой. Чтобы выполнить биоконъюгацию omv spycatcher и RBD spy tag, смешайте OMV spycatcher и RBD spytag и PBS в соотношении 40 к одному. Вертикально вращайте, чтобы смешать смесь в течение ночи со скоростью 15 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия.Выполните очистку OMV RBD с использованием раствора PBS с использованием процедуры, аналогичной очистке OMV spycatcher. Схема проектирования плазмы показывает, что ген spycatcher связан с геном cly A через гибкий линкер, в то время как spytag соединяется с пятью основными терминалами гена RBD с геном hys tag для очистки и проверки. После ультрацентрифугирования почти весь нереагированный RBD-шпион остался в супернатанте.Вторая ультрацентрифугирование не обеспечила дальнейшего существенного преимущества по сравнению с первым разом. Средний гидродинамический диаметр ловца OMV составлял 133 нанометра, в то время как для OMV-RBD он составлял 152,6 нанометра. Эти различия могут быть связаны с тем, что RBD увеличивает размер частиц OMV после интенсивного отображения.Результаты ТЕА согласуются с распределением частиц по размерам, полученным из результатов DLS. Вращение для смешивания смеси очень важно. Эффективность реакции может быть значительно ниже без вращения.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Кожа Татуировка как новый подход для доставки ДНК-вакцин

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Изготовление функционализированного магнитной Бактериальный Nanocellulose с оксида железа наночастицами

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Сухой пленки фоторезиста на основе электрохимический биодатчик Microfluidic платформа: Изготовление устройств, на чипе Assay подготовка и работы системы

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Электроуттинг на основе цифровой микрофлюидной платформы для автоматизированного фермента связанных Иммуносорбент Ассей

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Платформа Lab-On-A-Chip для стимулирования остеоцитной механотрансдукции и анализа функциональных результатов ремоделирования костей

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Создание упрощенной трехмерной модели «кожа на чипе» на микрообрабатываемой микрофлюидной платформе

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...