Name: determining intestinal permeability using lucifer yellow in an apical-out enteroid model
Uploaded: 2022-07-27T14:35:00
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Wir danken Ashley Nelson vom University of Rochester Medical Center für ihre instrumentelle Hilfe bei unserem enteroiden Modell. Wir danken auch der Abteilung für Kinderchirurgie der University of Oklahoma für die Unterstützung dieses Projekts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], dem Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research und dem Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 unterstützt, der an die Abteilung für Chirurgie am Health Sciences Center der University of Oklahoma vergeben wurde.

Die vorliegende Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung des Institutional Review Board (IRB, #11610, 11611) an der University of Oklahoma durchgeführt. Vor der Entnahme menschlicher chirurgischer Proben gemäß den IRB-Spezifikationen war die Zustimmung der Eltern erforderlich. Nach IRB-Genehmigung und elterlicher Zustimmung wurde menschliches Dünndarmgewebe von Säuglingen (korrigiertes Gestationsalter (GA) im Bereich von 36-41 Wochen zum Zeitpunkt der Probenentnahme, alle mit einer Vorgeburtsgeschicht...

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	<li>Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+in+a+time+of+enteroids+and+organoids:+How+the+human+gut+model+has+transformed+the+study+of+enteric+bacterial+pathogens.">Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens.</a> Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. 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(150), e58900 (2019).</li><li>Manabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorpheniramine+increases+paracellular+permeability+to+marker+fluorescein+lucifer+yellow+mediated+by+internalization+of+occludin+in+murine+colonic+epithelial+cells.">Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).</li><li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids.">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+modeling+of+necrotizing+enterocolitis+in+human+infant+intestinal+enteroids.">Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids.</a> Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).</li><li>Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+between+tight+junction-dependent+and+tight+junction-independent+intestinal+barrier+loss+in+vivo.">Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+pore+and+leak+pathways:+A+dynamic+duo.">Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo.</a> Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).</li><li>Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+leak+pathway.">The epithelial cell leak pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8, 2871 (2018).</li><li>Stroulios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+methods+to+study+apical-specific+interactions+using+intestinal+organoid+models.">Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).</li><li>Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+epithelial/endothelial+barriers+in+transwells+and+microfluidic+bilayer+devices.">Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices.</a> Micromachines. 10 (8), 533 (2019).</li></ol>

Die intestinale Permeabilität ist komplex und spiegelt die epitheliale Barrierefunktion wider. Die Darmbarriere besteht aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen, die den transzellulären und parazellulären Transport vermittelt14. Parazelluläre Permeabilität beruht auf Tight-Junction-Proteinen, die den Raum zwischen Epithelzellen abdichten14. Innerhalb dieses parazellulären Transports gibt es drei verschiedene Wege, auf denen sich Moleküle kreuzen können: Pore, Le...

Enteroide sind dreidimensionale (3D) Strukturen, die von organbeschränkten menschlichen Darmstammzellen abgeleitetsind 1,2. Sie bestehen vollständig aus epithelialen Linien und enthalten alle differenzierten Darmepithelzelltypen2. Enteroide behalten auch die zelluläre Polarität bei, die aus einer apikalen luminalen Oberfläche besteht, die ein inneres Kompartiment bildet, und einer basolateralen Oberfläche, die dem umgebenden Medium zugewandt ist. Enteroide sind ein einzigartiges Modell, da sie die Eigenschaften des Wirts bewahren, aus dem sie erzeugt wurden3. Daher stellen Enteroide, die von Frühgeborenen erzeugt werden, ein Modell dar, das für die Untersuchung von Krankheiten nützlich ist, die hauptsächlich diese Population betreffen, wie z.B. nekrotisierende Enterokolitis (NEC).
Das traditionelle enteroide Modell wird in einer basolateralen Out-Konformation (BO) gezüchtet, bei der das Enteroid in einer Kuppel aus Basalmembranmatrix (BMM) eingeschlossen ist. BMM induziert das Enteroid, eine 3D-Struktur mit der basolateralen Oberfläche auf der Außenseite aufrechtzuerhalten. BO-Enteroide sind ein geeignetes Modell für NEC, das die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) primären menschlichen Zelllinien und in vivo Tiermodellen schließt 2,4. NEC wird in Enteroiden induziert, indem Krankheitserreger wie LPS oder Bakterien in die die Enteroide umgebenden Medien eingebracht werden, gefolgt von einer Exposition gegenüber hypoxischen Bedingungen 2,3. Die Herausforderung beim BO-enteroiden NEC-Modell besteht darin, dass es keine effektive Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen ermöglicht, die an der apikalen Oberfläche in vivo auftreten. Veränderungen der intestinalen Permeabilität sind auf diese Wirt-Pathogen-Interaktionen zurückzuführen. Um besser zu verstehen, wie sich die Permeabilität auf die pathophysiologischen Grundlagen von Krankheiten auswirkt, muss ein Modell erstellt werden, das die Behandlung der apikalen Oberfläche beinhaltet.
Co et al. waren die ersten, die zeigten, dass reife BO-Enteroide dazu gebracht werden können, eine apikale Out-Konformation (AO) zu bilden, indem die BMM-Kuppeln entfernt und in Medien resuspendiertwerden 5. Dieser Artikel zeigte, dass AO-Enteroide die korrekte epitheliale Polarität beibehielten, alle Darmzelltypen enthielten, die intestinale Epithelbarriere aufrechterhielten und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglichten5. Die Verwendung von AO-Enteroiden als NEC-Modell erreicht eine physiologische Reproduktion des Krankheitsprozesses und die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen.
Ein wesentlicher Beitrag zur Pathophysiologie von NEC ist eine erhöhte Darmpermeabilität6. Mehrere Moleküle wurden vorgeschlagen, um die Darmpermeabilität in vitro7 zu testen. Unter diesen ist Lucifergelb (LY) ein hydrophiler Farbstoff mit Anregungs- und Emissionspeaks bei 428 nm bzw. 540 nm8. Da es alle wichtigen parazellulären Signalwege durchquert, wurde es verwendet, um die parazelluläre Permeabilität in verschiedenen Anwendungen zu bewerten, einschließlich der Blut-Hirn- und Darmepithelbarrieren 8,9. Die traditionelle Anwendung von LY verwendet Zellen, die in Monoschichten auf einer semipermeablen Oberfläche10 gezüchtet werden. LY wird auf die apikale Oberfläche aufgetragen und durchquert parazelluläre Tight-Junction-Proteine, um sich auf der basolateralen Seite zu versammeln. Höhere LY-Konzentrationen im basolateralen Kompartiment deuten auf eine verminderte Tight Junction-Proteine mit anschließendem Abbau der intestinalen Epithelzellbarriere und eine erhöhte Permeabilität hin10. Es wurde auch in 3D-BO-Enteroidmodellen beschrieben, bei denen LY zu den Medien hinzugefügt wurde und einzelne Enteroide für die Aufnahme von LY in das Lumenabgebildet wurden 11. Obwohl dies eine qualitative Analyse über die Visualisierung der LY-Aufnahme ermöglicht, ist die quantitative Analyse begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Technik, die LY verwendet, um die parazelluläre Permeabilität unter Verwendung eines in vitro NEC enteroiden Modells in AO-Enteroiden unter Beibehaltung der 3D-Orientierung zu bewerten. Diese Methode kann sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Analyse der Permeabilität verwendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% LWRN conditioned media</td>
			<td>Made in-house following Miyoshi et al.12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black, clear bottom plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#D6L1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin mouse primary ab, 1:100</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#14-2567-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier PAP pen</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS m7000 Imaging system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F6057-20mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH, Lithium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular incubator chamber</td>
			<td>Billups Rothenberg Inc.</td>
			<td>MIC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated swinging bucket centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 microplate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, ROCK inhibitor (RI)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining intestinal permeability using lucifer yellow in an apical-out enteroid model

Enteroide sind ein aufstrebendes Forschungsinstrument bei der Untersuchung entzündlicher Darmerkrankungen wie nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Sie werden traditionell in der basolateralen (BO) Konformation angebaut, wo die apikale Oberfläche der Epithelzelle dem inneren Lumen zugewandt ist. In diesem Modell ist der Zugang zur luminalen Oberfläche von Enteroiden für Behandlung und Experimente eine Herausforderung, was die Fähigkeit zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen einschränkt. Um dies zu umgehen, wurde ein neonatales apikales Out-Modell (AO) für nekrotisierende Enterokolitis erstellt. Da Veränderungen der Permeabilität von Darmepithelzellen für NEC pathognomonisch sind, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Lucifergelb (LY) als Marker für parazelluläre Permeabilität. LY durchquert die intestinale Epithelbarriere über alle drei wichtigen parazellulären Signalwege: Pore, Leck und uneingeschränkt. Die Verwendung von LY in einem AO-Modell ermöglicht eine breitere Untersuchung der Permeabilität in NEC. Nach IRB-Genehmigung und elterlicher Zustimmung wurden chirurgische Proben von Darmgewebe von menschlichen Frühgeborenen gesammelt. Darmstammzellen wurden durch Kryptenisolierung gewonnen und zum Züchten von Enteroiden verwendet. Enteroide wurden bis zur Reife gezüchtet und dann AO transformiert oder in BO-Konformation belassen. Diese wurden entweder nicht behandelt (Kontrolle) oder mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelt und hypoxischen Bedingungen zur Induktion von in vitro NEC ausgesetzt. LY wurde verwendet, um die Permeabilität zu beurteilen. Immunfluoreszenzfärbung des apikalen Proteins Zogula occludens-1 und des basolateralen Proteins β-Catenin bestätigte die AO-Konformation. Sowohl AO- als auch BO-Enteroide, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine signifikant erhöhte parazelluläre Permeabilität. Sowohl AO- als auch BO-Enteroide zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte Aufnahme von LY in das Lumen der behandelten Enteroide. Die Verwendung von LY in einem AO-Enteroidmodell ermöglicht die Untersuchung aller drei Hauptwege der parazellulären Permeabilität. Es ermöglicht auch die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen und wie sich dies auf die Permeabilität im Vergleich zum BO-Enteroid-Modell auswirken kann.

AO-Konformation Enteroide, die für 72 h in 50% LWRN-Medien suspendiert sind, nehmen eine AO-Konformation an (Abbildung 1). Dies wurde durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung enteroider ganzer Montierungen des apikalen Proteins Zonola occludens-1 (ZO-1) und des basolateralen Proteins β-Catenin bestätigt (Abbildung 1). AO-Enteroide zeigen ZO-1 (grün) auf der äußeren, apikalen Oberfläche des Enteroids, während sich β-Ca...

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Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode, die Luzifergelb in einem apikalen enteroiden Modell verwendet, um die Darmpermeabilität zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität in Enteroiden zu bestimmen, die entzündliche Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis modellieren.

Bestimmung der Darmpermeabilität mit Lucifer Yellow in einem apikalen enteroiden Modell

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

Die Anwendung von Lucifer Yellow auf die Medien von Apical-out-Enteroiden bietet eine einfache Methode zur quantitativen und qualitativen Analyse aller drei wichtigsten parazellulären intestinalen Permeabilitätswege in einem 3D-Modell. Es ist eine relativ einfache Technik, die es uns ermöglicht, die Permeabilität mit einem enteroiden Modell zu beurteilen. Wir arbeiten mit dieser Technik in unseren Studien der nekrotisierenden Enterokolitis.Diese Technik kann jedoch bei der Untersuchung jeder menschlichen Darmerkrankung unter Verwendung eines enteroiden Modells nützlich sein. Die Verfahren werden heute von unseren Postdoktoranden Dr. Tyler Leiva und Dr. Alena Golubkova sowie Camille Schlegel, der wissenschaftlichen Betreuerin aus unserem Labor, demonstriert. Um zu beginnen, wachsen Sie die in BMM eingebetteten Androiden für sieben bis 10 Tage mit 50% LWRN-konditionierten Medien für die apikale Out- oder AO-enteroide Generation.Entfernen Sie die Medien aus der Umgebung der BMM-Kuppeln und fügen Sie 500 Mikroliter Zellwiederherstellungslösung oder CRS in eine Vertiefung hinzu. Schaben Sie die Kuppel ab, pipetten Sie sie mehrmals auf und ab, um das CRS mit den in BMM-Schnappscheiben eingebetteten Enteroiden zu homogenisieren, und fügen Sie diese Lösung der nächsten Vertiefung hinzu. Schaben Sie die Kuppel erneut ab und pipetten Sie sie mehrmals auf und ab, bevor Sie die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben.Fügen Sie 500 Mikroliter CRS in die zweite Vertiefung hinzu, pipettieren Sie es auf und ab, um es gut zu mischen und in die erste Vertiefung zu überführen. Von der ersten Vertiefung aus die enteroide CRS-BMM-Lösung in dasselbe 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen poolen und dieses Pooling für die verbleibenden Bohrlöcher wiederholen, bis der Inhalt aller Bohrlöcher in CRS ist. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit gepoolter CRS-Lösung für eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einen Rotator.Dann zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 X g für drei Minuten bei vier Grad Celsius, bevor Sie den Überstand entfernen und das enteroide Pellet in einem Milliliter 50% LWRN konditioniertem Medium wieder suspendieren. Übertragen Sie vorsichtig 500 Mikroliter der resuspendierten enteroiden oder Medienlösung in jede Vertiefung der ultra-low attachment 24 well Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 für drei Tage vor dem Experiment.Stellen Sie sicher, dass AO-Enteroide vor der Anwendung mindestens 72 Stunden lang ausgesetzt sind. Übertragen Sie vorsichtig alle in Medien suspendierten Enteroide aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 300 X g drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen.Fügen Sie 10 Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid oder LPS zu 500 Mikrolitern 50% LWRN konditioniertem Medium pro Vertiefung hinzu, um die Mastermischung vorzubereiten, und suspendieren Sie das AO-Enteroidpellet aus der Behandlungsgruppe in 500 Mikroliter LPS plus 50% LWRN konditioniertes Medium. Pipetten Sie nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Aliquot 500 Mikroliter Suspension in jede Vertiefung einer 24 Wells Ultra Low Attachment Platte.In ähnlicher Weise werden die AO-Enteroide aus der unbehandelten Kontrollgruppe in 500 Mikroliter 50% LWRN-konditioniertes Medium pro Vertiefung und aliquot 500 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung einer separaten 24-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte resuspendiert. Induzieren Sie eine Hypoxie in den LPS-behandelten AO-Enteroiden mit einer modularen Inkubatorkammer mit 1% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 94% Stickstoff und inkubieren Sie die Enteroide mit Hypoxie und LPS für 24 Stunden. Legen Sie die unbehandelten und LPS plus Hypoxie, behandelte Kulturen für 24 Stunden in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator.Um die parazelluläre Permeabilität mit Lucifer Yellow oder LY zu messen, geben Sie die enteroide oder Mediensuspension aus jeder Vertiefung vorsichtig in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Warme phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder DPBS von Dulbecco und 50% LWRN konditionierte Medien in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 X g für drei Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie das enteroide Pellet mit 500 Mikrolitern warmem DPBS vor der Zentrifugation bei 300 X g für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und wiederholen Sie den DPBS-Waschschritt noch einmal. Nachdem der DPBS gewaschen wurde, fügen Sie 450 Mikroliter warme 50% LWRN konditionierte Medien hinzu und fügen Sie die Suspension zu einer 24-Well-Platte hinzu.Dann fügen Sie 50 Mikroliter von 2,5 Milligramm pro Milliliter LY zu jeder Vertiefung hinzu. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um zu mischen, und legen Sie sie für zwei Stunden in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator. Pipettieren Sie die enteroide Suspension vorsichtig aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie es und entfernen Sie den Überstand, wobei das enteroide Pellet zurückbleibt. Waschen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern warmem DPBS und zentrifugieren Sie es. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet zurück.Wiederholen Sie drei Wäschen des DPBS, bevor Sie das Pellet mit 1000 Mikrolitern kaltem DPBS erneut suspendieren, und dissoziieren Sie die Enteroide durch kräftiges Mischen mit einer Pipette. Für die Lucifer-Gelb-Standardkurve bereiten Sie die in DPBS verdünnten Standards wie im Text beschrieben vor. Pipettieren Sie 150 Mikroliter jeder Probe pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung auf einer 96-Well-Platte.Messen Sie die Fluoreszenz bei einem Anregungspeak von 428 Nanometern und einem Emissionspeak von 536 Nanometern auf einem Fluoreszenzplattenleser. Berechnen Sie die Konzentrationen mit Hilfe einer statistischen Software und einer Vier-Parameter-Kurve, die die Standardkurve interpoliert. Die Immunfluoreszenzfärbung der Enteroide, die 72 Stunden lang in 50% LWRN-Medien suspendiert waren, zeigte Zo-1 auf der äußeren apikalen Oberfläche des Enteroids, während Beta-Catenin auf der basolateralen Oberfläche zu sehen ist.Es zeigte die erwartete Polaritätsumkehr von Enteroiden an, die eine AO-Konformation von Enteroiden bestätigten. Basolaterale Out- oder BO-Enteroide, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, zeigten eine signifikant erhöhte Permeabilität, was in einem Lucifer Yellow- oder LY-Assay durch die erhöhte Aufnahme von LY-Farbstoff in das enteroide Lumen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen nachgewiesen wurde. Der Lucifer Yellow-Test zeigte auch die erhöhte Aufnahme von LY im Lumen von behandelten AO-Enteroiden im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen.Es bestätigte die erhöhte Permeabilität von AO-Enteroiden, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen. Es ist wichtig, die enteroiden Pellets gründlich zu waschen, um sicherzustellen, dass alle extraluminalen LY entfernt werden. Es ermöglicht die genaue Quantifizierung des verbleibenden intraluminalen LY bei der Berechnung der Permeabilität.Für die qualitative Analyse können Enteroide mittels Fluoreszenzmikroskopie zur LY-Aufnahme in das Lumen sichtbar gemacht werden. Nach der LY-Inkubation und den anschließenden Waschschritten vor der Dissoziation vom Microplatten-Lesen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

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Forschung

Immunologie und Infektion

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