Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Vi takker Sanchez-Gurmaches og Wallace laboratoriets medlemmer for værdifulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association (18CDA34080527 til JSG og 19POST34380545 til RM), NIH (R21OD031907 til JSG), en CCHMC Trustee Award, en CCHMC Center for Pediatric Genomics Award og en CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH P30 DK078392 fra Digestive Diseases Research Core Center i Cincinnati. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. RT og MW blev støttet af et UCD Ad Astra Fellowship.

Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Fremstilling af D2O
BEMÆRK: For at undgå eksperimentel variation skal du forberede tilstrækkelig opløsning/drikkevand til alle mus i løbet af eksperimentet.
<ol><li>Til intraperitoneal injektion: generer 0,9% w / v saltvand D 2 O ved at opløse 9 g NaCl pr. Liter D 2 O.Filtrer gennem et ikke-pyr...

Forståelse af balancen og interaktionen mellem komplekse metaboliske veje er et uundværligt skridt i retning af at forstå det biologiske grundlag for metaboliske relaterede sygdomme. Her viser vi en ikke-invasiv og billig metode til at bestemme ændringer i de novo fedtsyresyntese. Denne metode er tilpasset fra tidligere offentliggjorte metoder, der udviklede beregninger til estimering af de novo-synteseflux fra fedtsyredeuteriumberigelse31 og til anvendelse af deuterium-aceto...

Fedme og tilknyttede metaboliske sygdomme er en pandemi, der bringer nuværende og fremtidige generationeri fare 1,2. Almindeligvis forenklet som følge af ubalancen mellem energiindtag og udgifter påvirker den metaboliske dysregulering forbundet med fedme et stort antal metaboliske veje, der styres af miljømæssige og endogene faktorer3. Imidlertid testes kun få veje rutinemæssigt i dyremodeller for metabolisk dysregulering.
Som et eksempel måles glukosebortskaffelse rutinemæssigt ved glukose- og insulintolerancetest, sandsynligvis på grund af enkelheden ved at bruge bærbare glukosemonitorer4. Helkropsglukose- og lipidoxidationsrelative hastigheder estimeres også rutinemæssigt baseret på respirationsudvekslingsforholdet fra indirekte kalorimetriassays 5,6. Imidlertid vurderes størstedelen af alle andre aspekter af stofskiftet ikke rutinemæssigt funktionelt. Dette fører til ufuldstændige fortolkninger af metabolisk status og savnede terapeutiske muligheder. En af de vigtigste sådanne veje er de novo lipogenese.
De novo lipogenese (DNL) er den proces, hvorved nye fedtsyrer genereres fra prækursorer. Glukose anses for at være den vigtigste forløber, der bidrager til DNL7 i hele kroppen, men andre forløbere, såsom acetat, fruktose, lactat og forgrenede aminosyrer, har vist sig at være relevante kulstofkilder på en rumlig og tilstandsafhængig måde 8,9,10,11,12. DNL er en vigtig bidragyder til metabolisk homeostase og er afgørende for normal udvikling13. Derudover har ændringer i DNL været forbundet med kræft 14,15 og metabolisk 16,17,18 og hjerte-kar-sygdomme 19,20.
DNL-vejen består af de centrale enzymatiske komponenter ATP-citratlyase (ACLY), acetyl-CoA-carboxylase (ACC1/2) og fedtsyresyntase (FAS), der primært producerer palmitat, en 16-carbonmættet fedtsyre. Imidlertid kan ulige kæde og forgrenede fedtsyrer også produceres ved lavere hastigheder9. Elongasser og desaturaser modificerer yderligere disse fedtsyrer og skaber en bred vifte af fedtsyrer, der er nyttige til en række funktioner (f.eks. Langsigtet energilagring og manipulation af membranfluiditet).
Ekspressionen af DNL enzymatiske maskiner styres af et kort antal transkriptionsfaktorer. De mest velbeskrevne til dato omfatter sterol regulatorisk element bindende protein (SREBP) familie, kulhydrat respons element bindende protein (ChREBP), og lever X-receptor (LXR) 21,22,23,24,25,26. På trods af en tilsyneladende overlapning i deres funktioner er individuelle regler baseret på celletypedominans og fysiologiske eller patologiske tilstande blevet rapporteret21,22,27,28.
Bemærkelsesværdigt nok er en række hæmmere for udvalgte trin i DNL-vejen blevet godkendt til klinisk brug eller er i de prækliniske eller kliniske udviklingsstadier for en række sygdomme, herunder fedme, ikke-alkoholisk fedtleversygdom / ikke-alkoholisk steatohepatitis (NAFLD / NASH) og hjerte-kar-sygdom29. Disse bestræbelser fremhæver DNL's relevans for sundhed og sygdom.
I de senere år er anvendelsen af metoder til kvantitativ vurdering af de novo fedtsyresyntese steget30. Den mest almindelige metode til vurdering af dette er brugen af tungt mærket vand (D2O), hvor det tungt mærkede brint inkorporeres i acylkæder under syntese både direkte og indirekte via deuteriumudveksling med hydrogenerne fra DNL-substraterne NAPDH, acetyl-CoA og malonyl-CoA. Selvom denne tilgang vinder popularitet, mangler der offentligt tilgængelige detaljerede protokoller, der passer til nyankomne på området. Her skitserer vi en metode til kvantitativ vurdering af de novo-syntesen af produkter af FAS ved hjælp af D2O og gaskromatografi massespektrometri (GCMS) med beregninger, der tidligere er udviklet af Lee et al.31. Denne metode måler de novo fedtsyresyntese uafhængigt af en kulstofkilde, og den er potentielt nyttig for stort set ethvert væv, i enhver musemodel og under enhver ekstern forstyrrelse. Her fokuserer vi på analysen af brunt fedtvæv (BAT) på grund af dets høje niveauer af DNL og kritiske roller i opretholdelsen af metabolisk homeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

Fedtsyresyntese er en kompleks og meget energikrævende metabolisk vej med vigtige funktionelle roller i styringen af helkropsmetabolisk homeostase og andre fysiologiske og patologiske processer. I modsætning til andre vigtige metaboliske veje, såsom glukosebortskaffelse, vurderes fedtsyresyntese ikke rutinemæssigt funktionelt, hvilket fører til ufuldstændige fortolkninger af metabolisk status. Derudover mangler der offentligt tilgængelige detaljerede protokoller, der er egnede til nytilkomne på området. Her beskriver vi en billig kvantitativ metode, der anvender deuteriumoxid og gaskromatografi massespektrometri (GCMS) til analyse af total fedtsyre de novo-syntese i brunt fedtvæv in vivo. Denne metode måler syntesen af produkterne af fedtsyresyntase uafhængigt af en kulstofkilde, og den er potentielt nyttig for stort set ethvert væv, i enhver musemodel og under enhver ekstern forstyrrelse. Der gives nærmere oplysninger om prøveforberedelsen til GCMS og downstream-beregninger. Vi fokuserer på analysen af brunt fedt på grund af dets høje niveauer af de novo fedtsyresyntese og kritiske roller i opretholdelsen af metabolisk homeostase.

Baseret på D 2 O-doseringen beskrevet i trin 1 finder vi typisk, at kropsvand beriges i området2,5% til 6%, og at et baselineniveau for deuteriumberigelse i kropsvand hurtigt opnås på 1 time og opretholdes i undersøgelsens varighed via 8% beriget drikkevand (figur 1). Kontinuerlig steady state kropsvandberigelse er en antagelse af de beregninger, der anvendes i trin 6, og derfor anbefaler vi eksperimentel validering af kinetikken for kropsvandsberigelse i nye eksperi...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Her præsenterer vi en billig kvantitativ metode, der anvender deuteriumoxid og gaskromatografi massespektrometri (GCMS) til analyse af total fedtsyre de novo lipogenese i brunt fedtvæv in vivo.

Kvantitativ bestemmelse af de novo fedtsyresyntese i brunt fedtvæv under anvendelse af deuteriumoxid

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

I modsætning til andre metaboliske veje som glukosebortskaffelse vurderes fedtsyresyntese ikke rutinemæssigt, hvilket fører til ufuldstændige fortolkninger af metabolisk status. De vigtigste fordele ved denne metode er, at den er relativt ikke-invasiv, og det er sandsynligvis en bedre afspejling af fedtsyresynteseflux end at bruge isotopmærket glukose, hvor ændringer i opstrøms glukosehåndtering kan påvirke resultaterne. Her fokuserer vi på brunt fedtvæv, men denne metode er potentielt nyttig til at studere ethvert væv i enhver musemodel.Til at begynde med skal du placere prøverne på tøris. Tag et forudmærket mikrocentrifugerør, læg det på en analytisk vægt og tara vægten. Læg derefter pincet og et skalpel- eller stålbarberblad på tøris i 10 til 20 sekunder for at afkøle.Brug pincetten til at tage den frosne vævsprøve ud af røret og læg den på en plastvægtbåd, som kan placeres på en flad blok tøris eller en anden forkølet overflade. Brug skalpellen eller barberbladet til at dissekere en lille del af vævet svarende til 5 til 15 milligram i vægt og placere det i mikrocentrifugerøret. Registrer den nøjagtige vægt og gentag for hver prøve.Tilsæt en mikroliter pr. milligram 10 millimolær hexadecansyre D31 syre, efterfulgt af tre fem millimeter rustfrit stålperler til hver prøve. Derefter tilsættes 250 mikroliter methanol, 250 mikroliter vand og 500 mikroliter chloroform til hver prøve med perler. Rørene anbringes i en forkølet blok af en slibemølle, og prøverne blandes med en vibrationsfrekvens på 25 hertz i fem minutter.Fjern perlerne ved hjælp af en magnet og centrifuger prøverne ved 12.000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Brug en mikropipette til at tage et fast volumen af den nederste fase af hver prøve i tilsvarende mærkede mikrocentrifugerør. Der tilsættes 500 mikroliter chloroform til den resterende prøve, og disse trin gentages.Anbring rørene med den kombinerede nedre fase under nitrogengas eller i et chloroformbestandigt kølet centrifugalvakuum ved fire grader Celsius, indtil de er helt tørre. Pipette 98 ml vandfri methanol i en glasmedieflaske. Og tilsæt langsomt to milliliter vandfri svovlsyre i damphætten for at lave 2% svovlsyre i methanol.Bland ved at hvirvle den lukkede flaske. Tilsæt 500 mikroliter af denne 2% svovlsyre i methanolopløsning til hver prøve og hvirvel kort. Inkuber prøverne på varmeblokken ved 50 grader Celsius i to timer og tilsæt 100 mikroliter mættet natriumchloridopløsning og 500 mikroliter hexan til hver prøve.Vortex prøverne kraftigt ved stuetemperatur i et minut og lad prøverne sidde i et minut. De to faser skal være tydelige efter dette. Den øverste fase samles i et frisk mikrocentrifugerør.Gentag derefter tilsætningen af hexan. Og efter faseadskillelse samles de anden øverste faseprøver i de samme mærkede rør. Prøverne tørres ved stuetemperatur under nitrogengas, og prøverne resuspenderes i 20 mikroliter hexan pr. milligram oprindelig vævsvægt.Prøverne overføres straks til et hætteglas med glasgaskromatografi med en glasindsats. Injicer prøverne i et enkelt firedobbelt gaskromatografimassespektrometer for at bestemme mængden af fedtsyremethylestere eller FAMEs isotopologer. Injicer en mikroliter prøve i et delt eller splitfrit indløb ved en indgangstemperatur på 270 grader Celsius ved hjælp af helium som bæregas.I mærkede mikrocentrifugerør med sikker lås kombineres 10 mikroliter af hver plasmaprøve eller standard fire mikroliter 10 molært natriumhydroxid og fire mikroliter 5% acetone i acetonitril. Udfør dette i tre eksemplarer for hver prøve. Efter inkubation af prøverne natten over ved stuetemperatur tilsættes 450 til 550 mg natriumsulfat til hver prøve, tilsættes 600 mikroliter chloroform til hvert rør i damphætten og hvirvler kraftigt i 15 sekunder.Prøverne centrifugeres ved 300 G i to minutter. Der udtages mærkede GCMS-hætteglas med glasindsatser, og supernatanten overføres tre gange og derefter 80 mikroliter alikvoter fra hver prøve til hætteglassene. Sæt hætteglassene tæt på til GCMS-analysen.Procentdelen af D2O-berigelse i plasma hos mus over flere tidspunkter er vist her. Det blev konstateret, at kropsvand er beriget i intervallet 2,5 til 6%at et basisniveau for deuteriumberigelse i kropsvand hurtigt opnås på en time og opretholdes i hele undersøgelsens varighed. Masseisotopfordelingen af palmitat i brunt fedtvæv efter tre dages D2O-administration ved stuetemperatur og termoneutralitet er vist her.Dette resultat viser en højere M1 og M2 deuterium berigelse ved stuetemperatur. Molær berigelse af brunt fedtvæv og plasmamolær berigelse af en række fedtsyrer efter tre dages administration af D2O ved stuetemperatur og termoneutralitet er vist i denne figur. Den koldere temperaturberigelse blev fundet i en bred vifte af fedtsyrer i brunt fedtvæv.Især plasma total fedtsyreberigelse følger ikke den samme tendens som brunt fedtvæv, men i stedet øges fedtsyreberigelsen med termoneutralitet. Disse billeder repræsenterer den samlede overflod og de novo syntetiseret palmitat i brunt fedtvæv efter tre dages D2O-administration. Resultatet viser en stigning i den totale palmitatsyntese ved stuetemperatur.Vær forsigtig, når du kører fedtsyrer på GCMS. Sørg for, at palmitat ikke overbelastes, da det bare kan give kunstigt høje isotopberigelsesværdier. Når du analyserer acetone på GCMS, skal du desuden sørge for, at der ikke er nogen baggrundsacetonetop, før du kører prøverne, så kør emner for at fjerne acetone i systemet.Denne metode ser på samlede fedtsyrer på tværs af flere lipidklasser, men hvis du vil forstå, hvordan fedtsyresyntese påvirker specifikke lipidklasser, kan du først adskille disse lipidklasser ved hjælp af kromatografi og derefter ekstrahere fedtsyrer fra disse fraktioner. Fordi lipogenese er en vigtig bidragyder til normal udvikling, men også til mange sygdomme, kan denne protokol være nyttig på mange områder.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein VISDOM: A Workbench for<em&gt; I silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design af biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse af fedtsyreoxidation og lipogenese i Mus primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Metoder til bestemmelse af priser for glucose og fedtsyreoxidation i Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation af somatiske stamceller af YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Syntese af 68Ga Core-doped jernoxid nanopartikler til dobbelt positronemissionstomografi / (T1) Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Vurdering af de novo proteinsyntese i Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Udforskning af fedtvævsstruktur ved methylsalicylatclearing og 3D-billeddannelse

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering og identifikation af mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv fra Sprague Dawley rotter

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

Decellulariseringsbaseret kvantificering af skeletmuskulatur fedtinfiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...