Name: a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı'nın Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir (Hayır. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 31670936, 82041045).

1. Plazmid yapımı
<ol><li>Daha önce yayınlanan bir rapor20'yi takiben plazmid pThioHisA ClyA-SC'yi oluşturmak için BamH I ve Sal I bölgeleri arasındaki ampisilin dirençli bir pThioHisA-ClyA plazmidine DNA kodlama SpyCatcher dizisini (Ek Dosya 1) yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Sentezlenmiş SpyTag-RBD-Histag füzyon genini (Ek Dosya 1), daha önce yayınlanmış bir rapor...

<ol>
	<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications:+An+update.">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li><li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+vaccines.">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).</li><li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles.">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li><li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles:+From+discovery+to+applications.">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li><li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li><li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines.">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).</li><li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery.">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li><li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines:+A+new+toolkit+for+cancer+therapy.">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314 (2019).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li><li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy.">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals.">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li><li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+Biology,+and+Structure-Based+Therapeutics+Development.">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+(ZF2001)+against+COVID-19+in+adults:+Two+randomised,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+1+and+2+trials.">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants.">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD,+RBD,+and+S2.">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li><li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques.">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).</li><li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2.">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+(RBD)+and+heptad+repeat+(HR)+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses.">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2.">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li><li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimer-PAGE:+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples.">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).</li><li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum.">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli:+Design,+production+and+purification.">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21(DE3).">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li><li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach.">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li><li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization.">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues.">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li><li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses.">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li><li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles.">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).</li><li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin.">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li><li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform.">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production.">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge.">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776 (2016).</li><li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development.">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).</li><li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity.">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).</li></ol>

Bir "Tak ve Görüntüle" nanopartikül aşı platformu oluşturmak için, SC-kaynaşmış ClyA, protein ekspresyonu24'teki avantajları nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan modellerden biri olan BL21 (DE3) suşlarında ifade edildi, böylece bakteri çoğalması işlemi sırasında OMV'lerin yüzeyinde yeterli SC fragmanı gösterilecekti. Aynı zamanda, antijenler ve OMV'ler arasındaki kimyasal eşleşme için ST-kaynaşmış bir hedef antijen hazırlandı. Bu den...

Potansiyel bir aşı platformu olarak, dış zar vezikülleri (OMV'ler) son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir 1,2. Esas olarak gram-negatif bakteri3 tarafından doğal olarak salgılanan OMV'ler, genellikle 20-300 nm4 boyutunda bir lipit çift katmanından oluşan küresel nano ölçekli parçacıklardır. OMV'ler, katı immün güçlendiriciler olarak hizmet veren bakteriyel antijenler ve patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP'ler) dahil olmak üzere çeşitli ebeveyn bakteriyel bileşenleri içerir5. Eşsiz bileşenlerinden, doğal vezikül yapısından ve büyük genetik mühendisliği modifikasyon alanlarından yararlanan OMV'ler, bakteriyel aşılar6, adjuvanlar7, kanser immünoterapi ilaçları8, ilaç dağıtım vektörleri9 ve anti-bakteriyel yapıştırıcılar10 dahil olmak üzere birçok biyomedikal alanda kullanılmak üzere geliştirilmiştir.
2020'den bu yana dünya çapında yayılan SARS-CoV-2 salgını, küresel topluma ağır bir zarar verdi. Spike proteinindeki (S proteini) reseptör bağlayıcı alan (RBD), insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) ile bağlanabilir ve bu da virüsünhücre 11,12,13'e girmesine aracılık eder. Bu nedenle, RBD aşı keşfi için birincil hedef gibi görünmektedir14,15,16. Bununla birlikte, monomerik RBD zayıf immünojeniktir ve küçük moleküler ağırlığı bağışıklık sisteminin tanımasını zorlaştırır, bu nedenle adjuvanlara sıklıkla ihtiyaç duyulur17.
RBD'nin immünojenisitesini arttırmak için çok değerli RBD'ler gösteren OMV'ler inşa edildi. RBD'yi görüntülemek için OMV kullanan mevcut çalışmalar genellikle RBD'yi bakteri18'de ifade edilmek üzere OMV ile kaynaştırır. Bununla birlikte, RBD virüs kaynaklı bir proteindir ve prokaryotik ekspresyonun aktivitesini etkilemesi muhtemeldir. Bu sorunu çözmek için, Streptococcus pyogenes'ten türetilen SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) sistemi, geleneksel bir tampon sisteminde OMV ve RBD ile kovalent bir izopeptit oluşturmak için kullanıldı19. SC alanı, biyomühendislik ürünü Escherichia coli tarafından bir füzyon proteini olarak Cytolysin A (ClyA) ile eksprese edildi ve ST, HEK293F hücresel ekspresyon sistemi aracılığıyla RBD ile eksprese edildi. OMV-SC ve RBD-ST gece boyunca karıştırıldı ve inkübe edildi. Ultrasantrifüjleme veya boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırmadan sonra OPV-RBD elde edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification Kit</td>
			<td>cwbio</td>
			<td>cw0014s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touching Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Cavoy</td>
			<td>Power BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>C520009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat pAb to mouse IgG1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed freezing centrifuge</td>
			<td>Bioridge</td>
			<td>H2500R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag mouse mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2366s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>70691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powdered milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-293 cell culture medium</td>
			<td>Opm biosciences</td>
			<td>81075-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine Linear</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pThioHisA ClyA-SC plasmid</td>
			<td>Wuhan genecreat biological techenology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Western Blotting Membranes</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Hula Mixer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610961</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "plug-and-display" nanoparticle vaccine platform based on outer membrane vesicles displaying sars-cov-2 receptor-binding domain

Bakteri veya virüslerden elde edilen biyomimetik nanopartiküller, aşı araştırma ve geliştirmede büyük ilgi görmüştür. Dış zar vezikülleri (OMV'ler) esas olarak ortalama büyüme sırasında gram-negatif bakteriler tarafından salgılanır, nano boyutlu bir çap ve kendi kendine adjuvan aktivite ile aşı dağıtımı için ideal olabilir. OMV'ler proteinler, nükleik asitler ve küçük moleküller için çok yönlü bir dağıtım sistemi olarak işlev görmüştür. OMV'lerin biyolojik özelliklerinden tam olarak yararlanmak için, biyomühendislik ürünü Escherichia coli türevi OMV'ler bir taşıyıcı olarak ve SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanı (RBD) bir "Tak ve Görüntüle" aşı platformu oluşturmak için bir antijen olarak kullanılmıştır. Streptococcus pyogenes'teki SpyCatcher (SC) ve SpyTag (ST) alanları, OMV'leri ve RBD'yi konjuge etmek için uygulandı. Sitolisin A (ClyA) geni, plazmid transfeksiyonundan sonra SC geni ile bir füzyon proteini olarak çevrildi ve OMV'lerin yüzeyinde reaktif bir bölge bıraktı. RBD-ST'yi gece boyunca geleneksel bir tampon sisteminde karıştırdıktan sonra, OMV'ler ve RBD arasında kovalent bağlanma oluştu. Böylece çok değerli gösteren bir OMV aşısı elde edildi. OMV'lerin aşı platformu, çeşitli antijenlerle değiştirilerek, çeşitli heterojenleri verimli bir şekilde görüntüleyebilir ve böylece bulaşıcı hastalık salgınlarını potansiyel olarak hızlı bir şekilde önleyebilir. Bu protokol, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere OMV aşı platformunu oluşturmak için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Bu protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, OMV'leri bir aşı platformu olarak kullanmaya yönelik genel bir yaklaşım olabilir; sadece antijenlerin tipine göre uygun ekspresyon sistemlerini seçmek gerekir.
Şekil 2, uygulanabilir bir plazmid tasarım şeması sağlar. SC geni, esnek bir bağlayıcı aracılığıyla ClyA genine bağlanırken, ST, saflaştırma ve doğrulama için RBD geninin 5' termi...

Watch this Scientific Journal Video about A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain at JoVE.com

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanobilim, antijenleri yüzeyinde gösterdikten sonra antijene özgü bağışıklık tepkisini etkili bir şekilde artırabilir Bu aşı platformundaki ana avantaj, plak ve gösterimden çıkmayı başarabilir. Başka bir deyişle, platform antijenlerin çeşitliliğini görüntüleyebilir Bu yöntem, motoru nano boyutlu taşıyıcılara göstermek için diğer biyolojik nanopartiküllere de uygulanabilir. Sitolisin A casus kateter transformasyonunu gerçekleştirmek için, 50 mikrolitre BL 21 yetkin suşuna beş mikrolitre plazma çözeltisi ekleyerek başlayın.Yavaşça üfleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın. Çözeltiyi 90 saniye boyunca su banyosuna 42 santigrat derecede yerleştirin ve ardından karıştırılmış çözeltiyi hemen üç dakika boyunca buz üzerine koyun. Bakteriyel süspansiyona 500 mikrolitre luria bertani besiyeri ekleyin ve kültürü karıştırdıktan sonra bir saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda karıştırın.Daha sonra, ampisilin ve kültür içeren tüm dönüşüm luria bertani agar plakasını 37 santigrat derecede bir gecede plakalayın. OMV casus yakalayıcı üretimi için, tek bir koloninin plakadan 20 mililitre luria bertani ortamına ve kültürüne 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda gece boyunca izole edilmesiyle başlayın. Bakteriyel çözeltiyi iki litrelik bir ortama ve logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar beş saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda kültüre inkübe edin.Bakteriyel çözeltinin son konsantrasyonunu 0.5 milimolar yapmak için izopropil beta D-IPTG ekleyin ve daha sonra 25 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda gece boyunca kültürleyin. Ardından, OMV casus avcısı saflaştırması gerçekleştirin. Bakteriyel çözeltiyi kaynaştıran centri ile başlayın.Süpernatantı 0,22 mikrometrelik bir membran filtreyle filtreleyin, ardından içi boş bir fiber sütun kullanarak konsantre edin. Konsantreyi 0,22 mikrometrelik bir membran filtreden süzün, ardından ultra centri sigorta kullanarak iki saat boyunca dört santigrat derecede 150.000 kez G'de kaynaştırın ve süpernatantı bir pipetle atın. Yağışı PBS ile tekrar askıya alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.RBD casus transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi seçerek başlayın ve hücreleri iyileşmeden sonra 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda bir gecede kültürleyin. Otomatik hücre sayacına 20 mikrolitre HEK 293F hücre çözeltisi ekleyin. Hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu mililitre başına altı hücreye bir kez 10 olarak ayarlayın.Ve sonra hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda kültürleyin. RBD casus etiketi plazmidini 0.22 mikrometrelik bir membran filtreden filtreleyin ve son hacim 10 mililitre olana kadar hücre kültürü ortamına 300 mikrogram plazmid ekleyin. 10 saniye çalkalayın.PEI'yi su banyosunda 65 santigrat dereceye ısıtın. 0.7 mililitre PEI'yi 9.3 mililitre hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 saniye boyunca aralıklı olarak çalkalayın. PEI çözeltisine plazmid çözeltisi ekleyin.Karışımı aralıklı olarak 10 saniye çalkalayın ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Karışımı 280 mililitre hücre kültürü ortamına ekleyin ve beş gün boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda kültürleyin. Ardından, RBD casus etiketi saflaştırma işlemini gerçekleştirin.Hücreleri 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede 6.000 kez G'de kaynaştırarak merkezle başlayın ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın. Kolonu iki mililitre nikel NTA agarozu ile doldurun ve PBS ile üç kez yıkayın. 20 milimolar'ın son konsantrasyonunu yapmak için hücre süpernatantına imidazol ekleyin ve hücre süpernatantını yükleyin.Yıkama için 20 milimolar imidazol içeren üç sütun PBS hacmi ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın. Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda imidazol içeren üç sütun PBS hacmi ile gradyan elütu, her konsantrasyon için iki kez elüter. BCA yöntemiyle protein konsantrasyonunu belirlemek için, standart BSA protein çözeltisini mililitre başına iki ila 0.0625 miligram arasında seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV casus yakalayıcısını ve RBD casus etiketini 10 kez seyreltin.Daha sonra BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi 50'ye bir oranında karıştırın. Seyreltilmiş protein çözeltisi ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi ile karıştırın. 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edin.Her bir kuyucuğun 562 nanometresinde absorbansı ölçün ve standart eğriden protein konsantrasyonunu hesaplayın. OMV casus yakalayıcı ve RBD casus etiketinin biyokonjugasyonunu gerçekleştirmek için, OMV casus yakalayıcı ve RBD casus etiketi ve PBS'yi 40 ila bir oranında karıştırın. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede dakikada 15 dönüşte karıştırmak için dikey olarak döndürün.OMV casus avcısı saflaştırmasına benzer bir prosedür kullanarak PBS çözeltisini kullanarak OMV RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin. Plazma tasarım şeması, casusluk geninin esnek bağlayıcı aracılığıyla cly A genine bağlandığını, casus ise saflaştırma ve doğrulama için bir hys etiketi geni ile RBD geninin beş ana terminaline bağlandığını göstermektedir. Ultrasantrifüjlemeden sonra, reaksiyona girmemiş RBD casusluğunun neredeyse tamamı süpernatant içinde kaldı.İkinci ultrasantrifüjleme, ilk kez daha önemli bir avantaj sağlamadı. OMV casus yakalayıcısının z ortalama hidrodinamik çapı 133 nanometre iken, OMV-RBD için 152.6 nanometre idi. Bu farklılıklar, RBD'nin yoğun görüntülemeden sonra OMV partikül boyutunu arttırmasından kaynaklanıyor olabilir.TEM sonuçları, DLS sonuçlarından elde edilen partikül boyutu dağılımı ile tutarlıdır. Karışımın harmanlanması için rotasyon çok önemlidir. Reaksiyonun verimliliği dönmeden çok daha düşük olabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Demir Oksit Nanopartiküller ile Fonksiyonlu Manyetik Bakteriyel Nanocellulose Fabrikasyon

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...