Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Sanchez-Gurmaches et Wallace pour leurs précieuses discussions. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association (18CDA34080527 à JSG et 19POST34380545 à RM), du NIH (R21OD031907 à JSG), d’un prix du CCHMC Trustee, d’un prix du Centre de génomique pédiatrique du CCHMC et d’un prix du Centre de génomique et de thérapeutique mendélienne du CCHMC. Ce travail a été soutenu en partie par le NIH P30 DK078392 du Centre central de recherche sur les maladies digestives à Cincinnati. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. RT et MW ont été soutenus par une bourse Ad Astra de l’UCD.

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’hôpital pour enfants de Cincinnati.
1. Préparation du D2O
REMARQUE : Pour éviter les variations expérimentales, préparez suffisamment de solution / d’eau potable pour toutes les souris pendant toute la durée de l’expérience.
<ol><li>Pour l’injection intrapéritonéale : générer 0,9...

Comprendre l’équilibre et l’interaction entre des voies métaboliques complexes est une étape indispensable pour comprendre les bases biologiques des maladies métaboliques. Ici, nous montrons une méthodologie non invasive et peu coûteuse pour déterminer les changements dans la synthèse des acides gras de novo. Cette méthode est adaptée de méthodes publiées antérieurement qui ont mis au point des calculs pour estimer le flux de synthèse de novo à partir de l’enrichissement en deutéri...

L’obésité et les maladies métaboliques associées sont une pandémie qui met en danger les générations actuelles et futures 1,2. Communément simplifié comme la conséquence du déséquilibre entre l’apport et la dépense énergétique, le dérèglement métabolique associé à l’obésité affecte un grand nombre de voies métaboliques contrôlées par des facteurs environnementaux etendogènes3. Cependant, seules quelques voies sont systématiquement testées dans des modèles animaux de dérégulation métabolique.
À titre d’exemple, l’élimination du glucose est régulièrement mesurée par des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, probablement en raison de la simplicité d’utilisation des glucomètres portables4. Les taux relatifs d’oxydation du glucose et des lipides dans l’ensemble du corps sont également estimés de manière routinière sur la base du rapport d’échange respiratoire à partir d’essais calorimétriques indirects 5,6. Cependant, la majorité de tous les autres aspects du métabolisme ne sont pas systématiquement évalués fonctionnellement. Cela conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique et à des options thérapeutiques manquées. L’une de ces principales voies est la lipogenèse de novo.
La lipogenèse de novo (DNL) est le processus par lequel de nouveaux acides gras sont générés à partir de précurseurs. Le glucose est considéré comme le principal précurseur contribuant à la DNL7 du corps entier, mais d’autres précurseurs, tels que l’acétate, le fructose, le lactate et les acides aminés à chaîne ramifiée, se sont avérés être des sources de carbone pertinentes d’une manière dépendante de l’espace et de l’état 8,9,10,11,12. Le DNL est un contributeur clé à l’homéostasie métabolique et est essentiel au développement normal13. De plus, des altérations de la DNL ont été associées au cancer 14,15 et métabolique 16,17,18 et aux maladies cardiovasculaires 19,20.
La voie DNL est composée des composants enzymatiques de base ATP citrate lyase (ACLY), acétyl-CoA carboxylase (ACC1/2) et acide gras synthase (FAS) qui produisent principalement du palmitate, un acide gras saturé à 16 carbones. Cependant, les acides gras à chaîne impaire et à chaîne ramifiée peuvent également être produits à des taux plus faibles9. Les élongases et les désaturases modifient davantage ces acides gras, créant une gamme diversifiée d’espèces d’acides gras utiles à diverses fonctions (par exemple, le stockage d’énergie à long terme et la manipulation de la fluidité membranaire).
L’expression de la machinerie enzymatique DNL est contrôlée par un petit nombre de facteurs de transcription. Les plus bien décrites à ce jour comprennent la famille des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), la protéine de liaison aux éléments de réponse glucidique (ChREBP) et le récepteur X du foie (LXR)21,22,23,24,25,26. Malgré un chevauchement apparent de leurs fonctions, des régulations individuelles basées sur la dominance du type cellulaire et les conditions physiologiques ou pathologiques ont été rapportées21,22,27,28.
Fait remarquable, un certain nombre d’inhibiteurs de certaines étapes de la voie DNL ont été approuvés pour une utilisation clinique ou sont à des stades précliniques ou cliniques de développement pour un certain nombre de maladies, notamment l’obésité, la stéatose hépatique non alcoolique/stéatohépatite non alcoolique (NAFLD/NASH) et les maladies cardiovasculaires29. Ces efforts mettent en évidence la pertinence de la DNL dans le domaine de la santé et de la maladie.
Au cours des dernières années, l’utilisation de méthodes d’évaluation quantitative de la synthèse des acides gras de novo a augmenté30. La méthode la plus courante pour évaluer cela est l’utilisation d’eau lourde marquée (D2O), où l’hydrogène lourd marqué est incorporé dans des chaînes acyle lors de la synthèse à la fois directement et indirectement, via l’échange de deutérium avec les hydrogènes des substrats DNL NAPDH, acétyl-CoA et malonyl-CoA. Bien que cette approche gagne en popularité, il y a un manque de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode d’évaluation quantitative de la synthèse de novo des produits du SAF à l’aide du D2O et de la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS), avec des calculs précédemment développés par Lee et al.31. Cette méthode mesure la synthèse d’acides gras de novo indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle murin et sous n’importe quelle perturbation externe. Ici, nous nous concentrons sur l’analyse du tissu adipeux brun (BAT) en raison de ses niveaux élevés de DNL et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

La synthèse des acides gras est une voie métabolique complexe et très énergivore qui joue un rôle fonctionnel important dans le contrôle de l’homéostasie métabolique du corps entier et d’autres processus physiologiques et pathologiques. Contrairement à d’autres voies métaboliques clés, telles que l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée fonctionnellement, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. De plus, il n’existe pas de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la synthèse de novo d’acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo. Cette méthode mesure la synthèse des produits de la synthase d’acide gras indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle de souris, et sous n’importe quelle perturbation externe. Des détails sur la préparation de l’échantillon pour le SMGC et les calculs en aval sont fournis. Nous nous concentrons sur l’analyse de la graisse brune en raison de ses niveaux élevés de synthèse d’acides gras de novo et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

Sur la base de la dose de D 2 O décrite à l’étape 1, nous constatons généralement que l’eau corporelle est enrichie de l’ordre de2,5% à 6 % et qu’un niveau de base d’enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle est rapidement atteint en 1 h et maintenu pendant toute la durée de l’étude via de l’eau potable enrichie à 8 % (Figure 1). L’enrichissement continu en eau corporelle à l’état d’équilibre est une hypothèse des calculs utilis...

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Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Nous présentons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la lipogenèse de novo des acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo.

Détermination quantitative de la synthèse d’acides gras de novo dans le tissu adipeux brun à l’aide d’oxyde de deutérium

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

Contrairement à d’autres voies métaboliques comme l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est relativement non invasive et qu’elle reflète probablement mieux le flux de synthèse des acides gras que l’utilisation de glucose marqué aux isotopes, où les changements dans la manipulation du glucose en amont peuvent avoir un impact sur les résultats. Ici, nous nous concentrons sur le tissu adipeux brun, mais cette méthode est potentiellement utile pour étudier n’importe quel tissu dans n’importe quel modèle de souris.Pour commencer, placez les échantillons sur de la glace carbonique. Prenez un tube de microcentrifugation pré-étiqueté, placez-le sur une balance d’analyse et tarez la balance. Placez ensuite une pince à épiler et un scalpel ou une lame de rasoir en acier sur de la glace carbonique pendant 10 à 20 secondes pour refroidir.Utilisez la pince à épiler pour retirer l’échantillon de tissu congelé du tube et le placer sur un bateau de poids en plastique, qui peut être positionné sur un bloc plat de glace carbonique ou une autre surface pré-refroidie. À l’aide du scalpel ou de la lame de rasoir en acier, disséquez une petite partie du tissu d’un poids équivalent à 5 à 15 milligrammes et placez-la dans le tube de la microcentrifugeuse. Notez le poids exact et répétez l’opération pour chaque échantillon.Ajoutez un microlitre par milligramme d’acide hexadécanoïque D31 de 10 millimolaires, suivi de trois billes d’acier inoxydable de cinq millimètres à chaque échantillon. Ajoutez ensuite 250 microlitres de méthanol, 250 microlitres d’eau et 500 microlitres de chloroforme à chaque échantillon avec des billes. Placez les tubes dans un bloc pré-refroidi d’un broyeur et mélangez les échantillons à une fréquence vibratoire de 25 hertz pendant cinq minutes.Retirez les billes à l’aide d’un aimant et centrifugez les échantillons à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une micropipette, prélever un volume fixe de la phase inférieure de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation étiquetés en conséquence. Ajoutez 500 microlitres de chloroforme à l’échantillon restant et répétez ces étapes.Placez les tubes avec la phase inférieure combinée sous azote gazeux ou dans un vide centrifuge réfrigéré résistant au chloroforme à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Pipeter 98 millilitres de méthanol anhydre dans un flacon en verre. Et ajoutez lentement deux millilitres d’acide sulfurique anhydre dans la hotte pour obtenir 2% d’acide sulfurique dans le méthanol.Mélangez en faisant tourner la bouteille fermée. Ajoutez 500 microlitres de cette solution d’acide sulfurique à 2 % dans du méthanol à chaque échantillon et tourbillonnez brièvement. Incubez les échantillons sur le bloc chauffant à 50 degrés Celsius pendant deux heures et ajoutez 100 microlitres de solution saturée de chlorure de sodium et 500 microlitres d’hexane à chaque échantillon.Vaporisez vigoureusement les échantillons à température ambiante pendant une minute et laissez-les reposer pendant une minute. Les deux phases devraient être apparentes après cela. Recueillir la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation.Répétez ensuite l’ajout d’hexane. Et après la séparation de phase, prélevez les échantillons de la deuxième phase supérieure dans les mêmes tubes étiquetés. Sécher les échantillons à température ambiante sous azote gazeux et remettre les échantillons en suspension dans 20 microlitres d’hexane par milligramme de poids tissulaire d’origine.Transférez immédiatement les échantillons dans un flacon de chromatographie en phase gazeuse en verre avec un insert en verre. Injecter les échantillons dans un seul spectromètre de masse quadruple à chromatographie en phase gazeuse pour déterminer l’abondance des esters méthyliques d’acides gras ou des isotopologues EMAG. Injecter un microlitre d’échantillon dans une entrée fendue ou non fendue à une température d’entrée de 270 degrés Celsius en utilisant de l’hélium comme gaz porteur.Dans des tubes de microcentrifugation étiquetés à verrouillage sûr, combinez 10 microlitres de chaque échantillon de plasma ou quatre microlitres standard d’hydroxyde de sodium à 10 molaires et quatre microlitres d’acétone à 5 % dans l’acétonitrile. Effectuez cette opération en trois exemplaires pour chaque échantillon. Après avoir incubé les échantillons pendant la nuit à température ambiante, ajoutez 450 à 550 milligrammes de sulfate de sodium à chaque échantillon, ajoutez 600 microlitres de chloroforme dans chaque tube de la hotte et tourbillonnez vigoureusement pendant 15 secondes.Centrifuger les échantillons à 300 g pendant deux minutes. Prenez des flacons GCMS en verre étiquetés avec des inserts en verre et transférez les aliquotes triplées, puis 80 microlitres du surnageant de chaque échantillon dans les flacons. Fermez hermétiquement les flacons pour l’analyse du SMGC.Le pourcentage d’enrichissement en D2O dans le plasma de souris sur plusieurs points temporels est indiqué ici. Il a été constaté que l’eau corporelle est enrichie de l’ordre de 2,5 à 6 %, qu’un niveau de base d’enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle est rapidement atteint en une heure et maintenu pendant toute la durée de l’étude. La distribution isotopologue de masse du palmitate dans le tissu adipeux brun après trois jours d’administration de D2O à température ambiante et thermoneutralité est montrée ici.Ce résultat montre un enrichissement en deutérium M1 et M2 plus élevé à température ambiante. L’enrichissement molaire du tissu adipeux brun et l’enrichissement molaire plasmatique d’une gamme d’acides gras après trois jours d’administration de D2O à température ambiante et de thermoneutralité sont présentés dans cette figure. L’enrichissement à température plus froide a été trouvé dans une large gamme d’acides gras dans le tissu adipeux brun.Notamment, l’enrichissement plasmatique en acides gras totaux ne suit pas la même tendance que le tissu adipeux brun, mais au lieu de cela, l’enrichissement en acides gras est augmenté avec la thermoneutralité. Ces images représentent l’abondance totale et le palmitate synthétisé de novo dans le tissu adipeux brun après trois jours d’administration de D2O. Le résultat montre une augmentation de la synthèse totale de palmitate à température ambiante.Soyez prudent lorsque vous utilisez des acides gras sur le SMGC. Assurez-vous que le palmitate n’est pas surchargé car il peut simplement donner des valeurs d’enrichissement isotopique artificiellement élevées. De plus, lors de l’analyse de l’acétone sur le SMGC, assurez-vous qu’il n’y a pas de pic d’acétone de fond avant d’exécuter les échantillons, alors exécutez des blancs pour éliminer toute acétone dans le système.Cette méthode examine les acides gras totaux dans plusieurs classes de lipides, mais si vous voulez comprendre comment la synthèse des acides gras a un impact sur des classes de lipides spécifiques, vous pouvez d’abord séparer ces classes de lipides à l’aide de la chromatographie, puis extraire les acides gras de ces fractions. Parce que la lipogenèse est un contributeur clé au développement normal, mais aussi à de nombreuses maladies, ce protocole peut être utile dans de nombreux domaines.

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