Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
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Wir danken den Sanchez-Gurmaches und den Mitgliedern des Wallace-Labors für wertvolle Gespräche. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der American Heart Association (18CDA34080527 an JSG und 19POST34380545 an RM), der NIH (R21OD031907 an JSG), einen CCHMC Trustee Award, einen CCHMC Center for Pediatric Genomics Award und einen CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von NIH P30 DK078392 des Digestive Diseases Research Core Center in Cincinnati unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. RT und MW wurden durch ein UCD Ad Astra Fellowship unterstützt.

Alle Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cincinnati Children's Hospital Medical Center genehmigt.
1. Herstellung von D2O
HINWEIS: Um experimentelle Abweichungen zu vermeiden, bereiten Sie für die Dauer des Versuchs ausreichend Lösung/Trinkwasser für alle Mäuse vor.
<ol><li>Für die intraperitoneale Injektion: Erzeugen Sie 0,9 Gew.-% KochsalzlösungD2Odurch Auflösen von 9 g NaCl pro Liter<s...

Das Verständnis des Gleichgewichts und der Wechselwirkung zwischen komplexen Stoffwechselwegen ist ein unverzichtbarer Schritt, um die biologischen Grundlagen von Stoffwechselerkrankungen zu verstehen. Hier zeigen wir eine nicht-invasive und kostengünstige Methodik, um Veränderungen in der de novo Fettsäuresynthese zu bestimmen. Diese Methode ist von früher veröffentlichten Methoden adaptiert, die Berechnungen zur Schätzung des De-novo-Syntheseflusses aus der Fettsäure-Deuterium-Anreicherung<sup...

Adipositas und damit verbundene Stoffwechselerkrankungen sind eine Pandemie, die gegenwärtige und zukünftige Generationen gefährdet 1,2. Die mit Fettleibigkeit verbundene metabolische Dysregulation, die gemeinhin als Folge des Ungleichgewichts zwischen Energieaufnahme und -verbrauch vereinfacht wird, betrifft eine große Anzahl von Stoffwechselwegen, die durch Umwelt- und endogene Faktoren gesteuert werden3. Allerdings werden nur wenige Signalwege routinemäßig in Tiermodellen der metabolischen Dysregulation getestet.
Beispielsweise wird die Glukoseentsorgung routinemäßig durch Glukose- und Insulintoleranztests gemessen, was wahrscheinlich auf die Einfachheit der Verwendung tragbarer Glukosemessgeräte zurückzuführenist 4. Die relativen Raten der Ganzkörperglukose und der Lipidoxidation werden ebenfalls routinemäßig auf der Grundlage des respiratorischen Austauschverhältnisses aus indirekten Kalorimetrie-Assays geschätzt 5,6. Die meisten anderen Aspekte des Stoffwechsels werden jedoch nicht routinemäßig funktionell erfasst. Dies führt zu unvollständigen Interpretationen des Stoffwechselstatus und verpassten Therapieoptionen. Einer der wichtigsten dieser Wege ist die de novo Lipogenese.
Die De-novo-Lipogenese (DNL) ist der Prozess, bei dem aus Vorläufern neue Fettsäuren gebildet werden. Glukose wird als der Hauptvorläufer angesehen, der zum Ganzkörper-DNL7 beiträgt, jedoch haben sich andere Vorläufer wie Acetat, Fruktose, Laktat und verzweigtkettige Aminosäuren als relevante Kohlenstoffquellen in räumlicher und zustandsabhängiger Weise erwiesen 8,9,10,11,12. DNL leistet einen wichtigen Beitrag zur metabolischen Homöostase und ist für die normale Entwicklung unerlässlich13. Darüber hinaus wurden Veränderungen des DNL mit Krebs 14,15 und metabolischen 16,17,18 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 19,20 in Verbindung gebracht.
Der DNL-Signalweg besteht aus den enzymatischen Kernkomponenten ATP-Citrat-Lyase (ACLY), Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC1/2) und Fettsäuresynthase (FAS), die hauptsächlich Palmitat, eine gesättigte Fettsäure mit 16 Kohlenstoffatomen, produzieren. Ungerade und verzweigtkettige Fettsäuren können jedoch auch mit geringeren Raten produziert werden9. Elongasen und Desaturasen modifizieren diese Fettsäuren weiter, wodurch eine Vielzahl von Fettsäurespezies entsteht, die für eine Vielzahl von Funktionen nützlich sind (z. B. langfristige Energiespeicherung und Manipulation der Membranfluidität).
Die Expression der DNL-Enzymmaschinerie wird durch eine kurze Anzahl von Transkriptionsfaktoren gesteuert. Zu den bisher am besten beschriebenen gehören die Familie der sterolregulatorischen Elementbindungsproteine (SREBP), des Kohlenhydratreaktionselement-bindenden Proteins (ChREBP) und des Leber-X-Rezeptors (LXR)21,22,23,24,25,26. Trotz einer offensichtlichen Überlappung ihrer Funktionen wurden individuelle Regulationen beschrieben, die auf der Dominanz des Zelltyps und physiologischen oder pathologischen Bedingungen basieren21,22,27,28.
Bemerkenswert ist, dass eine Reihe von Inhibitoren für ausgewählte Schritte des DNL-Signalwegs für eine Reihe von Krankheiten, darunter Fettleibigkeit, nichtalkoholische Fettlebererkrankung/nichtalkoholische Steatohepatitis (NAFLD/NASH) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, für den klinischen Einsatz zugelassen wurden oder sich in der präklinischen oder klinischen Entwicklungsphase befinden29. Diese Bemühungen unterstreichen die Bedeutung von DNL für Gesundheit und Krankheit.
In den letzten Jahren hat der Einsatz von Methoden zur quantitativen Bewertung der De-novo-Fettsäuresynthese zugenommen30. Die gebräuchlichste Methode zur Beurteilung ist die Verwendung von schwer markiertem Wasser (D2O), bei dem der schwer markierte Wasserstoff während der Synthese sowohl direkt als auch indirekt über den Deuteriumaustausch mit den Wasserstoffen der DNL-Substrate NAPDH, Acetyl-CoA und Malonyl-CoA in Acylketten eingebaut wird. Obwohl dieser Ansatz immer beliebter wird, fehlt es an öffentlich zugänglichen detaillierten Protokollen, die für Neulinge auf diesem Gebiet geeignet sind. Hier skizzieren wir eine Methode zur quantitativen Bewertung der de novo Synthese von FAS-Produkten mittelsD2Ound Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS), mit Berechnungen, die zuvor von Lee et al.31 entwickelt wurden. Diese Methode misst die De-novo-Fettsäuresynthese unabhängig von einer Kohlenstoffquelle und ist potenziell für praktisch jedes Gewebe, in jedem Mausmodell und unter jeder externen Störung nützlich. Hier konzentrieren wir uns auf die Analyse von braunem Fettgewebe (BAT) aufgrund seines hohen DNL-Gehalts und seiner entscheidenden Rolle bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

Die Fettsäuresynthese ist ein komplexer und sehr energieintensiver Stoffwechselweg mit wichtigen funktionellen Rollen bei der Steuerung der metabolischen Homöostase des gesamten Körpers und anderer physiologischer und pathologischer Prozesse. Im Gegensatz zu anderen wichtigen Stoffwechselwegen, wie z. B. der Glukoseentsorgung, wird die Fettsäuresynthese nicht routinemäßig funktionell bewertet, was zu unvollständigen Interpretationen des Stoffwechselstatus führt. Darüber hinaus fehlt es an öffentlich zugänglichen detaillierten Protokollen, die für Neulinge auf diesem Gebiet geeignet sind. In dieser Arbeit beschreiben wir eine kostengünstige quantitative Methode, die Deuteriumoxid- und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) zur Analyse der Gesamtfettsäuresynthese in braunem Fettgewebe in vivo verwendet. Diese Methode misst die Synthese der Produkte der Fettsäuresynthase unabhängig von einer Kohlenstoffquelle und ist potenziell für praktisch jedes Gewebe, in jedem Mausmodell und unter jeder externen Störung nützlich. Details zur Probenvorbereitung für GCMS und nachgelagerte Berechnungen werden bereitgestellt. Wir konzentrieren uns auf die Analyse von braunem Fett aufgrund seiner hohen De-novo-Fettsäuresynthese und seiner kritischen Rolle bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase.

Basierend auf der in Schritt 1 beschriebenenD2O-Dosierungstellen wir typischerweise fest, dass das Körperwasser im Bereich von 2,5 % bis 6 % angereichert ist und dass ein Ausgangsniveau der Deuteriumanreicherung im Körperwasser schnell in 1 h erreicht und für die Dauer der Studie über 8 % angereichertes Trinkwasser aufrechterhalten wird (Abbildung 1). Die kontinuierliche stationäre Körperwasseranreicherung ist eine Annahme der in Schritt 6 verwendeten Berechnungen, ...

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Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

In dieser Arbeit stellen wir eine kostengünstige quantitative Methode vor, die Deuteriumoxid- und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) zur Analyse der Gesamtfettsäure-De-novo-Lipogenese in braunem Fettgewebe in vivo verwendet.

Quantitative Bestimmung der de novo Fettsäuresynthese im braunen Fettgewebe mittels Deuteriumoxid

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

Im Gegensatz zu anderen Stoffwechselwegen, wie z.B. der Glukoseentsorgung, wird die Fettsäuresynthese nicht routinemäßig bewertet, was zu unvollständigen Interpretationen des Stoffwechselstatus führt. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ nicht-invasiv ist und wahrscheinlich den Fluss der Fettsäuresynthese besser widerspiegelt als die Verwendung von isotopenmarkierter Glukose, bei der sich Änderungen in der vorgelagerten Glukosehandhabung auf die Ergebnisse auswirken können. Hier konzentrieren wir uns auf braunes Fettgewebe, aber diese Methode ist potenziell nützlich, um jedes Gewebe in jedem Mausmodell zu untersuchen.Legen Sie die Proben zunächst auf Trockeneis. Nehmen Sie ein voretikettiertes Mikrozentrifugenröhrchen, stellen Sie es auf eine Analysenwaage und tarieren Sie die Waage. Dann eine Pinzette und ein Skalpell oder eine Rasierklinge aus Stahl für 10 bis 20 Sekunden zum Abkühlen auf Trockeneis legen.Nehmen Sie die gefrorene Gewebeprobe mit der Pinzette aus dem Röhrchen und legen Sie sie auf ein Kunststoff-Gewichtsschiffchen, das auf einem flachen Trockeneisblock oder einer anderen vorgekühlten Oberfläche positioniert werden kann. Zerlegen Sie mit dem Skalpell oder der Rasierklinge aus Stahl einen kleinen Teil des Gewebes, der einem Gewicht von 5 bis 15 Milligramm entspricht, und legen Sie ihn in das Mikrozentrifugenröhrchen. Notieren Sie das genaue Gewicht und wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe.Zu jeder Probe wird ein Mikroliter pro Milligramm 10 Millimolar Hexadecansäure D31 gegeben, gefolgt von drei Fünf-Millimeter-Edelstahlperlen. Dann fügen Sie 250 Mikroliter Methanol, 250 Mikroliter Wasser und 500 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe mit Kügelchen hinzu. Legen Sie die Röhrchen in einen vorgekühlten Block einer Mahlmühle und mischen Sie die Proben fünf Minuten lang mit einer Vibrationsfrequenz von 25 Hertz.Entfernen Sie die Kügelchen mit einem Magneten und zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Mit einer Mikropipette wird ein festes Volumen der unteren Phase jeder Probe in entsprechend beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Geben Sie 500 Mikroliter Chloroform in die verbleibende Probe und wiederholen Sie diese Schritte.Die Röhrchen mit der vereinigten unteren Phase unter Stickstoffgas oder in ein chloroformbeständiges, gekühltes Zentrifugalvakuum bei vier Grad Celsius stellen, bis sie vollständig trocken sind. Pipettieren Sie 98 Milliliter wasserfreies Methanol in eine Glasmedienflasche. Und langsam zwei Milliliter wasserfreie Schwefelsäure in den Abzug geben, um 2%ige Schwefelsäure in Methanol zu erhalten.Mischen Sie, indem Sie die geschlossene Flasche schwenken. 500 Mikroliter dieser 2%igen Schwefelsäure in Methanollösung zu jeder Probe geben und kurz vortexen. Die Proben werden zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius auf dem Heizblock inkubiert und zu jeder Probe 100 Mikroliter gesättigte Natriumchloridlösung und 500 Mikroliter Hexan gegeben.Die Proben eine Minute lang bei Raumtemperatur kräftig vorziehen und eine Minute ruhen lassen. Danach sollten die beiden Phasen erkennbar sein. Sammeln Sie die obere Phase in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen.Wiederholen Sie dann die Zugabe von Hexan. Und nach der Phasentrennung sammeln Sie die Proben der zweiten oberen Phase in dieselben markierten Röhrchen. Trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur unter Stickstoffgas und resuspendieren Sie die Proben in 20 Mikrolitern Hexan pro Milligramm des ursprünglichen Gewebegewichts.Überführen Sie die Proben sofort in ein Glas-Gaschromatographie-Fläschchen mit Glaseinsatz. Injizieren Sie die Proben in ein einzelnes vierfaches Gaschromatographie-Massenspektrometer, um die Häufigkeit von Fettsäuremethylestern oder FAMEs-Isotopologen zu bestimmen. Injizieren Sie einen Mikroliter Probe in einen geteilten oder spaltfreien Einlass bei einer Eintrittstemperatur von 270 Grad Celsius unter Verwendung von Helium als Trägergas.Mischen Sie in beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen mit sicherem Verschluss 10 Mikroliter jeder Plasmaprobe oder standardmäßig vier Mikroliter 10 molares Natriumhydroxid und vier Mikroliter 5%iges Aceton in Acetonitril. Führen Sie dies für jede Probe in dreifacher Ausführung durch. Nach der Inkubation der Proben über Nacht bei Raumtemperatur werden 450 bis 550 Milligramm Natriumsulfat zu jeder Probe gegeben, 600 Mikroliter Chloroform in jedes Röhrchen im Abzug gegeben und 15 Sekunden lang kräftig gewirbelt.Die Proben werden zwei Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Nehmen Sie beschriftete Glas-GCMS-Fläschchen mit Glaseinsätzen und übertragen Sie das Dreifache und dann 80 Mikroliter Aliquots des Überstandes von jeder Probe in die Fläschchen. Verschließen Sie die Fläschchen für die GCMS-Analyse fest.Der prozentuale Anteil der D2O-Anreicherung im Plasma von Mäusen über mehrere Zeitpunkte ist hier dargestellt. Es wurde festgestellt, dass das Körperwasser im Bereich von 2,5 bis 6 % angereichert ist, dass ein Ausgangsniveau der Deuteriumanreicherung im Körperwasser schnell in einer Stunde erreicht und für die Dauer der Studie aufrechterhalten wird. Die Massenisotopologverteilung von Palmitat im braunen Fettgewebe nach dreitägiger D2O-Verabreichung bei Raumtemperatur und Thermoneutralität ist hier dargestellt.Dieses Ergebnis zeigt eine höhere M1- und M2-Deuteriumanreicherung bei Raumtemperatur. In dieser Abbildung sind die Anreicherung der Molaren des braunen Fettgewebes und die Anreicherung der Plasmamolaren einer Reihe von Fettsäuren nach dreitägiger D2O-Verabreichung bei Raumtemperatur und Thermoneutralität dargestellt. Die kältere Temperaturanreicherung wurde in einem breiten Spektrum von Fettsäuren im braunen Fettgewebe gefunden.Bemerkenswert ist, dass die Gesamtfettsäureanreicherung im Plasma nicht dem gleichen Trend folgt wie braunes Fettgewebe, sondern die Fettsäureanreicherung mit Thermoneutralität erhöht wird. Diese Bilder stellen die Gesamthäufigkeit und das de novo synthetisierte Palmitat im braunen Fettgewebe nach dreitägiger D2O-Verabreichung dar. Das Ergebnis zeigt eine Steigerung der Gesamtpalmitatsynthese bei Raumtemperatur.Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Fettsäuren auf dem GCMS laufen lassen. Stellen Sie sicher, dass Palmitat nicht überladen ist, da dies zu künstlich hohen Isotopenanreicherungswerten führen kann. Stellen Sie außerdem sicher, dass bei der Analyse von Aceton auf dem GCMS kein Hintergrund-Aceton-Peak vorhanden ist, bevor Sie die Proben ausführen, also lassen Sie Leerzeichen laufen, um jegliches Aceton aus dem System zu entfernen.Diese Methode betrachtet die Gesamtfettsäuren über mehrere Lipidklassen hinweg, aber wenn Sie verstehen möchten, wie sich die Fettsäuresynthese auf bestimmte Lipidklassen auswirkt, können Sie diese Lipidklassen zunächst durch Chromatographie trennen und dann Fettsäuren aus diesen Fraktionen extrahieren. Da die Lipogenese einen wichtigen Beitrag zur normalen Entwicklung, aber auch zu vielen Krankheiten leistet, kann dieses Protokoll in vielen Bereichen nützlich sein.

Research

JoVE Journal

Biology

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Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

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