Name: determining intestinal permeability using lucifer yellow in an apical-out enteroid model
Uploaded: 2022-07-27T14:35:00
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로체스터 대학 의료 센터의 Ashley Nelson에게 엔터 로이드 모델에 대한 그녀의 도구 적 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 오클라호마 대학교 소아외과에도 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [NIH Grant R03 DK117216-01A1], 오클라호마 성인 줄기 세포 연구 센터 및 장로교 건강 재단 보조금 # 20180587의 지원을 받아 오클라호마 대학 건강 과학 센터의 외과에 수여되었습니다.

본 연구는 오클라호마 대학의 기관 검토 위원회 승인(IRB, #11610, 11611)에 따라 수행되었습니다. IRB 사양에 따라 인간 수술 표본을 수집하기 전에 부모의 동의가 필요했습니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 소장 조직을 NEC 또는 장루 제거 또는 폐쇄증 수리와 같은 기타 장 절제술 수술을 받는 영아(샘플 수집 당시 36-41주 범위의 교정 재태 연령(GA), 모두 25-34주의 추정 GA, 2:1 M:F)로부터 얻었습니?...

<ol>
	<li>Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+in+a+time+of+enteroids+and+organoids:+How+the+human+gut+model+has+transformed+the+study+of+enteric+bacterial+pathogens.">Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens.</a> Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-based+modeling+approaches+for+necrotizing+enterocolitis.">Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 13 (6), (2020).</li><li>Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+epithelial+enteroid+model+of+necrotizing+enterocolitis.">A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).</li><li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+epithelial+polarity:+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions.">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).</li><li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1+inhibitor+stabilizes+E-cadherin+and+improves+barrier+function+in+experimental+necrotizing+enterocolitis.">ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis.</a> The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).</li><li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+epithelial+barrier+permeability+in+human+intestinal+organoids.">Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).</li><li>Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+heat+stress+affect+epithelial+integrity+in+a+Caco-2/HT-29+co-culture.">Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture.</a> Scientific Reports. 11, 13186 (2021).</li><li>Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+yellow+-+A+robust+paracellular+permeability+marker+in+a+cell+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).</li><li>Manabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorpheniramine+increases+paracellular+permeability+to+marker+fluorescein+lucifer+yellow+mediated+by+internalization+of+occludin+in+murine+colonic+epithelial+cells.">Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).</li><li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids.">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+modeling+of+necrotizing+enterocolitis+in+human+infant+intestinal+enteroids.">Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids.</a> Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).</li><li>Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+between+tight+junction-dependent+and+tight+junction-independent+intestinal+barrier+loss+in+vivo.">Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+pore+and+leak+pathways:+A+dynamic+duo.">Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo.</a> Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).</li><li>Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+leak+pathway.">The epithelial cell leak pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8, 2871 (2018).</li><li>Stroulios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+methods+to+study+apical-specific+interactions+using+intestinal+organoid+models.">Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).</li><li>Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+epithelial/endothelial+barriers+in+transwells+and+microfluidic+bilayer+devices.">Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices.</a> Micromachines. 10 (8), 533 (2019).</li></ol>

장 투과성은 복잡하고 상피 장벽 기능을 반영합니다. 장 장벽은 세포횡단 및 세포주위 수송(14)을 매개하는 상피 세포의 단일층을 포함한다. 세포부투과성은 상피 세포(14) 사이의 공간을 밀봉하는 단단한 접합 단백질에 의존한다. 이 초세포 수송 내에는 분자가 교차할 수 있는 세 가지 뚜렷한 경로가 있습니다: 기공, 누출 및 무제한15. 공극 경?...

엔테로이드는 장기 제한 인간 장 줄기 세포 1,2에서 파생된 3차원(3D) 구조입니다. 그들은 전적으로 상피 계통으로 구성되어 있으며 분화 된 모든 장 상피 세포 유형2을 포함합니다. 엔테로이드는 또한 내부 구획을 형성하는 정점 내강 표면과 주변 매체를 향한 기저측 표면으로 구성된 세포 극성을 유지합니다. 엔테로이드는 생성 된 호스트의 특성을 보존한다는 점에서 고유 한 모델입니다3. 따라서 미숙아에서 생성 된 엔터 로이드는 괴사 성 장염 (NEC)과 같이이 집단에 주로 영향을 미치는 질병을 조사하는 데 유용한 모델을 나타냅니다.
전통적인 엔터로이드 모델은 엔테로이드가 기저막 매트릭스(BMM)의 돔에 둘러싸인 기저측부(BO) 형태로 재배됩니다. BMM은 엔터로이드가 외부에 기저측 표면이 있는 3D 구조를 유지하도록 유도합니다. BO 엔테로이드는 2차원(2D) 1차 인간 세포주와 생체 내 동물 모델 2,4 사이의 간극을 해소하는 NEC에 적합한 모델입니다. NEC는 LPS 또는 박테리아와 같은 병원체를 엔테로이드 주변 매체에 배치한 다음 저산소 조건 2,3에 노출시켜 엔테로이드에서 유도됩니다. BO 엔테로이드 NEC 모델의 과제는 생체 내 정점 표면에서 발생하는 숙주-병원체 상호 작용에 대한 효과적인 연구를 허용하지 않는다는 것입니다. 장 투과성의 변화는 이러한 숙주-병원체 상호 작용 때문입니다. 투과성이 질병의 병태생리학적 기초에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 이해하려면 정점 표면을 치료하는 모델을 만들어야 합니다.
Co 등은 성숙한 BO 엔테로이드가 BMM 돔을 제거하고 배지5에 재현탁시킴으로써 정점 (AO) 형태를 형성하도록 유도 할 수 있음을 처음으로 입증했습니다. 이 기사는 AO enteroids가 올바른 상피 극성을 유지하고, 모든 장 세포 유형을 포함하고, 장 상피 장벽을지지하고, 정점 표면5에 대한 접근을 허용한다는 것을 입증했습니다. AO 엔테로이드를 NEC 모델로 사용하면 질병 과정의 생리학적 재현과 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구를 달성할 수 있습니다.
NEC의 병태생리학에 대한 한 가지 주요 기여는 증가된 장 투과성입니다6. 시험관내 7에서 장 투과성을 시험하는 방법으로 여러 분자가 제안되었습니다. 이들 중에서, 루시퍼 옐로우(LY)는 각각 428nm 및 540nm에서 여기 및 방출 피크를 갖는 친수성 염료이다(8). 모든 주요 paracellular 경로를 통과하기 때문에 혈액 뇌 및 장 상피 장벽 8,9를 포함한 다양한 응용 분야에서 paracellular 투과성을 평가하는 데 사용되었습니다. LY의 전통적인 적용은 반투과성 표면10 상의 단층으로 성장한 세포를 사용한다. LY는 정점 표면에 적용되고 세포 내 단단한 접합 단백질을 통과하여 기저측에 모입니다. 기저측 구획의 LY 농도가 높을수록 후속 장 상피 세포 장벽 파괴 및 투과성 증가와 함께 단단한 접합 단백질이 감소했음을 나타냅니다10. 또한 3D BO 엔터로이드 모델에서 설명되었으며, 여기서 LY가 미디어에 추가되고 개별 엔터로이드가 내강(11) 내로 LY의 흡수를 위해 이미징되었습니다. 이를 통해 LY 흡수의 시각화를 통한 정성 분석이 가능하지만 정량 분석은 제한적입니다. 이 프로토콜은 3D 방향을 유지하면서 AO 엔테로이드에서 체외 NEC 엔터로이드 모델을 사용하여 LY를 사용하여 세포내 투과성을 평가하는 고유한 기술을 설명합니다. 이 방법은 투과성의 정성 및 정량 분석 모두에 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% LWRN conditioned media</td>
			<td>Made in-house following Miyoshi et al.12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black, clear bottom plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#D6L1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin mouse primary ab, 1:100</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#14-2567-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier PAP pen</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS m7000 Imaging system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F6057-20mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH, Lithium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular incubator chamber</td>
			<td>Billups Rothenberg Inc.</td>
			<td>MIC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated swinging bucket centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 microplate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, ROCK inhibitor (RI)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining intestinal permeability using lucifer yellow in an apical-out enteroid model

엔테로이드는 괴사성 장염(NEC)과 같은 염증성 장 질환 연구에서 떠오르는 연구 도구입니다. 그들은 전통적으로 상피 세포의 정점 표면이 내부 내강을 향하는 기저측(BO) 형태로 자랍니다. 이 모델에서는 치료 및 실험을 위해 엔테로이드의 내강 표면에 접근하는 것이 어려워 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 능력이 제한됩니다. 이를 피하기 위해 괴사성 장염에 대한 신생아 정점(AO) 모델이 만들어졌습니다. 장 상피 세포 투과성 변화는 NEC에 대한 병리학적이기 때문에 이 프로토콜은 루시퍼 옐로우(LY)를 세포 투과성의 마커로 사용하여 설명합니다. LY는 세 가지 주요 세포 간 경로(기공, 누출 및 제한되지 않음)를 통해 장 상피 장벽을 가로지릅니다. AO 모델에서 LY를 사용하면 NEC의 투과성에 대한 광범위한 연구가 가능합니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 조산 신생아로부터 장 조직의 수술 샘플을 수집했습니다. 장 줄기 세포는 지하실 분리 를 통해 수확되어 장내 증식에 사용되었습니다. 엔테로이드는 성숙할 때까지 성장한 다음 AO로 변형되거나 BO 형태로 남았습니다. 이들은 치료되지 않았거나 (대조군) 또는 지질 다당류 (LPS)로 처리되었고 시험관 내 NEC의 유도를위한 저산소 조건을 받았다. 투과성을 평가하기 위해 LY를 사용하였다. 정점 단백질 zonula occludens-1 및 기저측 단백질 β-catenin의 면역형광 염색 결과 AO 형태가 확인되었습니다. LPS와 저산소증으로 치료받은 AO 및 BO 엔테로이드는 대조군에 비해 세포 주위투과성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. AO 및 BO 엔테로이드 모두 대조군에 비해 처리된 엔테로이드의 내강으로의 LY 흡수가 증가한 것으로 나타났습니다. AO 엔테로이드 모델에서 LY를 활용하면 세포 투과성의 세 가지 주요 경로를 모두 조사할 수 있습니다. 또한 숙주-병원체 상호 작용과 이것이 BO 엔터로이드 모델과 비교하여 투과성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사할 수 있습니다.

AO 형태 50% LWRN 배지에 72시간 동안 현탁된 엔테로이드는 AO 형태를 가정합니다(그림 1). 이것은 정점 단백질, zonula occludens-1 (ZO-1) 및 기저측 단백질 β- 카테닌의 장내 전체 마운트를 활용 한 면역 형광 염색을 통해 확인되었습니다 (그림 1). AO 엔테로이드는 엔테로이드의 바깥쪽 정점 표면에 ZO-1(녹색)을 나타내는 반면 β-카테닌(빨간?...

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Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

Lucifer Yellow를 Apical-out enteroids의 배지에 적용하면 3D 모델에서 세 가지 주요 paracellular 장 투과성 경로 모두에 대한 정량적 및 정성적 분석을 위한 간단한 방법을 제공합니다. 엔테로이드 모델을 사용하여 투과성을 평가할 수 있는 비교적 간단한 기술입니다. 우리는 괴사 성 장염에 대한 연구에서이 기술을 사용하고 있습니다.그러나이 기술은 장내 모델을 사용하여 인간의 장 질환을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 오늘 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Tyler Leiva 박사와 Alena Golubkova 박사, 그리고 우리 실험실의 연구 보조 감독자 인 Camille Schlegel입니다. 시작하려면 BMM에 내장 된 Android를 정점 또는 AO 엔터 로이드 세대를위한 50 % LWRN 조절 미디어로 7-10 일 동안 성장시킵니다.BMM 돔 주변에서 배지를 제거하고 500마이크로리터의 세포 회수 용액 또는 CRS를 하나의 웰에 추가합니다. 돔을 긁어 내고 위아래로 여러 번 피펫하여 BMM 돔에 내장 된 엔터 로이드로 CRS를 균질화하고이 용액을 다음 웰에 첨가하십시오. 다시, 돔을 긁어 내고 용액을 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기기 전에 위아래로 여러 번 피펫팅하십시오.두 번째 웰에 500마이크로리터의 CRS를 추가하고 피펫을 위아래로 하여 잘 섞은 다음 첫 번째 웰로 옮깁니다. 첫 번째 웰에서 CRS 엔터로이드 BMM 용액을 동일한 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브에 풀링하고 모든 웰의 내용물이 CRS에 들어갈 때까지 나머지 웰에 대해 이 풀링을 반복합니다. 풀링된 CRS 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전 장치에 놓습니다.그런 다음 상청액을 제거하기 전에 섭씨 4도에서 3분 동안 200 X g에서 미세 원심분리 튜브를 원심분리하고 장내 펠릿을 50% LWRN 조절 배지 1밀리리터에 다시 현탁합니다. 500 마이크로리터의 재부유된 장내 또는 배지 용액을 초저 부착 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 부드럽게 옮깁니다. 실험 전 3일 동안 플레이트를 섭씨 37도에서 5%CO2로 배양합니다.사용하기 전에 AO 엔테로이드를 최소 72시간 동안 일시 중단했는지 확인하십시오. 각 웰의 배지에 부유 된 모든 엔터 로이드를 미세 원심 분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 300 X g에서 원심분리하고 상청액을 제거한다.리포폴리사카라이드 밀리리터당 500마이크로리터의 50%LWRN 조절 배지에 10마이크로리터의 리포폴리사카라이드 또는 LPS를 추가하여 마스터 믹스를 제조하고 처리 그룹의 AO 장용 펠릿을 500마이크로리터의 LPS와 50%LWRN 조절 배지에 다시 현탁시킵니다. 피펫을 위아래로 움직여 완전히 혼합하십시오. 500 마이크로리터의 현탁액을 24웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 분취한다.유사하게 웰당 500마이크로리터의 50%LWRN 조절 배지에 처리되지 않은 대조군으로부터의 AO 엔테로이드를 재현탁시키고, 이 현탁액의 500마이크로리터를 별도의 24웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 분취한다. 1% 산소, 5% 이산화탄소 및 94% 질소가 있는 모듈식 인큐베이터 챔버를 사용하여 LPS 처리된 AO 엔터로이드에서 저산소증을 유도하고 24시간 동안 저산소증 및 LPS와 함께 엔테로이드를 배양합니다. 처리되지 않은 LPS와 저산소증, 처리된 배양물을 5%이산화탄소 인큐베이터에 24시간 동안 두십시오.Lucifer Yellow 또는 LY를 사용하여 세포 투과성을 측정하려면 각 웰의 장내 또는 배지 현탁액을 미세 원심분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 섭씨 37도 수조에서 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 및 50 % LWRN 조절 배지를 따뜻하게합니다. 현탁액을 실온에서 3분 동안 300 X g로 원심분리한다.배지를 제거하고, 300 X g에서 3분 동안 원심분리하기 전에 500 마이크로리터의 따뜻한 DPBS로 장용 펠릿을 세척한다. 마이크로 피펫으로 상청액을 제거하고 DPBS 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. DPBS 세척 후 450마이크로리터의 따뜻한 50%LWRN 조절 배지를 추가하고 현탁액을 24웰 플레이트에 추가합니다.그런 다음 밀리리터 LY 당 2.5 밀리그램의 50 마이크로 리터를 각 우물에 첨가하십시오. 접시를 부드럽게 소용돌이 치며 혼합하고 5 % 이산화탄소 인큐베이터에 2 시간 동안 두십시오. 각 웰의 엔테로이드 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다.그것을 원심분리하고 장내 펠릿을 남기고 상층액을 제거합니다. 500마이크로리터의 따뜻한 DPBS를 사용하여 펠릿을 세척하고 원심분리합니다. 펠릿을 남겨두고 상청액을 제거합니다.1000 마이크로리터의 차가운 DPBS로 펠릿을 다시 현탁하기 전에 DPBS의 세 번의 세척을 반복하고, 피펫을 사용하여 격렬하게 혼합하여 엔테로이드를 해리합니다. 루시퍼 옐로우 표준 곡선의 경우 텍스트에 설명 된대로 DPBS로 희석 된 표준을 준비하십시오. 웰당 각 시료를 150 마이크로리터씩 96웰 플레이트에 삼중으로 피펫팅한다.형광 플레이트 판독기에서 428나노미터의 여기 피크와 536나노미터의 방출 피크에서 형광을 측정합니다. 통계 소프트웨어와 표준 곡선을 보간하는 4개의 파라미터 곡선을 사용하여 농도를 계산합니다. 72 시간 동안 50 % LWRN 배지에 현탁 된 엔터 로이드의 면역 형광 염색은 엔터 로이드의 바깥 쪽 정점 표면에 Zo-1을 나타 냈고, 베타 카테닌은 기저 측 표면에서 볼 수 있었다.그것은 엔테로이드의 AO 형태를 확인하는 엔테로이드의 예상되는 극성 반전을 나타냅니다. LPS 및 저산소증으로 처리된 기저측 아웃 또는 BO 엔테로이드는 처리되지 않은 대조군에 비해 장내 내강으로의 LY 염료의 흡수 증가에 의해 Lucifer Yellow 또는 LY 분석에서 입증된 유의하게 증가된 투과성을 나타냈다. Lucifer Yellow 분석은 또한 처리되지 않은 대조군과 비교하여 처리된 AO 엔테로이드의 내강에서 LY의 증가된 흡수를 입증했습니다.LPS 및 저산소증으로 처리된 AO 엔테로이드의 증가된 투과성을 처리되지 않은 대조군과 비교하여 확인하였다. 모든 외강 LY가 제거되었는지 확인하기 위해 장용 펠릿을 철저히 세척하는 것이 중요합니다. 투과도를 계산할 때 나머지 관강 내 LAY의 정확한 정량화를 허용합니다.정성 분석을 위해 엔테로이드는 형광 현미경을 통해 시각화하여 내강으로의 LY 흡수를 확인할 수 있습니다. LY 인큐베이션 및 후속 세척 단계를 거쳐 마이크로플레이트 판독으로부터 해리시키기 전에.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 Titre를 결정

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

에서 계란을 사용하여<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; 등<em&gt; 생체내에서</em기생충 유도된 폐 염증의&gt; 모델

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...