Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

我们感谢 Sanchez-Gurmaches 和 Wallace 实验室成员的宝贵讨论。这项工作得到了美国心脏协会（18CDA34080527 给 JSG 和 19POST34380545 给 RM）、NIH（R21OD031907到 JSG）、CCHMC 受托人奖、CCHMC 儿科基因组学中心奖和 CCHMC 孟德尔基因组学与治疗中心奖的资助。这项工作得到了辛辛那提消化系统疾病研究中心的NIH P30 DK078392的部分支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。RT 和 MW 得到了 UCD Ad Astra 奖学金的支持。

所有实验均由辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. D2O的制备
注意：为避免实验变化，在实验期间为所有小鼠准备足够的溶液/饮用水。
<ol><li>对于腹膜内注射：通过溶解每升D 2 O中的9g NaCl，产生0.9%w / v盐水D2O.通过非热原0.2μm过滤器过滤以灭菌。</li>
	<li>饮用 D 2 O 水：每 920 mL 普通饮用水混?...

了解复杂代谢途径之间的平衡和相互作用是理解代谢相关疾病生物学基础不可或缺的一步。在这里，我们展示了一种非侵入性且廉价的方法来确定从头脂肪酸合成的变化。该方法改编自先前发表的方法，这些方法开发了用于估计脂肪酸氘富集的从头合成通量的计算31 和使用氘-丙酮交换来确定体内水中 D2O 的相对百分比39。近年来，我们采用...

肥胖和相关代谢疾病是一种危害今世后代的流行病 1,2.通常简化为能量摄入和消耗之间不平衡的结果，与肥胖相关的代谢失调会影响大量由环境和内源性因素控制的代谢途径3.然而，只有少数途径在代谢失调的动物模型中常规测试。
例如，葡萄糖处理通常通过葡萄糖和胰岛素耐量试验来测量，这可能是由于使用便携式血糖监测仪的简单性4。全身葡萄糖和脂质氧化的相对速率也根据间接量热测定的呼吸交换比率常规估计 5,6。然而，代谢的大多数其他方面都没有常规进行功能评估。这导致对代谢状态的不完整解释和错过治疗选择。其中一种主要的途径是从头脂肪生成。
从头脂肪生成（DNL）是从前体产生新脂肪酸的过程。葡萄糖被认为是导致全身 DNL7 的主要前体，但其他前体，如乙酸盐、果糖、乳酸和支链氨基酸，已被证明是空间和条件依赖性方式相关的碳源 8,9,10,11,12。DNL 是代谢稳态的关键贡献者，对正常发育至关重要13.此外，DNL 的改变与癌症 14,15 和代谢 16,17,18 以及心血管疾病 19,20 有关。
DNL 通路由核心酶促成分 ATP 柠檬酸裂解酶 （ACLY）、乙酰辅酶 A 羧化酶 （ACC1/2） 和脂肪酸合酶 （FAS） 组成，主要产生棕榈酸酯，一种 16 碳饱和脂肪酸。然而，奇链和支链脂肪酸也可以以较低的速率产生9。延伸酶和去饱和酶进一步修饰这些脂肪酸，产生多种脂肪酸种类，可用于多种功能（例如，长期能量储存和操纵膜流动性）。
DNL酶机制的表达受少量转录因子的控制。迄今为止描述最充分的包括甾醇调节元件结合蛋白 （SREBP） 家族、碳水化合物反应元件结合蛋白 （ChREBP） 和肝脏 X 受体 （LXR）21、22、23、24、25、26。尽管它们的功能明显重叠，但已报告了基于细胞类型优势和生理或病理条件的个体调节21,22,27,28。
值得注意的是，许多用于DNL通路特定步骤的抑制剂已被批准用于临床，或处于临床前或临床开发阶段，用于多种疾病，包括肥胖、非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎（NAFLD/NASH）和心血管疾病29。这些努力凸显了DNL在健康和疾病中的相关性。
近年来，定量评估从头脂肪酸合成的方法的使用增加了30。评估这一点的最常见方法是使用重标记水 （D2O），其中重标记的氢在合成过程中通过与 DNL 底物 NAPDH、乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 的氢交换直接或间接地掺入酰基链中。尽管这种方法越来越受欢迎，但缺乏适合该领域新手的公开可用详细协议。在这里，我们概述了一种使用 D2O 和气相色谱质谱 （GCMS） 定量评估 FAS 产物从头合成的方法，其计算方法先前由 Lee 等人 31 开发。该方法独立于碳源测量从头脂肪酸合成，并且几乎可用于任何组织、任何小鼠模型和任何外部扰动。在这里，我们专注于棕色脂肪组织 （BAT） 的分析，因为它具有高水平的 DNL 和在维持代谢稳态中的关键作用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

脂肪酸合成是一种复杂且对能量要求很高的代谢途径，在控制全身代谢稳态和其他生理和病理过程方面具有重要的功能作用。与其他关键代谢途径（如葡萄糖处理）相反，脂肪酸合成未常规进行功能评估，导致对代谢状态的解释不完整。此外，缺乏适合该领域新手的公开详细协议。在这里，我们描述了一种利用氧化氘和气相色谱质谱（GCMS）分析体内棕色脂肪组织中总脂肪酸从头合成的廉价定量方法。该方法独立于碳源测量脂肪酸合酶产物的合成，并且几乎可用于任何组织、任何小鼠模型和任何外部扰动。提供了有关GCMS样品制备和下游计算的详细信息。我们专注于棕色脂肪的分析，因为它具有高水平的从头脂肪酸合成和在维持代谢稳态中的关键作用。

基于步骤 1 中描述的 D 2 O 剂量，我们通常发现体内水分的富集范围为2.5% 至 6%，并且体内水中氘富集的基线水平在 1 小时内迅速达到， 并通过 8% 浓缩饮用水维持研究期间（图 1）。连续稳态人体水分富集是步骤6中使用的计算的假设，因此我们建议在新的实验模型中对人体水分富集动力学进行实验验证。
我们发现，相对于BAT中热中性脂肪?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

在这里，我们提出了一种利用氧化氘和气相色谱质谱（GCMS）的廉价定量方法，用于分析体内棕色脂肪组织中的总脂肪酸从头脂肪生成。

使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中 从头 脂肪酸合成

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

与葡萄糖处理等其他代谢途径相反，脂肪酸合成没有常规评估，导致对代谢状态的解释不完整。这种方法的主要优点是它相对非侵入性，并且与使用同位素标记的葡萄糖相比，它可能更好地反映脂肪酸合成通量，因为上游葡萄糖处理的变化会影响结果。在这里，我们专注于棕色脂肪组织，但这种方法对于研究任何小鼠模型中的任何组织都有潜在用处。首先，将样品放在干冰上。取一个预先标记的微量离心管，将其放在分析天平上并去皮。然后将镊子和手术刀或钢制剃须刀片放在干冰上 10 到 20 秒冷却。使用镊子将冷冻组织样品从试管中取出，并将其放在塑料配重船上，该配重舟可以放置在平坦的干冰块或其他预冷的表面上。使用手术刀或钢制剃须刀片，解剖相当于 5 至 15 毫克重量的一小部分组织，并将其放入微量离心管中。记录每个试样的确切重量并重复。每毫克加入 1 微升 10 毫摩尔十六烷酸 D31 酸，然后向每个样品中加入三个 5 毫米的不锈钢珠。然后向每个带有珠子的样品中加入 250 微升甲醇、250 微升水和 500 微升氯仿。将试管放入研磨机的预冷块中，并以 25 赫兹的振动频率混合样品五分钟。使用磁铁取出珠子，并将样品在4摄氏度下以12,000G离心10分钟。使用微量移液器，将固定体积的每个样品的底部相放入相应标记的微量离心管中。向剩余样品中加入 500 微升氯仿，然后重复这些步骤。将具有组合下相的试管置于氮气下或耐氯仿的冷冻离心真空中，温度为4摄氏度，直至完全干燥。将 98 毫升无水甲醇移液到玻璃培养基瓶中。并在通风橱中缓慢加入两毫升无水硫酸，制成2%硫酸的甲醇溶液。通过旋转封闭的瓶子进行混合。向每个样品中加入 500 微升这种 2% 硫酸的甲醇溶液并短暂涡旋。将样品在 50 摄氏度的加热块上孵育两小时，并向每个样品中加入 100 微升饱和氯化钠溶液和 500 微升己烷。在室温下将样品剧烈涡旋一分钟，然后让样品静置一分钟。在此之后，这两个阶段应该很明显。将上层相收集到新鲜的微量离心管中。然后重复添加己烷。相分离后，将第二个上相样品收集到相同的标记管中。在室温下在氮气下干燥样品，并将样品重悬于每毫克原始组织重量20微升己烷中。立即将样品转移到带有玻璃插件的玻璃气相色谱小瓶中。将样品注入单个四联气相色谱质谱仪中，以确定脂肪酸甲酯或FAME同位素异构体的丰度。使用氦气作为载气，在入口温度为 270 摄氏度的情况下将一微升样品注入分流或不分流入口。在标记的安全锁微量离心管中，将每个血浆样品混合 10 微升或标准 4 微升 10 摩尔氢氧化钠和 4 微升 5% 丙酮的乙腈溶液。对每个样品一式三份。将样品在室温下孵育过夜后，向每个样品中加入 450 至 550 毫克硫酸钠，在通风橱中的每根管中加入 600 微升氯仿，并剧烈涡旋 15 秒。将样品以300G离心两分钟。取带有玻璃插件的标记玻璃GCMS小瓶，将一式三份，然后从每个样品中转移80微升等分试样的上清液到小瓶中。盖紧小瓶盖以进行GCMS分析。此处显示了多个时间点小鼠血浆中D2O富集的百分比。结果发现，体内水分的富集度在2.5%至6%的范围内，体内水中氘的富集基线水平在一小时内迅速达到，并在研究期间保持。此处显示了在室温和热中性条件下 D2O 给药三天后棕榈酸酯在棕色脂肪组织中的质量同位素分布。该结果表明，室温下 M1 和 M2 氘富集较高。该图显示了在室温下D2O给药三天后一系列脂肪酸的棕色脂肪组织摩尔富集和血浆摩尔富集和热中性。在棕色脂肪组织中的多种脂肪酸中发现了较冷的温度富集。值得注意的是，血浆总脂肪酸富集与棕色脂肪组织不同，而是随着热中性而增加脂肪酸富集。这些图像代表了 D2O 给药三天后棕色脂肪组织中的总丰度和从头合成的棕榈酸酯。结果表明，在室温下，棕榈酸酯的总合成量有所增加。在GCMS上运行脂肪酸时要小心。确保棕榈酸酯不会超载，因为会人为地提供高同位素富集值。此外，在GCMS上分析丙酮时，请确保在运行样品之前没有背景丙酮峰，因此请运行空白以去除系统中的任何丙酮。这种方法着眼于多个脂质类别的总脂肪酸，但如果您想了解脂肪酸合成如何影响特定的脂质类别，您可以首先使用色谱法分离这些脂质类别，然后从这些馏分中提取脂肪酸。由于脂肪生成是正常发育的关键因素，也是许多疾病的关键因素，因此该方案在许多领域都很有用。

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

科研

生物学

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

蛋白质智慧：一个工作台<em&gt;硅片</em&gt;<em&gt;从头</em&gt;生物分子设计

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

在小鼠原代肝细胞测定脂肪酸氧化和脂肪生成的

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

为葡萄糖和脂肪酸氧化率在大鼠离体的测定方法

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

从头用狂吠/狂暴法生成体细胞干细胞

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

双正电子发射层析成像用 68 ga 芯掺杂氧化铁纳米粒子的合成/(t1) 磁共振成像

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

卡诺哈布迪蒂斯 伊利根斯新蛋白合成率评估

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

通过甲基异硫清除和三D成像探索脂肪组织结构

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

斯普拉格道利大鼠脂肪组织间充质干细胞的分离和鉴定

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

基于脱细胞的骨骼肌脂肪浸润定量

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中 从头 脂肪酸合成

使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中从头脂肪酸合成