Name: modeling brain metastasis by internal carotid artery injection of cancer cells
Uploaded: 2022-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC), Fördernummer APP1162560, finanziert. ML wurde durch ein UQ-Postgraduierten-Forschungsstipendium finanziert. Wir möchten uns bei allen bedanken, die bei der Tierhaltung und in vivo Bildgebung der Tiere geholfen haben. Wir danken dem Royal Brisbane and Women's Hospital für die Spende von Zirkonium-Aliquots für diese Studie.

Alle Studien wurden innerhalb der Richtlinien des Animal Ethics Committee der University of Queensland (UQCCR/186/19) und des Australian Code for the Care and Use of Animals for Science Purpose durchgeführt.
1. Vorbereitung von Krebszellen für die Injektion
HINWEIS: In dieser Studie wurde die menschliche Brustkrebszelllinie BT-474 (BT474) verwendet. BT474 wurde in einem vollständigen Wachstumsmedium kultiviert, das RPMI 1640-Medium umfasste, ergän...

Hirnmetastasierung ist ein komplexer Prozess von Krebszellen, die sich von ihrem primären Ort zum Gehirn ausbreiten. Es stehen verschiedene Tiermodelle zur Verfügung, die bestimmte Stadien dieses mehrstufigen Prozesses widerspiegeln, und es gibt physiologische und praktische Überlegungen zur Gestaltung präklinischer Metastasenstudien41,42. Die meisten veröffentlichten Studien, die den Einsatz von Nanomedizin zur Behandlung von Hirnmetastasen untersuchen, hab...

Hirnmetastasen sind eine weit verbreitete Malignität, die mit einer sehr schlechten Prognose einhergeht 1,2. Der Behandlungsstandard für Patienten mit Hirnmetastasen ist multimodal und besteht aus Neurochirurgie, Ganzhirnstrahlentherapie und/oder stereotaktischer Radiochirurgie, abhängig vom allgemeinen Gesundheitszustand der Patienten, der extrakraniellen Krankheitslast und der Anzahl und Lage der Tumoren im Gehirn 3,4. Patienten mit bis zu drei intrakraniellen Läsionen kommen für eine chirurgische Resektion oder stereotaktische Radiochirurgie in Frage, während eine Ganzhirnstrahlentherapie für Patienten mit mehreren Läsionen empfohlen wird, um das Risiko einer chirurgischen Infektion und eines Ödems zu vermeiden5. Die Ganzhirn-Strahlentherapie kann jedoch strahlenempfindliche Hirnstrukturen schädigen und zu einer schlechten Lebensqualität beitragen6.
Die systemische Therapie ist ein nicht-invasiver alternativer und logischer Ansatz zur Behandlung von Patienten mit multiplen Läsionen7. Es wird jedoch aufgrund der seit langem bestehenden Vorstellung, dass systemische Therapien eine schlechte Wirksamkeit haben, weniger berücksichtigt, da die passive Verabreichung von Zytostatika über den Blutkreislauf keine therapeutischen Werte im Gehirn ohne das Risiko einer unsicheren Toxizität erreichen kann8. Dieses Paradigma beginnt sich mit der kürzlich von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen systemischen Therapie (Tucatinib mit Trastuzumab und Capecitabin indiziert für metastasierende HER2+-Brustkrebs-Hirnmetastasen)9,10,11,12 und der Aktualisierung der Behandlungsleitlinien zu ändern, um systemische Therapieoptionen für Hirnmetastasenpatientinnen einzubeziehen13,14.
In diesem Zusammenhang können Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen zielgerichteten Therapie, Immuntherapie und alternativer Wirkstoffabgabesysteme, wie z. B. eines gezielten Nano-Wirkstoffträgers, möglicherweise die Herausforderungen der Behandlung von Hirnmetastasen überwinden15,16,17,18. Darüber hinaus werden chemische und mechanische Ansätze zur Verbesserung der Wirkstoffabgabe durch Permeabilisierung der Hirntumorschranke untersucht19,20. Um solche Ansätze zu untersuchen und zu optimieren, ist es entscheidend, präklinische Modelle zu verwenden, die nicht nur die komplexe Physiologie der Hirnmetastasierung widerspiegeln, sondern auch eine objektive Analyse der intrakraniellen Arzneimittelreaktion ermöglichen.
Im Großen und Ganzen umfassen die aktuellen Ansätze zur Modellierung der Hirnmetastasierung in vivo die intrakardiale (linke Ventrikel), intravenöse (normalerweise Schwanzvene), intrakranielle oder intracarotis (gemeinsame Halsschlagader) Injektion von Krebszellen bei Mäusen 21,22,23,24,25,26,27 . Neben Tumortransplantationsstrategien sind gentechnisch veränderte Mausmodelle, bei denen die Tumorbildung durch die Entfernung von Tumorsuppressorgenen oder die Aktivierung von Onkogenen ausgelöst wird, für die Tumormodellierung nützlich. Es wird jedoch nur berichtet, dass nur wenige gentechnisch veränderte Mausmodelle sekundäre Tumore produzieren und noch weniger, die zuverlässig Hirnmetastasen produzieren28,29,30.
Engraftment-Methoden wie intrakardiale (linker Ventrikel) und intravenöse (meist Schwanzvene) Injektion ahmen die systemische Verbreitung von Krebs nach. Diese Modelle erzeugen typischerweise Läsionen in mehreren Organen (z. B. Gehirn, Lunge, Leber, Nieren, Milz), abhängig vom Kapillarbett, das die meisten Tumorzellen während ihres Kreislaufdurchgangs einfängt31. Inkonsistente Raten der Hirntransplantation erfordern jedoch mehr Tiere, um die Stichprobengröße für die gewünschte statistische Aussagekraft zu erreichen. Die Anzahl der Tumorzellen, die sich schließlich über diese intrakardialen und intravenösen Injektionsverfahren im Gehirn etablieren, ist variabel. Daher kann die Tumorlast der Hirnmetastasierung zwischen den Tieren variieren, und der Unterschied in der Progression kann die Standardisierung des experimentellen Zeitplans und die Interpretation der Ergebnisse zu einer Herausforderung machen. Die extrakranielle Tumorlast kann zu einer Mortalität ohne Hirnmetastasen führen, wodurch diese Modelle für die Bewertung der intrakraniellen Wirksamkeit ungeeignet sind. Gehirntropische Zelllinien wurden unter Verwendung künstlicher klonaler Selektionsprozesse etabliert, um die extrakranielle Etablierung zu reduzieren, aber die Aufnahmeraten waren inkonsistent, und der klonale Selektionsprozess kann die Heterogenität reduzieren, die normalerweise in menschlichen Tumoren gefunden wird32.
Gehirnspezifische Engraftment-Methoden wie die intrakranielle und intrakarotis-Injektion ermöglichen eine konsistentere und effizientere Hirnmetastasenmodellierung. Bei der intrakraniellen Methode33 werden typischerweise Krebszellen in die frontale Großhirnrinde injiziert, wodurch ein schnelles und reproduzierbares Tumorwachstum mit geringer systemischer Beteiligung erzeugt wird. Während das Verfahren bei niedriger Mortalität gut vertragen wird33, besteht der Vorbehalt darin, dass es sich um einen relativ groben Ansatz handelt, der schnell einen (lokalisierten) Bolus von Zellen im Gehirn einführt und keine frühe Hirnmetastasenpathogenese modelliert. Die Nadel schädigt das Gefäßsystem des Hirngewebes, was dann eine lokalisierte Entzündung verursacht 5,34. Erfahrungsgemäß besteht die Tendenz, dass Tumorzellen während der Entfernung der Nadel zum Reflux injizieren, was zu einer leptomeningealen Beteiligung führt. Alternativ bringt die intracarotis Methode Zellen in die gemeinsame Halsschlagader mit der Mikrovaskulatur des Gehirns als erstes Kapillarbett, das angetroffen wird, wodurch das Überleben im Kreislauf, die Extravasation und die Kolonisation modelliertwerden 24. In Übereinstimmung mit anderen25 ergab unsere Erfahrung mit dieser Methode, dass es aufgrund der unbeabsichtigten Abgabe von Krebszellen über die äußere Halsschlagader zu Kapillarbetten in diesen Geweben zu Gesichtstumoren kommen kann (unveröffentlichte Daten). Es ist möglich, Gesichtstumoren vorzubeugen, indem zuerst die äußere Halsschlagader vor der gemeinsamen Injektion der Halsschlagader ligiert wird (Abbildung 1). Im Rest des Artikels wird diese Methode als "Injektion der inneren Halsschlagader" bezeichnet. Erfahrungsgemäß erzeugt die Injektionsmethode der inneren Halsschlagader konsequent Hirnmetastasen mit sehr wenigen systemischen Ereignissen und war erfolgreich bei der Erzeugung von Hirnmetastasenmodellen verschiedener primärer Krebsarten (z. B. Melanom-, Brust- und Lungenkrebs) (Abbildung 1). Die Nachteile sind, dass es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig, invasiv ist und eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen und einen Überwachungszeitplan erfordert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl die intrakraniellen als auch die internen Karotis-Injektionsmethoden Mausmodelle hervorbringen, die sich für die Bewertung der therapeutischen Auswirkungen auf den Überlebensvorteil von Hirntumoren eignen.
Dieses Protokoll beschreibt die interne Karotis-Injektionsmethode, um ein Mausmodell der Hirnmetastasierung fast ohne systemische Beteiligung zu erstellen und daher für die präklinische Bewertung der Arzneimittelverteilung und Wirksamkeit experimenteller Therapeutika geeignet zu sein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64216/64216fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Injektionsprotokolls für die interne Halsschlagader für Hirnmetastasen. Die Injektion der internen Halsschlagader mit einer Ligatur der äußeren Halsschlagader kann zuverlässig ein Hirnmetastasenmodell aus verschiedenen primären Krebsarten erzeugen. In diesem Protokoll werden drei Ligaturen auf die Halsschlagader gelegt (in der Abbildung als L1-L3 annotiert). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64216/64216fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Microlance needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>23748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31G Ultra-Fine II insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>326103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>T67A-SS</td>
			<td>Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal heat mat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic and antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (TEMGESIC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet-76A</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear puncher</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine angled forceps</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>DEF11063-07</td>
			<td>Angled 45&#176;, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Low lint disposable wipers</td>
			<td>Kimberly Clark- Kimwipes</td>
			<td>Z188964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mashed mouse chow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (METACAM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose cone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fashioned out of a microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)</td>
			<td>&#160;Bausch and lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Betadine</td>
			<td>2505692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE (glove, mask, gown, hairnet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>JJ-640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile normal saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TM4469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A chopping board wrapped with autoclavable bag.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>T104</td>
			<td>Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture forcep/ Curved Brophy forceps</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>T113C</td>
			<td>Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>TC1322-180</td>
			<td>length 190 mm, ratchet clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flask</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trigene II surface disinfectant</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express dissociating medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling brain metastasis by internal carotid artery injection of cancer cells

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Kritische Aspekte metastasierender Erkrankungen, wie die komplexe neuronale Mikroumgebung und die Stromazellinteraktion, können mit In-vitro-Assays nicht vollständig repliziert werden. Daher sind Tiermodelle entscheidend für die Untersuchung und das Verständnis der Auswirkungen therapeutischer Interventionen. Die meisten Xenografting-Methoden für Hirntumore erzeugen jedoch keine konsistenten Hirnmetastasen in Bezug auf den Zeitrahmen und die Tumorlast. Hirnmetastasenmodelle, die durch intrakardiale Injektion von Krebszellen generiert werden, können zu einer unbeabsichtigten extrakraniellen Tumorlast führen und zu nicht-hirnmetastasierender Morbidität und Mortalität führen. Obwohl die intrakranielle Injektion von Krebszellen die extrakranielle Tumorbildung einschränken kann, hat sie mehrere Vorbehalte, wie die injizierten Zellen bilden häufig eine einzelne Tumormasse an der Injektionsstelle, eine hohe leptomeningeale Beteiligung und eine Schädigung des Hirngefäßsystems während der Nadelpenetration. Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Hirnmetastasierung, die durch Injektion der inneren Halsschlagader erzeugt wird. Diese Methode erzeugt intrakranielle Tumoren konsequent ohne Beteiligung anderer Organe, was die Beurteilung von Therapeutika für Hirnmetastasen ermöglicht.

Vergleich der Injektion der Halsschlagader mit oder ohne Ligatur der Arteria carotis extern Wenn Krebszellen über die gemeinsame Halsschlagader injiziert wurden, ohne vorher die äußere Halsschlagader zu ligieren24, wurden bei 77,8% der transplantierten Mäuse Gesichtstumoren gefunden (n = 7/9 Tiere). Ein Beispiel für einen Gesichtstumor ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode verhindert...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells at JoVE.com

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Die meisten Hirnmetastasen-Mausmodelle werden durch systemische Metastasen kompliziert, die die Analyse der Mortalität und der therapeutischen Interventionsergebnisse verwirren. Hier wird ein Protokoll für die interne Karotisinjektion von Krebszellen vorgestellt, das konsistente intrakranielle Tumoren mit minimalen systemischen Tumoren erzeugt.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Warum ist dieses Protokoll wichtig? Nun, Hirnmetastasen sind sehr schwierig zu behandeln und dieses Protokoll erzeugt ein klinisch relevantes Mausmodell mit minimalen extrakraniellen Tumoren. Diese Technik ermöglicht eine objektive Analyse der Medikamentenverteilung und des Ansprechens von intrakraniellen Tumoren.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Modell sehr gut reproduzierbar ist und sich die Hirnmetastasen in relativ kurzer Zeit nach der Injektion entwickeln. Der Krankheitsverlauf ist bei Tieren ähnlich, was es den Forschern erleichtert, die Experimente, Behandlungszeitpläne und Endpunkte zu standardisieren. Mein Rat für Anfänger ist, die Verwendung der Pinzette und der Spritze zu üben, während Sie durch das Dissektionsmikroskop schauen, sich mit den anatomischen Landmarken um den Hals vertraut machen und das Protokoll in Anwesenheit eines Tierarztes üben.Beginnen Sie mit der Aussaat von BT-474-Krebszellen mit einer Seeding-Dichte von zwei mal 10 zu den sechs Zellen in einen T-75-Kolben mit 10 Milliliter komplettem Wachstumsmedium und -kultur, bis die Zellen vor der Injektion einen Konfluency von 70 bis 80% erreichen. Verwerfen Sie am Tag der Injektion Wachstumsmedien und waschen Sie die Zellmonoschicht zweimal mit PBS und fügen Sie fünf Milliliter vorgewärmtes Zellkultur-Dissoziationsreagenz hinzu. Bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren oder bis sich die Zellen gelöst haben.Nach fünf Minuten den Kolben aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig darauf klopfen, um die Zellablösung zu unterstützen. Fügen Sie fünf Milliliter komplettes Wachstumsmedium mit 10% FBS hinzu, um die Dissoziationsreagenzaktivität zu löschen. Resuspendieren Sie die Zellen in der Lösung vorsichtig durch Pipettieren, um Zellklumpen zu reduzieren.Die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben und bei 180 G drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter HBSSS ohne Kalzium und Magnesium, um die Zellverklumpung zu minimieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 180 G für drei Minuten bei Raumtemperatur Dekantieren Sie den Überstand, um Restserum oder Dissoziationsreagenz zu entfernen und das Zellpellet in drei Milliliter HBSS zu resuspendieren.Legen Sie ein 100-Mikrometer-Zellsieb auf ein frisches 50-Milliliter-konisches Röhrchen und führen Sie die Zellsuspension durch, um Zellklumpen zu entfernen. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und verdünnen Sie die Zellsuspension mit HBSS auf eine Zellkonzentration von 2,5 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter. Halten Sie das Rohr waagerecht auf Eis und schaukeln Sie das Rohr regelmäßig vorsichtig, um ein Verklumpen zu minimieren.Die Zellsuspension kann maximal sechs Stunden auf Eis gelagert werden. Ear-Punch-Maus zur Identifizierung und verwenden Sie elektrische Haarschneider, um das Fell aus dem Halsbereich zu rasieren. Reinigen Sie überschüssiges Haar von der exponierten Haut mit Klebeband.Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Sichern Sie die Maus vorsichtig, indem Sie die oberen Schneidezähne mit einem Faden einhaken, der auf das OP-Brett geklebt ist, gefolgt von Kleben der Vorder- und Hinterbeine. Dieser Schritt verlängert den Körper und hält den Hals während des Eingriffs gerade.Für die präoperative Hautvorbereitung wischen Sie den Hals mit einem topischen Antiseptikum wie Povidonjod ab, um die Belastung der Hautmikroflora zu reduzieren und loses Haar zu entfernen. Reinigen Sie von der Mitte der Haut und arbeiten Sie nach außen, um eine Rekontamination der Inzisionsstelle zu verhindern. Wiederholen Sie den Vorgang mit 70% Ethanol und führen Sie drei abwechselnde Runden Jod und Ethanol zur Desinfektion durch.Überprüfen Sie den Reflex über den Pinch-Test, um den Tod der Anästhesie sicherzustellen, bevor Sie den Eingriff fortsetzen. Legen Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang über das Tier. Machen Sie unter dem Dissektionsmikroskop einen vertikalen 15-Millimeter-Schnitt entlang der Mittellinie im Halsbereich der Maus mit einer Schere, beginnend von fünf Millimetern unterhalb des Kiefers bis zum Thoraxeinlass.Verwenden Sie zwei Paar abgewinkelte Pinzetten, teilen Sie die Haut und die darunter liegenden Speicheldrüsen und tragen Sie Retraktoren auf, um die Luftröhre freizulegen. Mit zwei Paar fein abgewinkelter Pinzetten das Muskel- und Fettgewebe neben der Luftröhre stumpf sezieren, um die rechte Halsschlagader freizulegen. Die Karotisscheide ist die fibröse Schicht, die die gemeinsame Halsschlagader, die Vene und den Vagusnerv bedeckt, und dieses Bündel kann durch die leuchtend rote gemeinsame Halsschlagader sichtbar gemacht werden.Reinigen Sie ein Segment der Arteria carotis caudal zur Karotisbifurkation der umgebenden Faszie und trennen Sie es vom Vagusnerv und den Venen. Isolieren und reinigen Sie die Karotisbifurkation von den umgebenden Nerven und Faszien. Positionieren Sie die feine Pinzette unter der äußeren Halsschlagader und führen Sie eine 5-0-Seidennaht unter die Arterie.Knoten und straffen Sie die Naht und schneiden Sie überschüssige Linie. Positionieren Sie die feine Pinzette unter der Arteria carotis communis und führen Sie eine 5-0-Seidennaht unter die Arterie. Binden Sie einen Knoten und ziehen Sie die Naht an einer Position in der Nähe der vorgeschlagenen Injektionsstelle fest.Schneiden Sie die überschüssige Naht ab und lassen Sie etwa 10 Millimeter der Linie übrig. Schneiden und befeuchten Sie einen Streifen flusenarmer Einwegwischer etwa 10 x 5 Millimeter. Falten Sie den Streifen und legen Sie ihn unter die Halsschlagader an der vorgeschlagenen Injektionsstelle.Dies stützt das Gefäß während der Injektion. Legen Sie auf der gemeinsamen Halsschlagader rostral zur vorgeschlagenen Injektionsstelle eine dritte Ligatur mit einem losen Knoten. Dies wird erst nach der Injektion gestrafft.Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig und ziehen Sie 200 Mikroliter Zellsuspension mit einer 31-Gauge-Nadel in eine Insulinspritze. Legen Sie die Spritze in den Spritzentreiber, der mit einem aktivierenden Fußpedal verbunden ist. Befestigen Sie eine feine Kanüle mit einer 31-Gauge-Nadel an der Spritze und bereiten Sie die Leine vor.Überprüfen Sie, ob die Halsschlagader gut positioniert und unter Druck steht. Mit zwei feinwinkligen Pinzetten, von denen eine sanft auf das Ende der ersten Ligatur gespannt wird und die andere die 31-Gauge-Nadel hält, führen Sie die Nadel mit der Abschrägung langsam in das Lumen des Blutgefäßes ein und achten Sie darauf, sie nicht zu punktieren. Injizieren Sie langsam 100 Mikroliter zuvor vorbereitete Zellsuspension mit 10 Mikrolitern pro Sekunde in die gemeinsame Halsschlagader.Dies wird 2,5 mal 10 an die fünften Zellen in das Blutgefäß liefern. Eine erfolgreiche Injektion kann durch die Reinigung von Blut aus dem Halsschlagadergefäß visualisiert werden. Heben und straffen Sie die lockere Ligatur sofort nach dem Ziehen der Nadel vorsichtig, um Rückfluss und Blutungen zu vermeiden.Schneiden Sie überschüssige Nähte ab und entfernen Sie das Stück angefeuchteter Einwegwischer mit geringem Fussel. Spülen Sie den Operationshohlraum mit einer P-200-Pipette zweimal mit 150 bis 200 Mikrolitern sterilem Wasser oder Kochsalzlösung aus. Nach der Überprüfung auf Blutungen positionieren Sie das Weichgewebe, die Speicheldrüsen und die Haut über der Halsschlagader und der Luftröhre.Verschließen Sie die Hautschicht des Einschnitts mit einem Nahtnadelhalter, einer Pinzette und einer resorbierbaren oder nicht resorbierbaren 6-0-Monofilamentnaht in einem kontinuierlichen Muster. Injizieren Sie 50 Mikrogramm pro Kilogramm Buprenorphin und ein Milligramm pro Kilogramm Meloxicam durch subkutane Injektion als postoperative Schmerzlinderung. Bringen Sie das Tier in einen warmen und sauberen Käfig, um sich von der Narkose zu erholen.Lektin wurde in die gemeinsame Halsschlagader der Mäuse mit oder ohne externe Ligerie der Halsschlagader injiziert. Eine Reduktion des Lektins wurde im Wangengewebe beobachtet, wenn die äußere Halsschlagader ligiert war. Die Ergebnisse zeigten, dass die Ligatur keinen Einfluss auf die Gehirnabgabe hatte.Die Tumorprogression wurde mit Hilfe der Luciferase-exprimierenden, HER2-amplifizierten Brustkrebszelllinie überwacht. Das BT474-Hirnmetastasenmodell zeigte einen Anstieg der biolumineszierenden Signale ab der fünften Woche nach der internen Karotisinjektion und wuchs danach progressiv. Von Woche fünf bis acht deutete die heterogene Signalintensität auf einen intrakraniellen Tumor mit komplexer Flüssigkeitsperfusion hin.Die Gadoliniumkonzentration innerhalb der Tumorregion nahm zu, als sie aus dem Blutkreislauf in das Tumorgewebe austrat. Die Anhäufung von Nanomedizin und Hirnmetastasen wurde bei den BT-474-Mäusen durch höhere Nanomedizinspiegel bestätigt, die in der Tumorregion im Vergleich zu den unbeteiligten Hirnregionen nachgewiesen wurden. Als das BT-474-Hirnmetastasenmodell voranschritt, begannen die Tiere bis zu 20% Körpergewicht zu verlieren, so dass die mediane Überlebenszeit neun Wochen nach der Injektion betrug.Die histologischen Ergebnisse zeigten, dass die Tumoren einseitig lokalisiert wurden und mit der Stelle der Karotisinjektion übereinstimmten, wo die Tumoren meist als feste, solitäre Massen auftraten. Taschen mit leeren Räumen wurden häufig beobachtet und bestanden aus nekrotischen Zellen, während bei einigen Tieren auch kleinere Auswüchse vorhanden waren. Das Wichtigste, woran Sie sich beim Versuch des Protokolls erinnern sollten, ist, die Halsschlagader vor dem Einführen der Nadel richtig vorzubereiten und zu positionieren und dann während des Einführens der Nadel die richtige Spannung anzuwenden.Dieses Modell ist nützlich für Forscher, die die Medikamentenabgabe an das Gehirn und die Wirksamkeit der neuen Therapeutika zur Behandlung von Hirnmetastasen untersuchen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Forschung

Krebsforschung

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mit Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Portalveneninjektion von Darmkrebs-Organoiden zur Untersuchung der Lebermetastasierung Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...