Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) y el Proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31670936, 82041045).

1. Construcción de plásmidos
<ol><li>Inserte la secuencia SpyCatcher que codifica ADN (Archivo Suplementario 1) en un plásmido pThioHisA-ClyA resistente a la ampicilina (ver Tabla de materiales) entre los sitios BamH I y Sal I para construir el plásmido pThioHisA ClyA-SC siguiendo un informe previamente publicado20.</li>
	<li>Ligate el gen de fusión SpyTag-RBD-Histag sintetizado (Archivo Suplementario 1) en un plá...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

Para crear una plataforma de vacuna de nanopartículas "Plug-and-Display", ClyA fusionado con SC se expresó en cepas BL21 (DE3), que es uno de los modelos más utilizados para la producción de proteínas recombinantes debido a sus ventajas en la expresión de proteínas24, de modo que habría suficiente fragmento SC en la superficie de los OMV durante el proceso de proliferación de bacterias. Al mismo tiempo, se preparó un antígeno diana fusionado con ST para el acoplamiento químico entre lo...

Como plataforma potencial de vacunación, las vesículas de membrana externa (OMV) han atraído cada vez más atención en los últimos años 1,2. Los OMV, secretados principalmente naturalmente por bacterias gramnegativas3, son partículas esféricas a nanoescala compuestas por una bicapa lipídica, generalmente en el tamaño de 20-300 nm4. Los OMV contienen varios componentes bacterianos parentales, incluidos antígenos bacterianos y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), que sirven como potenciadores inmunes sólidos5. Beneficiándose de sus componentes únicos, estructura natural de vesículas y excelentes sitios de modificación de ingeniería genética, los OMV se han desarrollado para su uso en muchos campos biomédicos, incluidas las vacunas bacterianas6, los adyuvantes7, los medicamentos de inmunoterapia contra el cáncer8, los vectores de administración de medicamentos9 y los adhesivos antibacterianos10.
La pandemia de SARS-CoV-2, que se ha extendido por todo el mundo desde 2020, ha tenido un alto costo en la sociedad mundial. El dominio de unión al receptor (RBD) en la proteína espiga (proteína S) puede unirse con la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2), que luego media la entrada del virus en la célula11,12,13. Por lo tanto, RBD parece ser un objetivo principal para el descubrimiento de vacunas14,15,16. Sin embargo, el RBD monomérico es poco inmunogénico, y su pequeño peso molecular dificulta el reconocimiento del sistema inmunitario, por lo que a menudo se requieren adyuvantes17.
Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de RBD, se construyeron OMV que mostraban RBD polivalentes. Los estudios existentes que utilizan OMV para mostrar RBD generalmente fusionan RBD con OMV para ser expresado en bacterias18. Sin embargo, RBD es una proteína derivada del virus, y es probable que la expresión procariota afecte su actividad. Para resolver este problema, se utilizó el sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, para formar un isopéptido covalente con OMV y RBD en un sistema tampón convencional19. El dominio SC se expresó con citolisina A (ClyA) como una proteína de fusión por Escherichia coli de bioingeniería, y ST se expresó con RBD a través del sistema de expresión celular HEK293F. OMV-SC y RBD-ST se mezclaron e incubaron durante la noche. Después de la purificación por ultracentrifugación o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), SE OBTUVO OMV-RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Las nanopartículas biomiméticas obtenidas de bacterias o virus han atraído un interés sustancial en la investigación y el desarrollo de vacunas. Las vesículas de membrana externa (OMV) son secretadas principalmente por bacterias gramnegativas durante el crecimiento promedio, con un diámetro de tamaño nanométrico y actividad autoadyuvante, que puede ser ideal para la administración de vacunas. Los OMV han funcionado como un sistema de administración multifacético de proteínas, ácidos nucleicos y moléculas pequeñas. Para aprovechar al máximo las características biológicas de los OMV, se utilizaron OMV derivados de Escherichia coli de bioingeniería como portador y el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 como antígeno para construir una plataforma de vacuna "Plug-and-Display". Los dominios SpyCatcher (SC) y SpyTag (ST) en Streptococcus pyogenes se aplicaron para conjugar OMV y RBD. El gen de la citolisina A (ClyA) se tradujo con el gen SC como una proteína de fusión después de la transfección de plásmidos, dejando un sitio reactivo en la superficie de los OMV. Después de mezclar RBD-ST en un sistema tampón convencional durante la noche, se formó una unión covalente entre los OMV y RBD. Por lo tanto, se logró una vacuna OMV de visualización multivalente. Al reemplazarla con diversos antígenos, la plataforma de vacunas OMV puede mostrar de manera eficiente una variedad de antígenos heterogéneos, lo que podría prevenir rápidamente las epidemias de enfermedades infecciosas. Este protocolo describe un método preciso para construir la plataforma de vacunas OMV, incluida la producción, purificación, bioconjugación y caracterización.

El diagrama de flujo para este protocolo se muestra en la Figura 1. Este protocolo podría ser un enfoque general para utilizar OMV como plataforma de vacunación; Solo hay que elegir los sistemas de expresión adecuados en función del tipo de antígenos.
La Figura 2 proporciona un esquema de diseño de plásmidos factible. El gen SC está conectado con el gen ClyA a través de un enlazador flexible, mientras que ST se conecta al ter...

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A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

El presente protocolo describe la bioingeniería de vesículas de membrana externa como una plataforma de vacunas "Plug-and-Display", que incluye producción, purificación, bioconjugación y caracterización.

Una plataforma de vacuna de nanopartículas "plug-and-display" basada en vesículas de membrana externa que muestran el dominio de unión al receptor SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

La nanociencia puede mejorar eficazmente la respuesta inmune específica del antígeno después de mostrar antígenos en la superficie de La principal ventaja en esta plataforma de vacuna puede lograr la salida de la placa y la visualización. En otras palabras, la plataforma es capaz de mostrar la variedad de antígenos en Este método también se puede aplicar a otras nanopartículas biológicas para mostrar el motor a portadores de tamaño nanométrico. Para realizar la transformación del catéter espía de citolisina A, comience con la adición de cinco microlitros de solución plasmática a 50 microlitros de cepa competente BL 21.Sople suavemente y deje enfriar en hielo durante 30 minutos. Coloque la solución durante 90 segundos en el baño de agua a 42 grados centígrados, y luego coloque inmediatamente la solución mezclada en hielo durante tres minutos. Añadir 500 microlitros de luria bertani medio a la suspensión bacteriana y después de mezclar el cultivo a 220 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante una hora.A continuación, coloque toda la placa de agar transformación luria bertani que contiene ampicilina y cultive durante la noche a 37 grados centígrados. Para la producción de spcatcher OMV, comience aislando una sola colonia de la placa a 20 mililitros de medio luria bertani y cultive durante la noche a 220 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados. Incubar la solución bacteriana en un medio de dos litros y cultivar a 220 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante cinco horas hasta que se alcance la etapa de crecimiento logarítmico.Agregue isopropil beta D-IPTG para que la concentración final de la solución bacteriana sea de 0.5 milimolar y luego cultive durante la noche a 220 rotaciones por minuto a 25 grados Celsius. A continuación, realice la purificación del cazador de espías OMV. Comience con centri fusionando la solución bacteriana.Filtre el sobrenadante con un filtro de membrana de 0,22 micrómetros, luego concéntrelo usando una columna de fibra hueca. Filtrar el concentrado a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros, luego centri fusionarlo a 150, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante dos horas usando un fusible ultra centri y desechar el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender la precipitación con PBS y guárdela a menos 80 grados centígrados.Para realizar la transfección de spytag RBD, comience con la selección de un sistema de expresión eucariota apropiado y cultive las células durante la noche a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados después de la recuperación. Agregue 20 microlitros HEK 293F de solución celular en el contador celular automatizado. Registre el número de células, ajuste la concentración a una vez 10 a seis células por mililitro.Y luego cultivar las células a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Filtre el plásmido de etiqueta espía RBD a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros y agregue 300 microgramos de plásmidos en el medio de cultivo celular hasta que el volumen final sea de 10 mililitros. Agitar durante 10 segundos.Caliente PEI a 65 grados centígrados en el baño de agua. Mezcle 0.7 mililitros de PEI con 9.3 mililitros de medio de cultivo celular y agite intermitentemente durante 10 segundos. Agregue una solución plásmida a la solución PEI.Agite la mezcla intermitentemente durante 10 segundos e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue la mezcla a 280 mililitros de medio de cultivo celular y cultive a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante cinco días. A continuación, realice la purificación de spytag RBD.Comience con centri fusionando las células a 6, 000 veces G a 25 grados Celsius durante 20 minutos, y use una pipeta para recoger el sobrenadante. Llene la columna con dos mililitros de agarosa NTA de níquel y lávela tres veces con PBS. Agregue imidazol en el sobrenadante celular para hacer la concentración final de 20 milimolar, y cargue el sobrenadante celular.Agregue tres volúmenes de columna de PBS que contengan 20 milimolares de imidazol para lavar y recoja la fracción de lavado. Eluyente de gradiente con tres volúmenes de columna de PBS que contienen concentraciones bajas a altas de eluido de imidazol dos veces por cada concentración. Para determinar la concentración de proteína por el método BCA, diluya en serie la solución estándar de proteína BSA de dos a 0.0625 miligramos por mililitro, diluya el spy catcher OMV purificado y la etiqueta espía RBD 10 veces.Luego mezcle las soluciones de trabajo BCA A y B en una proporción de 50 a uno. Agregue la solución de proteína diluida y mezcle con la solución de trabajo de BCA. Incubar a 37 grados durante 30 minutos.Mida la absorbancia a 562 nanómetros de cada pocillo y calcule la concentración de proteína a partir de la curva estándar. Para realizar la bioconjugación de OMV spycatcher y RBD spy tag, mezcle OMV spycatcher y RBD spytag y PBS en una proporción de 40 a uno. Gire verticalmente para mezclar la mezcla durante la noche a 15 rotaciones por minuto a cuatro grados centígrados.Realice la purificación de OMV RBD utilizando la solución PBS utilizando un procedimiento similar a la purificación del cazador de espías OMV. El esquema de diseño de plasma muestra que el gen spycatcher está conectado con el gen cly A a través de un enlazador flexible, mientras que el spytag se conecta a los cinco terminales principales del gen RBD con un gen hys tag para purificación y verificación. Después de la ultracentrifugación, casi todo el spytag RBD sin reaccionar permaneció en el sobrenadante.La segunda ultracentrifugación no proporcionó una ventaja significativa adicional sobre la primera vez. El diámetro hidrodinámico promedio z del cazador de espías OMV fue de 133 nanómetros, mientras que fue de 152.6 nanómetros para OMV-RBD. Estas diferencias pueden deberse a que RBD aumenta el tamaño de partícula OMV después de una visualización intensiva.Los resultados de TEM son consistentes con la distribución del tamaño de partícula obtenida de los resultados de DLS. La rotación para mezclar la mezcla es muy importante. La eficiencia de la reacción puede ser mucho menor sin rotación.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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