Name: modeling brain metastasis by internal carotid artery injection of cancer cells
Uploaded: 2022-08-02T15:00:00
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这项研究由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）资助，批准号为APP1162560。ML由昆士兰大学研究生研究奖学金资助。我们要感谢所有协助畜牧业和动物 体内 成像的人。我们感谢皇家布里斯班妇女医院为这项研究捐赠等分试样的锆。

所有研究均在昆士兰大学动物伦理委员会（UQCCR/186/19）和澳大利亚科学动物护理和使用守则的指导方针下进行。
1.注射用癌细胞的制备
注意：在这项研究中，使用了人乳腺癌细胞系BT-474（BT474）。BT474在完全生长培养基中培养，该培养基含有补充有10%胎牛血清和1%胰岛素的RPMI 1640培养基。将细胞保持在37°C的培养箱中，空气中有5%的二氧化碳。通...

脑转移是癌细胞从原发部位扩散到大脑的复杂过程。有不同的动物模型可以反映这个多步骤过程的某些阶段，并且设计临床前转移研究有生理和实际考虑41，42。大多数已发表的研究调查使用纳米药物进行脑转移治疗的研究都使用了心内43，44和颅内45，46，47，48，<sup ...

脑转移是一种普遍的恶性肿瘤，预后非常差1，2。脑转移患者的护理标准是多模式的，包括神经外科、全脑放疗和/或立体定向放射外科手术，具体取决于患者的一般健康状况、颅外疾病负担以及脑部肿瘤的数量和位置3，4。最多 3 个颅内病变的患者适合手术切除或立体定向放射外科手术，而建议有多个病变的患者进行全脑放疗，以避免手术相关感染和水肿的风险5.然而，全脑放疗会对放射敏感的大脑结构造成损害，导致生活质量下降6。
全身治疗是治疗多发病变患者的非侵入性替代和合乎逻辑的方法7。然而，由于长期以来认为全身治疗疗效不佳，因为通过血流被动递送细胞毒性药物无法在没有不安全毒性风险的情况下达到大脑中的治疗水平，因此较少考虑8。随着最近美国食品和药物管理局（FDA）批准的全身治疗（图卡替尼联合曲妥珠单抗和卡培他滨用于转移性HER2+乳腺癌脑转移）9，10，11，12以及治疗指南的更新，包括考虑脑转移患者的全身治疗选择，这种范式开始改变13，14。
在这种情况下，分子靶向治疗，免疫疗法和替代药物递送系统（例如靶向纳米药物载体）领域的发展可以潜在地克服脑转移治疗的挑战15，16，17，18。此外，还正在研究通过脑肿瘤屏障透化来改善药物递送的化学和机械方法19，20。为了研究和优化这些方法以适应目的，使用临床前模型至关重要，这些模型不仅反映了脑转移的复杂生理学，而且还允许对颅内药物反应进行客观分析。
从广义上讲，目前模拟体内脑转移的方法涉及心内（左心室），静脉内（通常是尾静脉），颅内或颈内（颈总动脉）注射小鼠的癌细胞21，22，23，24，25，26，27.除了肿瘤植入策略外，通过去除肿瘤抑制基因或激活癌基因触发肿瘤形成的基因工程小鼠模型可用于肿瘤建模。然而，据报道，只有少数基因工程小鼠模型产生继发性肿瘤，甚至更少可靠地产生脑转移瘤28，29，30。
植入方法，如心内（左心室）和静脉注射（通常是尾静脉）模仿癌症的全身播散。这些模型通常在多个器官（例如，脑、肺、肝、肾、脾脏）中产生病变，这取决于在循环“首次通过”期间捕获大多数肿瘤细胞的毛细血管床31。然而，不一致的脑植入率将需要更多的动物才能达到所需统计功效的样本量。通过这些心内和静脉注射方法 最终 在大脑中建立的肿瘤细胞数量是可变的。因此，脑转移肿瘤负荷可能因动物而异，进展的差异可能使标准化实验时间表和结果解释成为一项挑战。颅外肿瘤负荷可导致非脑转移死亡，使这些模型不适合评估颅内疗效。已经使用人工克隆选择过程建立了脑-热带细胞系以减少颅外建立，但摄取速率不一致，并且克隆选择过程可以降低通常在人类肿瘤中发现的异质性32。
脑特异性植入方法，如颅内和颈内注射，可实现更一致和有效的脑转移建模。在颅内方法33中，癌细胞通常被注射到额叶大脑皮层中，其产生快速且可重复的肿瘤生长，全身受累低。虽然该手术耐受性良好，死亡率低33，但需要注意的是，这是一种相对粗糙的方法，可迅速在大脑中引入（局部）细胞推注，并且不能模拟早期脑转移发病机制。针头会破坏脑组织脉管系统，然后引起局部炎症5，34。根据经验，在拔针过程中，肿瘤细胞注射有反流的趋势，导致软脑膜受累。或者，颈内方法将细胞输送到颈总动脉中，脑微脉管系统作为遇到的第一个毛细血管床，模拟循环、外渗和定植的存活率24。与其他人一致25，我们使用这种方法的经验发现，由于癌细胞通过颈外动脉 无意 中递送到这些组织中的毛细血管床，它可能导致面部肿瘤（未发表的数据）。通过在颈总动脉注射之前首先结扎颈外动脉可以预防面部肿瘤（图1）。在本文的其余部分，这种方法被称为“颈内动脉注射”。根据经验，颈内动脉注射方法始终如一地产生脑转移，全身性事件很少，并且已成功生成不同原发性癌症（例如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌）的脑转移模型（图 1）。缺点是它在技术上具有挑战性、耗时、侵入性强，并且需要仔细优化细胞数量和监测时间表。总之，颅内和颈内动脉注射方法都产生了适合评估对脑肿瘤相关生存益处的治疗影响的小鼠模型。
该协议描述了颈内动脉注射方法，以产生几乎没有全身参与的脑转移小鼠模型，因此适用于药物分布和实验疗法疗效的临床前评估。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64216/64216fig01.jpg"> 图1：脑转移的颈内动脉注射方案示意图。 颈内动脉注射与颈外动脉结扎可以可靠地产生来自各种原发性癌症的脑转移模型。在该协议中，三个结扎放置在颈动脉上（图中注释为L1-L3）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64216/64216fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Microlance needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>23748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31G Ultra-Fine II insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>326103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>T67A-SS</td>
			<td>Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal heat mat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic and antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (TEMGESIC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet-76A</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear puncher</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine angled forceps</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>DEF11063-07</td>
			<td>Angled 45&#176;, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Low lint disposable wipers</td>
			<td>Kimberly Clark- Kimwipes</td>
			<td>Z188964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mashed mouse chow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (METACAM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fashioned out of a microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)</td>
			<td>&#160;Bausch and lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Betadine</td>
			<td>2505692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE (glove, mask, gown, hairnet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>JJ-640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile normal saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TM4469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A chopping board wrapped with autoclavable bag.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>T104</td>
			<td>Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture forcep/ Curved Brophy forceps</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>T113C</td>
			<td>Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>TC1322-180</td>
			<td>length 190 mm, ratchet clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flask</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trigene II surface disinfectant</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express dissociating medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling brain metastasis by internal carotid artery injection of cancer cells

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。转移性疾病的关键方面，例如复杂的神经微环境和基质细胞相互作用，不能完全通过 体外 测定复制;因此，动物模型对于研究和理解治疗干预的效果至关重要。然而，大多数脑肿瘤异种移植方法在时间框架和肿瘤负荷方面不能一致地产生脑转移。通过心内注射癌细胞产生的脑转移模型可导致意外的颅外肿瘤负荷，并导致非脑转移发病率和死亡率。虽然颅内注射癌细胞可以限制颅外肿瘤的形成，但它有几个注意事项，例如注射的细胞经常在注射部位形成单一的肿瘤肿块，高软脑膜受累，以及在针刺穿透过程中脑血管系统受损。该协议描述了由颈内动脉注射产生的脑转移的小鼠模型。该方法在没有其他器官参与的情况下持续产生颅内肿瘤，从而能够评估脑转移的治疗剂。

颈总动脉注射联合或不联合颈外动脉结扎术的比较 当通过颈总动脉 注射 癌细胞而不首先结扎颈外动脉24时，在77.8%的移植小鼠中发现了面部肿瘤（n = 7/9动物）。面部肿瘤的一个例子如 补充图3所示。本协议中描述的方法通过在颈总动脉之前结扎颈外动脉来防止意外的面部转移。
为了比较这两种方法，将凝集素注射到...

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Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。大多数脑转移小鼠模型因全身转移而复杂化，混淆死亡率和治疗干预结果的分析。这里介绍的是颈动脉内注射癌细胞的方案，该方案产生一致的颅内肿瘤和最小的全身性肿瘤。

通过颈内动脉注射癌细胞模拟脑转移

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

那么为什么这个协议很重要呢？好吧，脑转移瘤的治疗非常具有挑战性，并且该协议产生了具有最小颅外肿瘤的临床相关小鼠模型。该技术可以客观分析颅内肿瘤的药物分布和反应。该技术的主要优点是该模型具有高度可重复性，并且在注射后相对较短的时间内发展脑转移。动物之间的疾病进展相似，使研究人员更容易标准化实验、治疗时间表和终点。我对初学者的建议是练习使用镊子和注射器，同时通过解剖显微镜观察，熟悉颈部周围的解剖标志并在兽医在场的情况下练习协议。首先使用10毫升完全生长培养基将BT-474癌细胞以两倍10的接种密度接种到六个细胞的T-75烧瓶中，直到细胞达到70%至80%的汇合度后再注射。注射当天，弃去生长培养基，用PBS洗涤细胞单层两次，加入5毫升预热的细胞培养解离试剂。在 37 摄氏度下孵育五分钟或直到细胞脱落。五分钟后，从培养箱中取出烧瓶并轻轻敲击以帮助细胞分离。加入五毫升含有10%FBS的完全生长培养基以淬灭解离试剂活性。通过移液轻轻重悬溶液中的细胞以减少细胞团块。将细胞悬液转移到50毫升管中，并在室温下以180G离心三分钟。倒出上清液并将细胞沉淀重悬于不含钙和镁的 10 毫升 HBSSS 中，以尽量减少细胞结块。在室温下以180G离心细胞悬液三分钟，倒出上清液以除去残留的血清或解离试剂，并将细胞沉淀重悬于3毫升HBSS中。将 100 微米的细胞过滤器放在新鲜的 50 毫升锥形管上，并通过细胞悬液以去除细胞团块。使用台盼蓝计算活细胞的数量，并用HBSS将细胞悬液稀释至细胞浓度为2.5乘以10至每毫升六个细胞。将管子水平放在冰上，并定期轻轻摇动管子以尽量减少结块。细胞悬液可以在冰上储存最多六个小时。用于识别的耳孔鼠标，并使用电动剪从颈部区域剃掉皮毛。用胶带清洁裸露皮肤上多余的毛发。将眼部润滑剂涂抹在眼睛上以防止干燥。使用粘在手术板上的线钩住上门牙，然后用胶带固定前腿和后腿，从而轻轻地固定鼠标。这一步在手术过程中伸展身体并保持颈部伸直。对于术前皮肤准备，用局部消毒剂（如聚维酮碘）擦拭颈部，以减少皮肤微生物群落负荷并去除松散的毛发。从皮肤中心清洁，向外工作以防止切口部位再次污染。使用70%乙醇重复该过程，并交替进行三轮碘和乙醇消毒。在继续手术之前，通过捏伤测试检查反射以确保麻醉死亡。在动物身上铺上无菌手术布。在解剖显微镜下，用剪刀沿着小鼠颈部区域的中线做一个垂直的15毫米切口，从下颌下方5毫米开始到胸廓入口。使用两对倾斜的镊子，分开皮肤和下面的唾液腺，并应用牵开器以保持气管暴露。使用两对细角镊子，钝性地解剖气管附近的肌肉和脂肪组织，露出右颈动脉鞘。颈动脉鞘是覆盖颈总动脉、静脉和迷走神经的纤维层，该束可通过鲜红色的颈总动脉可见。清除颈总动脉尾部的一部分到周围筋膜的颈动脉分叉处，并将其与迷走神经和静脉分开。从周围神经和筋膜中分离并清除颈动脉分叉。将细镊子放在颈外动脉下方，并在动脉下方进行5-0丝线缝合。打结并收紧缝合线并切断多余的线。将细镊子放在颈总动脉下，并在动脉下进行5-0丝线缝合。打一个结，并在建议的注射部位附近的位置收紧缝合线。剪开多余的缝合线，留下约10毫米的线。切割并润湿一条约 10 x 5 毫米的低绒毛一次性雨刷。折叠条并将其放置在建议的注射部位的颈动脉下方。这将在注射过程中支撑容器。在拟议的注射部位的颈总动脉口，放置第三个松结结。只有在注射后才会收紧。轻轻搅拌细胞悬液，用31号针头将200微升细胞悬液吸入胰岛素注射器中。将注射器装入连接到激活脚踏板的注射器驱动器中。用 31 号针头将细插管连接到注射器并灌注管路。检查颈动脉位置是否良好并加压。使用两个细角镊子，一个轻轻张紧到第一个结扎的末端，另一个握住 31 号针，慢慢地将针头与斜面向上插入血管腔，注意不要刺穿它。以每秒10微升的速度缓慢将先前制备的100微升细胞悬液注入颈总动脉。这将向第五个细胞输送2.5乘以10进入血管。成功的注射可以通过清除颈动脉血管中的血液来可视化。拔出针头后立即轻轻提起并收紧松散的结扎，以防止回流和出血。修剪多余的缝合线并取下一块湿润的低绒毛一次性雨刷。使用 P-200 移液器，用 150 至 200 微升无菌水或生理盐水冲洗手术腔两次。检查出血后，将软组织、唾液腺和皮肤重新定位在颈动脉和气管上。使用缝合针架，镊子和可吸收或不可吸收的6-0单丝缝合线以连续模式关闭切口的皮肤层。通过皮下注射注射每公斤丁丙诺啡50微克和每公斤美洛昔康1毫克作为术后疼痛缓解。将动物移至温暖干净的笼子中以从麻醉中恢复。将凝集素注射到小鼠的颈总动脉中，有或没有颈外动脉结扎。当颈外动脉结扎时，在脸颊组织中观察到凝集素减少。结果显示，结扎不影响大脑输送。使用表达荧光素酶的HER2扩增的乳腺癌细胞系监测肿瘤进展。BT474脑转移模型显示，从颈动脉内注射后第五周开始，生物发光信号增加，此后逐渐增加。从第五周到第八周，异质信号强度提示颅内肿瘤伴有复杂的液体灌注。肿瘤区域内的钆浓度随着钆从血液循环泄漏到肿瘤组织中而增加。与未受累的脑区域相比，在肿瘤区域检测到更高的纳米药物水平，证实了BT-474小鼠中纳米药物和脑转移的积累。随着BT-474脑转移模型的进展，动物开始减轻高达20%的体重，使注射后九周的中位生存时间。组织学结果描述肿瘤是单侧定位的，与颈动脉注射部位相匹配，其中肿瘤大多显示为固体孤立肿块。经常观察到空旷的空间口袋，由坏死细胞组成，而一些动物中也存在较小的生长物。尝试该方案时要记住的最重要的事情是在插入针头之前正确准备和定位颈动脉，然后在插入针头期间施加适当的张力。该模型对于探索药物输送到大脑以及治疗脑转移的新疗法的疗效的研究人员很有用。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

科研

癌症研究

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

门静脉注射模型来研究肝转移乳腺癌

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

颈动脉肿瘤细胞注射，产生脑转移瘤小鼠模型

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

通过将表达的腺病毒注射到小鼠乳腺腺中,模拟乳腺癌

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

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