Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Detta arbete stöddes av nyckelprogrammet för Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) och Chinese National Natural Science Foundation Project (nr 31670936, 82041045).

1. Plasmid konstruktion
<ol><li>Sätt in DNA-kodande SpyCatcher-sekvens (tilläggsfil 1) i en ampicillinresistent pThioHisA-ClyA-plasmid (se materialförteckning) mellan BamH I- och Sal I-platserna för att konstruera plasmiden pThioHisA ClyA-SC efter en tidigare publicerad rapport20.</li>
	<li>Ligate den syntetiserade SpyTag-RBD-Histag-fusionsgenen (Supplementary File 1) till en pcDNA3.1-plasmid (se materialtab...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

För att skapa en "Plug-and-Display" nanopartikelvaccinplattform uttrycktes SC-smält ClyA i BL21 (DE3) stammar, som är en av de mest använda modellerna för rekombinant proteinproduktion på grund av dess fördelar i proteinuttryck24, så att det skulle finnas tillräckligt med SC-fragment som visas på ytan av OMV: erna under processen med bakteriespridning. Samtidigt framställdes ett ST-smält målantigen för den kemiska kopplingen mellan antigenerna och OMV. Fördelarna med detta experimen...

Som en potentiell vaccinplattform har yttre membranblåsor (OMV) väckt mer och mer uppmärksamhet de senaste åren 1,2. OMV, som huvudsakligen utsöndras naturligt av gramnegativa bakterier3, är sfäriska partiklar i nanoskala som består av ett lipid-dubbelskikt, vanligtvis i storleken 20-300 nm4. OMV innehåller olika bakteriella komponenter från föräldrar, inklusive bakteriella antigener och patogenassocierade molekylära mönster (PAMP), som fungerar som fasta immunpotentiatorer5. Genom att dra nytta av deras unika komponenter, naturliga vesikelstruktur och fantastiska gentekniska modifieringsställen har OMV utvecklats för användning inom många biomedicinska områden, inklusive bakterievacciner6, adjuvanser7, cancerimmunterapiläkemedel8, läkemedelsleveransvektorer9 och antibakteriella lim10.
SARS-CoV-2-pandemin, som har spridit sig över hela världen sedan 2020, har tagit hårt på det globala samhället. Den receptorbindande domänen (RBD) i spikprotein (S-protein) kan binda med humant angiotensinkonverterande enzym 2 (ACE2), som sedan förmedlar virusets inträde i cellen11,12,13. Således verkar RBD vara ett främsta mål för vaccinupptäckt14,15,16. Monomer RBD är dock dåligt immunogen, och dess lilla molekylvikt gör det svårt för immunsystemet att känna igen, så adjuvanser krävs ofta17.
För att öka immunogeniciteten hos RBD konstruerades OMV som visade polyvalenta RBD: er. Befintliga studier som använder OMV för att visa RBD förenar vanligtvis RBD med OMV för att uttryckas i bakterier18. RBD är emellertid ett virus-härledd protein, och prokaryot uttryck kommer sannolikt att påverka dess aktivitet. För att lösa detta problem användes SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) -systemet, härrörande från Streptococcus pyogenes, för att bilda en kovalent isopeptid med OMV och RBD i ett konventionellt buffertsystem19. SC-domänen uttrycktes med Cytolysin A (ClyA) som ett fusionsprotein av bioengineered Escherichia coli, och ST uttrycktes med RBD via HEK293F cellulärt uttryckssystem. OMV-SC och RBD-ST blandades och inkuberades över natten. Efter rening genom ultracentrifugering eller storleksuteslutningskromatografi (SEC) ERHÖLLS OMV-RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Biomimetiska nanopartiklar från bakterier eller virus har väckt stort intresse för forskning och utveckling av vaccin. Yttre membranblåsor (OMV) utsöndras huvudsakligen av gramnegativa bakterier under genomsnittlig tillväxt, med en diameter i nanostorlek och självadjuvansaktivitet, vilket kan vara idealiskt för vaccinleverans. OMV har fungerat som ett mångfacetterat leveranssystem för proteiner, nukleinsyror och små molekyler. För att dra full nytta av de biologiska egenskaperna hos OMV användes biotekniska Escherichia coli-härledda OMV som bärare och SARS-CoV-2-receptorbindande domän (RBD) som ett antigen för att konstruera en "Plug-and-Display" -vaccinplattform. Domänerna SpyCatcher (SC) och SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes användes för att konjugera OMV och RBD. Cytolysin A (ClyA) -genen översattes med SC-genen som ett fusionsprotein efter plasmidtransfektion och lämnade ett reaktivt ställe på ytan av OMV: erna. Efter blandning av RBD-ST i ett konventionellt buffertsystem över natten bildades kovalent bindning mellan OMV och RBD. Således uppnåddes ett multivalent visande OMV-vaccin. Genom att ersätta med olika antigener kan OMV-vaccinplattformen effektivt visa en mängd heterogena antigener och därigenom potentiellt snabbt förhindra infektionssjukdomsepidemier. Detta protokoll beskriver en exakt metod för att konstruera OMV-vaccinplattformen, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.

Flödesschemat för detta protokoll visas i figur 1. Detta protokoll kan vara ett allmänt tillvägagångssätt för att använda OMV som en vaccinplattform; man behöver bara välja lämpliga uttryckssystem baserat på typen av antigener.
Figur 2 ger ett genomförbart plasmiddesignschema. SC-genen är kopplad till ClyA-genen via en flexibel länkare, medan ST ansluter till 5'-terminalen i RBD-genen med en His-tag-gen för rening och ...

Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Detta protokoll beskriver biotekniken av yttre membranblåsor som en "Plug-and-Display" -vaccinplattform, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.

En "plug-and-display" nanopartikelvaccinplattform baserad på yttre membranblåsor som visar SARS-CoV-2-receptorbindande domän

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanovetenskap kan effektivt förbättra det antigenspecifika immunsvaret efter att ha visat antigener på ytan av Den största fördelen med denna vaccinplattform kan uppnå gå av plack och display. Med andra ord kan plattformen visa olika antigener i Denna metod kan också tillämpas på andra biologiska nanopartiklar för att visa motor till bärare i nanostorlek. För att utföra cytolysin En spionkatetertransformation, börja med att tillsätta fem mikroliter plasmalösning till 50 mikroliter BL 21 kompetent stam.Blås försiktigt och låt svalna på is i 30 minuter. Placera lösningen i 90 sekunder i vattenbadet vid 42 grader Celsius och lägg sedan omedelbart den blandade lösningen på is i tre minuter. Tillsätt 500 mikroliter luria bertani-medium till bakteriesuspensionen och efter blandning av kultur vid 220 varv per minut vid 37 grader Celsius i en timme.Därefter plåta all transformationsluria bertani agarplatta innehållande ampicillin och kultur över natten vid 37 grader Celsius. För OMV-spionfångarproduktion, börja med att isolera en enda koloni från plattan till 20 ml luria bertani-medium och kultur över natten vid 220 rotationer per minut vid 37 grader Celsius. Inkubera bakterielösningen i ett tvålitersmedium och odla vid 220 rotationer per minut vid 37 grader Celsius i fem timmar tills det logaritmiska tillväxtsteget uppnås.Tillsätt isopropyl beta D-IPTG för att göra den slutliga koncentrationen av bakterielösningen till 0,5 millimolar och odla sedan över natten vid 220 rotationer per minut vid 25 grader Celsius. Utför sedan OMV spycatcher rening. Börja med att centrera bakterielösningen.Filtrera supernatanten med ett 0,22 mikrometer membranfilter och koncentrera det sedan med en ihålig fiberkolonn. Filtrera koncentratet genom ett 0,22 mikrometer membranfilter, sedan centrera det vid 150 000 gånger G vid fyra grader Celsius i två timmar med en ultracentrisäkring och kassera supernatanten med en pipett. Återupptäck nederbörden med PBS och förvara den vid minus 80 grader Celsius.För att utföra RBD-spytag-transfektion, börja med att välja ett lämpligt eukaryot uttryckssystem och odla cellerna över natten med 130 rotationer per minut vid 37 grader Celsius efter återhämtning. Tillsätt 20 mikroliter HEK 293F celllösning i den automatiserade cellräknaren. Spela in antalet celler, justera koncentrationen till en gånger 10 till de sex cellerna per milliliter.Och odla sedan cellerna vid 130 rotationer per minut vid 37 grader Celsius i fyra timmar. Filtrera RBD-spiontaggplasmid genom ett 0,22 mikrometer membranfilter och tillsätt 300 mikrogram plasmider i cellodlingsmediet tills den slutliga volymen är 10 ml. Skaka i 10 sekunder.Värm PEI till 65 grader Celsius i vattenbadet. Blanda 0,7 ml PEI med 9,3 ml cellodlingsmedium och skaka intermittent i 10 sekunder. Tillsätt plasmidlösning till PEI-lösningen.Skaka blandningen intermittent i 10 sekunder och inkubera den vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Tillsätt blandningen till 280 ml cellodlingsmedium och odling vid 130 rotationer per minut vid 37 grader Celsius i fem dagar. Utför sedan RBD spytag-rening.Börja med att centri smälter cellerna vid 6 000 gånger G vid 25 grader Celsius i 20 minuter och använd en pipett för att samla supernatanten. Fyll kolonnen med två milliliter nickel NTA-agaros och tvätta den tre gånger med PBS. Tillsätt imidaol i cellsupernatanten för att göra den slutliga koncentrationen på 20 millimolar och ladda cellsupernatanten.Tillsätt tre kolonnvolymer PBS innehållande 20 millimolar imidazol för tvätt och samla tvättfraktionen. Gradientelut med tre kolonnvolymer PBS innehållande låga till höga koncentrationer av imidazol eluerar två gånger för varje koncentration. För att bestämma proteinkoncentrationen med BCA-metoden, späd den vanliga BSA-proteinlösningen seriellt från två till 0,0625 milligram per milliliter, späd den renade OMV-spyfångaren och RBD-spiontaggen 10 gånger.Blanda sedan BCA-arbetslösningar A och B i ett förhållande av 50 till en. Tillsätt utspädd proteinlösning och blanda med BCA-arbetslösning. Inkubera vid 37 grader i 30 minuter.Mät absorbansen vid 562 nanometer av varje brunn och beräkna proteinkoncentrationen från standardkurvan. För att utföra biokonjugering av OMV spycatcher och RBD spy tag, blanda OMV spycatcher och RBD spytag och PBS i ett förhållande 40 till ett. Rotera vertikalt för att blanda blandningen över natten vid 15 varv per minut vid fyra grader Celsius.Utför rening av OMV RBD med PBS-lösning med ett förfarande som liknar OMV spycatcher-rening. Plasmadesignschemat visar att spycatcher-genen är kopplad till cly A-genen via flexibel linker medan spytag ansluter till den fem primära terminalen i RBD-genen med en hys-tagggen för rening och verifiering. Efter ultracentrifugering förblev nästan alla oreagerade RBD-spytag i supernatanten.Den andra ultracentrifugeringen gav inte en ytterligare signifikant fördel under första gången. Den z genomsnittliga hydrodynamiska diametern för OMV-spionfångare var 133 nanometer medan den var 152,6 nanometer för OMV-RBD. Dessa skillnader kan bero på att RBD ökar OMV-partikelstorleken efter intensiv visning.Resultaten av TEM överensstämmer med partikelstorleksfördelningen som erhållits från DLS-resultaten. Rotation för blandning av blandningen är mycket viktig. Reaktionseffektiviteten kan vara mycket lägre utan rotation.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatueringar som ett nytt sätt för DNA-vaccin Leverans

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching Micropatterned Celler på en PDMS membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Pappersbaserade enheter för Isolering och karakterisering av extracellulär Blåsor

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Tillverkning av en funktionaliserad Magnetic bakteriell Nanocellulosa med järnoxid nanopartiklar

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Riktade Plasma Membrane Leverans av en hydrofob Cargo inkapslad i en Liquid Crystal nanopartiklar Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Elektrowetting-baserad digital mikrofluidik plattform för automatiserad enzym-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

En Lab-On-A-Chip plattform för att stimulera osteocyte Mechanotransduktion och analysera funktionella resultat av ben remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering av en förenklad tredimensionell hud-på-ett-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...