Name: determining intestinal permeability using lucifer yellow in an apical-out enteroid model
Uploaded: 2022-07-27T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model at JoVE.com

Vi vill tacka Ashley Nelson från University of Rochester Medical Center för hennes instrumentella hjälp med vår enteroidmodell. Vi vill också tacka avdelningen för pediatrisk kirurgi vid University of Oklahoma för deras stöd till detta projekt. Detta arbete stöddes av National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research och Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 som tilldelades institutionen för kirurgi vid University of Oklahoma Health Sciences Center.

Den aktuella forskningen utfördes i enlighet med Institutional Review Board godkännande (IRB, #11610, 11611) vid University of Oklahoma. Föräldrarnas samtycke krävdes innan man samlade in humankirurgiska prover enligt IRB-specifikationerna. Efter IRB-godkännande och föräldrarnas samtycke erhölls mänsklig tunntarmsvävnad från spädbarn (korrigerad graviditetsålder (GA) som sträcker sig från 36-41 veckor vid tidpunkten för provinsamling, alla med en historia av för tidig födsel vid en uppskattad GA på 25...

<ol>
	<li>Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+in+a+time+of+enteroids+and+organoids:+How+the+human+gut+model+has+transformed+the+study+of+enteric+bacterial+pathogens.">Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens.</a> Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-based+modeling+approaches+for+necrotizing+enterocolitis.">Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 13 (6), (2020).</li><li>Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+epithelial+enteroid+model+of+necrotizing+enterocolitis.">A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).</li><li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+epithelial+polarity:+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions.">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).</li><li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1+inhibitor+stabilizes+E-cadherin+and+improves+barrier+function+in+experimental+necrotizing+enterocolitis.">ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis.</a> The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).</li><li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+epithelial+barrier+permeability+in+human+intestinal+organoids.">Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).</li><li>Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+heat+stress+affect+epithelial+integrity+in+a+Caco-2/HT-29+co-culture.">Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture.</a> Scientific Reports. 11, 13186 (2021).</li><li>Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+yellow+-+A+robust+paracellular+permeability+marker+in+a+cell+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).</li><li>Manabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorpheniramine+increases+paracellular+permeability+to+marker+fluorescein+lucifer+yellow+mediated+by+internalization+of+occludin+in+murine+colonic+epithelial+cells.">Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).</li><li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids.">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+modeling+of+necrotizing+enterocolitis+in+human+infant+intestinal+enteroids.">Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids.</a> Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).</li><li>Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+between+tight+junction-dependent+and+tight+junction-independent+intestinal+barrier+loss+in+vivo.">Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+pore+and+leak+pathways:+A+dynamic+duo.">Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo.</a> Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).</li><li>Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+leak+pathway.">The epithelial cell leak pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8, 2871 (2018).</li><li>Stroulios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+methods+to+study+apical-specific+interactions+using+intestinal+organoid+models.">Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).</li><li>Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+epithelial/endothelial+barriers+in+transwells+and+microfluidic+bilayer+devices.">Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices.</a> Micromachines. 10 (8), 533 (2019).</li></ol>

Tartarmpermeabilitet är komplex och reflekterar epitelbarriärfunktionen. Tarmbarriären består av ett enda lager epitelceller som förmedlar transcellulär och paracellulär transport14. Paracellulär permeabilitet är beroende av täta korsningsproteiner som tätar utrymmet mellan epitelceller14. Inom denna paracellulära transport finns det tre distinkta vägar genom vilka molekyler kan korsa: por, läckage ochobegränsad 15. Porvägen möjligg?...

Enteroider är tredimensionella (3D) strukturer härledda från organbegränsade mänskliga tarmstamceller 1,2. De består helt av epitelial härstamning och innehåller alla differentierade tarmepitelcelltyper2. Enteroider upprätthåller också cellulär polaritet som består av en apikal luminal yta som bildar ett inre fack och en basolateral yta som vetter mot det omgivande mediet. Enteroider är en unik modell genom att de bevarar egenskaperna hos värden från vilken de genererades3. Således representerar enteroider som genereras från för tidigt födda barn en modell som är användbar för att undersöka sjukdomar som främst påverkar denna befolkning, såsom nekrotiserande enterokolit (NEC).
Den traditionella enteroidmodellen odlas i en basolateral-out (BO) konformation, där enteroiden är innesluten i en kupol av källarmembranmatris (BMM). BMM inducerar enteroiden att upprätthålla en 3D-struktur med den basolaterala ytan på utsidan. BO-enteroider är en lämplig modell för NEC som överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) primära mänskliga cellinjer och in vivo djurmodeller 2,4. NEC induceras i enteroider genom att placera patogener såsom LPS eller bakterier i media som omger enteroiderna, följt av exponering för hypoxiska tillstånd 2,3. Utmaningen med BO enteroid NEC-modellen är att den inte möjliggör en effektiv studie av värd-patogeninteraktioner, som uppträder vid den apikala ytan in vivo. Förändringar i tarmpermeabilitet beror på dessa värd-patogeninteraktioner. För att bättre förstå hur permeabilitet påverkar den patofysiologiska grunden för sjukdom måste en modell skapas som innebär att man behandlar den apikala ytan.
var de första som visade att mogna BO-enteroider kan induceras att bilda en apikal-out (AO) konformation genom att ta bort BMM-kupolerna och återsuspendera dem i media5. Denna artikel visade att AO-enteroider upprätthöll korrekt epitelpolaritet, innehöll alla tarmcellstyper, upprätthöll tarmepitelbarriären och tillät tillgång till den apikala ytan5. Genom att använda AO-enteroider som NEC-modell uppnås en fysiologisk reproduktion av sjukdomsprocessen och studier av värd-patogeninteraktioner.
En viktig bidragsgivare till patofysiologin hos NEC är ökad tarmpermeabilitet6. Flera molekyler har föreslagits som ett sätt att testa för tarmpermeabilitet in vitro7. Bland dessa är lucifergul (LY) ett hydrofilt färgämne med excitations- och emissionstoppar vid 428 nm respektive540 nm 8. När den korsar genom alla större paracellulära vägar har den använts för att utvärdera paracellulär permeabilitet i olika applikationer, inklusive blod-hjärn- och tarmepitelbarriärerna 8,9. Den traditionella tillämpningen av LY använder celler som odlas i monolager på en halvgenomsläpplig yta10. LY appliceras på den apikala ytan och korsar genom paracellulära täta korsningsproteiner för att samlas på den basolaterala sidan. Högre LY-koncentrationer i det basolaterala facket indikerar minskade täta korsningsproteiner med efterföljande nedbrytning av tarmepitelcellbarriären och ökad permeabilitet10. Det har också beskrivits i 3D BO-enteroidmodeller där LY lades till i media och enskilda enteroider avbildades för upptag av LY i lumen11. Även om detta möjliggör kvalitativ analys via visualisering av LY-upptag, är kvantitativ analys begränsad. Detta protokoll beskriver en unik teknik som använder LY för att bedöma paracellulär permeabilitet med hjälp av en in vitro NEC-enteroidmodell i AO-enteroider samtidigt som 3D-orientering bibehålls. Denna metod kan användas för både kvalitativ och kvantitativ analys av permeabilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% LWRN conditioned media</td>
			<td>Made in-house following Miyoshi et al.12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black, clear bottom plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#D6L1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin mouse primary ab, 1:100</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#14-2567-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier PAP pen</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS m7000 Imaging system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F6057-20mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH, Lithium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular incubator chamber</td>
			<td>Billups Rothenberg Inc.</td>
			<td>MIC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated swinging bucket centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 microplate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, ROCK inhibitor (RI)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining intestinal permeability using lucifer yellow in an apical-out enteroid model

Enteroider är ett framväxande forskningsverktyg i studien av inflammatoriska tarmsjukdomar som nekrotiserande enterokolit (NEC). De odlas traditionellt i basolateral-out (BO) konformationen, där epitelcellens apikala yta vetter mot den inre lumen. I denna modell är tillgången till enteroidernas luminala yta för behandling och experiment utmanande, vilket begränsar förmågan att studera värd-patogeninteraktioner. För att kringgå detta skapades en neonatal apical-out (AO) modell för nekrotiserande enterokolit. Eftersom tarmepitelcellpermeabilitetsförändringar är patognomoniska för NEC, skisserar detta protokoll med lucifergul (LY) som en markör för paracellulär permeabilitet. LY passerar tarmepitelbarriären via alla tre stora paracellulära vägar: por, läckage och obegränsad. Att använda LY i en AO-modell möjliggör en bredare studie av permeabilitet i NEC. Efter IRB-godkännande och föräldrarnas samtycke samlades kirurgiska prover av tarmvävnad in från mänskliga för tidigt födda barn. Tarmstamceller skördades via kryptisolering och användes för att odla enteroider. Enteroider odlades till mognad och omvandlades sedan AO eller lämnades i BO-konformation. Dessa behandlades antingen inte (kontroll) eller behandlades med lipopolysackarid (LPS) och utsattes för hypoxiska tillstånd för induktion av in vitro NEC. LY användes för att bedöma permeabilitet. Immunofluorescerande färgning av det apikala proteinet zonula occludens-1 och basolateralt protein β-cateninbekräftad AO-konformation. Både AO- och BO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi visade signifikant ökad paracellulär permeabilitet jämfört med kontroller. Både AO- och BO-enteroider visade ökat upptag av LY i lumen hos de behandlade enteroiderna jämfört med kontroller. Användningen av LY i en AO-enteroidmodell möjliggör undersökning av alla tre huvudvägarna för paracellulär permeabilitet. Det möjliggör dessutom undersökning av värd-patogeninteraktioner och hur detta kan påverka permeabiliteten jämfört med BO-enteroidmodellen.

AO-konformation Enteroider suspenderade i 50% LWRN-media i 72 timmar antar en AO-konformation (figur 1). Detta bekräftades via immunofluorescerande färgning med hjälp av enteroida hela fästen av det apikala proteinet, zonula occludens-1 (ZO-1) och basolateralt protein, β-catenin (Figur 1). AO-enteroider visar ZO-1 (grön) på den yttre, apikala ytan av enteroiden, medan β-catenin (röd) är på den inre, basolaterala ytan (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model at JoVE.com

Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

Det nuvarande protokollet beskriver en metod som använder lucifergul i en apikal-out enteroidmodell för att bestämma tarmpermeabilitet. Denna metod kan användas för att bestämma paracellulär permeabilitet i enteroider som modellerar inflammatoriska tarmsjukdomar såsom nekrotiserande enterokolit.

Bestämning av tarmpermeabilitet med Lucifer Yellow i en apikal-out enteroidmodell

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

Att applicera Lucifer Yellow på media av apikal-out enteroider ger en enkel metod för kvantitativ och kvalitativ analys av alla tre stora paracellulära tarmpermeabilitetsvägar i en 3D-modell. Det är en relativt enkel teknik som gör att vi kan bedöma permeabilitet med hjälp av en enteroidmodell. Vi arbetar med denna teknik i våra studier av nekrotiserande enterokolit.Denna teknik kan dock vara användbar för att studera någon mänsklig tarmsjukdom med hjälp av en enteroidmodell. Att demonstrera procedurerna idag kommer att vara våra postdoktorala forskare, Dr.Tyler Leiva och Dr.Alena Golubkova, samt Camille Schlegel, forskningsassistenthandledaren från vårt laboratorium. Till att börja med kan du utöka Androids inbäddade i BMM i sju till 10 dagar med 50 % LWRN-konditionerade medier för den apikala eller AO-enteroidgenerationen.Ta bort media från runt BMM-kupolerna och tillsätt 500 mikroliter cellåtervinningslösning, eller CRS till en brunn. Skrapa kupolen, pipettera den upp och ner flera gånger för att homogenisera CRS med enteroiderna inbäddade i BMM-kupoler och lägg till denna lösning i nästa brunn. Skrapa kupolen igen och pipettera den upp och ner flera gånger innan du överför lösningen till ett mikrocentrifugrör.Tillsätt 500 mikroliter CRS till den andra brunnen, pipettera upp och ner för att blanda den väl och överför den till den första brunnen. Från den första brunnen, slå samman CRS-enteroid BMM-lösningen i samma 1,5 ml mikrocentrifugrör och upprepa denna sammanslagning för de återstående brunnarna tills innehållet i alla brunnar är i CRS. Placera mikrocentrifugrören som innehåller poolad CRS-lösning på en rotator i en timme vid fyra grader Celsius.Centrifugera sedan mikrocentrifugröret vid 200 X g i tre minuter vid fyra grader Celsius innan du tar bort supernatanten och suspenderar enteroidpelleten igen i en milliliter 50% LWRN-konditionerat medium. Överför försiktigt 500 mikroliter av den återsuspenderade enteroid- eller medielösningen till varje brunn på den ultralåga bindningsplattan 24 brunnsvävnad. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5% CO2, i tre dagar före experiment.Se till att AO-enteroider är avstängda i minst 72 timmar före användning. Överför försiktigt alla enteroider som är upphängda i media från varje brunn till ett mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 300 X g i tre minuter vid rumstemperatur och ta bort supernatanten.Tillsätt 10 mikroliter fem milligram per milliliter lipopolysackarid, eller LPS till 500 mikroliter 50% LWRN-konditionerat medium per brunn för att förbereda masterblandningen och suspendera AO-enteroidpelleten från behandlingsgruppen till 500 mikroliter LPS plus 50% LWRN-konditionerade medier. Pipettera upp och ner för att blanda noggrant. Alikvot 500 mikroliter suspension i varje brunn av en 24 brunn ultralåg fästplatta.På samma sätt suspenderas AO-enteroiderna från den obehandlade kontrollgruppen i 500 mikroliter 50% LWRN-konditionerade medier per brunn och alikvoterar 500 mikroliter av denna suspension i varje brunn i en separat 24-brunns ultralåg fästplatta. Inducera hypoxi i de LPS-behandlade AO-enteroiderna med användning av en modulär inkubatorkammare med 1% syre, 5% koldioxid och 94% kväve och inkubera enteroiderna med hypoxi och LPS i 24 timmar. Placera de obehandlade och LPS plus hypoxi, behandlade kulturerna i en 5% koldioxidinkubator i 24 timmar.För att mäta den paracellulära permeabiliteten med Lucifer Yellow eller LY, överför försiktigt enteroid- eller mediesuspensionen från varje brunn till ett mikrocentrifugrör. Varm Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning eller DPBS och 50% LWRN-konditionerade medier i ett 37 grader Celsius vattenbad. Centrifugera suspensionen vid 300 X g i tre minuter vid rumstemperatur.Ta bort mediet och tvätta enteroidpelleten med 500 mikroliter varm DPBS före centrifugering vid 300 X g i tre minuter. Ta bort supernatanten med en mikropipett och upprepa DPBS-tvättsteget en gång till. När DPBS har tvättats, tillsätt 450 mikroliter varmt 50% LWRN-konditionerat medium och tillsätt suspensionen till en 24-brunnsplatta.Tillsätt sedan 50 mikroliter 2,5 milligram per milliliter LY till varje brunn. Virvla plattan försiktigt för att blanda och placera den i en 5% koldioxidinkubator i två timmar. Pipettera försiktigt enteroidsuspensionen från varje brunn till ett mikrocentrifugrör.Centrifugera den och ta bort supernatanten som lämnar enteroidpelleten bakom sig. Tvätta pelleten med 500 mikroliter varm DPBS och centrifugera den. Ta bort supernatanten som lämnar pelleten bakom sig.Upprepa tre tvättar av DPBS innan du återupphänger pelleten med 1000 mikroliter kall DPBS och dissociera enteroiderna genom kraftig blandning med en pipett. För Lucifer Yellow-standardkurvan, förbered standarderna utspädda i DPBS enligt beskrivningen i texten. Pipettera 150 mikroliter av varje prov per brunn i tre exemplar på en 96 brunnsplatta.Mät fluorescensen vid en excitationstopp på 428 nanometer och en utsläppstopp på 536 nanometer på en fluorescensplattläsare. Beräkna koncentrationerna med hjälp av statistisk programvara och en kurva med fyra parametrar som interpolerar standardkurvan. Immunofluorescerande färgning av enteroiderna suspenderade i 50% LWRN-media i 72 timmar visade Zo-1 på den yttre apikala ytan av enteroiden, medan beta-catenin ses på den basolaterala ytan.Det indikerade den förväntade polaritetsomvandlingen av enteroider som bekräftar en AO-konformation av enteroider. Basolateral ut, eller BO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi visade signifikant ökad permeabilitet vilket visades i en Lucifer Yellow, eller LY-analys genom ökat upptag av LY-färgämne i enteroidlumen, jämfört med obehandlade kontroller. Lucifer Yellow-analysen visade också det ökade upptaget av LY i lumen hos behandlade AO-enteroider jämfört med obehandlade kontroller.Det bekräftade den ökade permeabiliteten hos AO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi, jämfört med de obehandlade kontrollerna. Det är viktigt att tvätta enteroidpellets noggrant för att säkerställa att all extraluminal LY tas bort. Det möjliggör noggrann kvantifiering av återstående intraluminal LY vid beräkning av permeabiliteten.För kvalitativ analys kan enteroider visualiseras via fluorescerande mikroskopi för LY-upptag i lumen. Efter LY-inkubation och efterföljande tvättsteg innan du tar avstånd från Microplate-avläsning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Fastställande av reaktivitet och titer av serum med hjälp av en hemagglutination analys

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Använda ägg från<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Som en<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av inälvsmask-lunginflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriskt Bakteriell invasion av tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatiskt förbättras med hjälp av en vertikal modell diffusionskammare

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i realtid konsekvens av Pneumococcal Virulensfaktorer i en akut Mus Lunginflammation Modell Använda självlysande bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor flöde flödescytometri-baserade kvantifiering av mitokondrier och lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

En roman mänskliga epitelceller Enteroid modell för nekrotiserande enterokolit

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Mänskliga Colonoid enskiktslager att studera interaktioner mellan patogener, förknippas och värd Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...