Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
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貴重な議論をしてくれたSanchez-Gurmacches氏とWallace氏の研究室メンバーに感謝します。この研究は、米国心臓協会(18CDA34080527 から JSG に、19POST34380545 から RM に)、NIH (R21OD031907 JSG )、CCHMC Trustee Award、CCHMC Center for Pediatric Genomics Award、CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award からの助成金によって支援されました。この研究は、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのNIH P30 DK078392によって部分的に支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。RTとMWは、UCD Ad Astra Fellowshipの支援を受けました。

すべての実験は、シンシナティ小児病院医療センターの動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. D2Oの調製
注:実験のばらつきを避けるために、実験期間中、すべてのマウスに十分な溶液/飲料水を準備してください。
<ol><li>腹腔内注射の場合:D 2 Oのリットルあたり9 gのNaClを溶解することにより、0.9%w / v生理食塩水...

複雑な代謝経路間のバランスと相互作用を理解することは、代謝関連疾患の生物学的基盤を理解する上で不可欠なステップです。ここでは、de novo脂肪酸合成の変化を決定するための非侵襲的で安価な方法論を示します。この方法は、脂肪酸重水素濃縮31からのde novo合成フラックスを推定し、体内水中のD2Oの相対的な割合を決定するために重水素−アセ?...

肥満とそれに関連する代謝性疾患は、現在および将来の世代を危険にさらすパンデミックです1,2。肥満に関連する代謝調節不全は、エネルギー摂取量と消費の不均衡の結果として一般的に単純化されますが、環境因子および内因性因子によって制御される多数の代謝経路に影響を与えます3。しかし、代謝調節不全の動物モデルで日常的に検査されている経路はごくわずかです。
一例として、グルコース廃棄は、おそらくポータブルグルコースモニターの使用が簡単であるため、グルコースおよびインスリン負荷試験によって日常的に測定されます4。全身のグルコースと脂質の酸化相対速度も、間接熱量測定アッセイからの呼吸交換比に基づいて日常的に推定されます5,6。しかし、代謝の他のすべての側面の大部分は、日常的に機能的に評価されていません。.これにより、代謝状態の解釈が不完全になり、治療の選択肢が失われます。そのような主な経路の1つは、de novo脂肪形成です。
de novo脂肪生成(DNL)は、前駆体から新しい脂肪酸を生成するプロセスです。グルコースは全身DNLに寄与する主要な前駆体であると考えられています7が、酢酸、果糖、乳酸、分岐鎖アミノ酸などの他の前駆体は、空間的および条件依存的に関連する炭素源であることが示されています8,9,10,11,12。DNLは代謝ホメオスタシスに大きく貢献し、正常な発達に不可欠です13。さらに、DNLの変化は、癌14,15および代謝16,17,18および心血管疾患19,20に関連しています。
DNL経路は、コア酵素成分であるATPクエン酸リアーゼ(ACLY)、アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC1/2)、および脂肪酸合成酵素(FAS)で構成されており、主に炭素数16の飽和脂肪酸であるパルミチン酸を生成します。しかし、奇数鎖脂肪酸や分岐鎖脂肪酸もより低い速度で生産することができる9。伸長酵素と脱酸酵素は、これらの脂肪酸をさらに修飾し、さまざまな機能(例えば、長期のエネルギー貯蔵や膜流動性の操作)に有用な多様な脂肪酸種を作り出します。
DNL酵素機構の発現は、少数の転写因子によって制御されています。これまでに最もよく報告されたのは、ステロール調節要素結合タンパク質(SREBP)ファミリー、炭水化物応答要素結合タンパク質(ChREBP)、および肝臓X受容体(LXR)21,22,23,24,25,26です。それらの機能は明らかに重複しているにもかかわらず、細胞型の優勢と生理学的または病理学的状態に基づく個々の調節が報告されています21,22,27,28。
驚くべきことに、DNL経路の選択されたステップに対する多くの阻害剤は、肥満、非アルコール性脂肪性肝疾患/非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD/NASH)、および心血管疾患を含む多くの疾患に対して臨床使用が承認されているか、前臨床または臨床開発段階にあります29。これらの取り組みは、健康と病気におけるDNLの関連性を強調しています。
近年、de novo脂肪酸合成を定量的に評価する方法の採用が増加しています30。これを評価するための最も一般的な方法は、重標識水(D2O)の使用であり、重標識水素は、DNL基質NAPDH、アセチルCoA、およびマロニルCoAの水素との重水素交換を介して、合成中に直接的および間接的にアシル鎖に取り込まれます。このアプローチは人気が高まっていますが、この分野の新規参入者に適した公開されている詳細なプロトコルが不足しています。ここでは、Lee et al.31 によって以前に開発された計算を使用して、D2O およびガスクロマトグラフィー質量分析法 (GCMS) を使用して、FAS の生成物の de novo 合成を定量的に評価する方法を概説します。この方法は、炭素源とは無関係にde novo脂肪酸合成を測定するため、ほぼすべての組織、あらゆるマウスモデル、および外部摂動下で役立つ可能性があります。ここでは、DNLのレベルが高く、代謝恒常性の維持に重要な役割を果たす褐色脂肪組織(BAT)の分析に焦点を当てています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

脂肪酸合成は、全身代謝ホメオスタシスやその他の生理学的および病理学的プロセスの制御において重要な機能的役割を果たす、複雑でエネルギーを必要とする代謝経路です。グルコース処理などの他の主要な代謝経路とは対照的に、脂肪酸合成は日常的に機能的に評価されていないため、代謝状態の解釈が不完全です。さらに、この分野の新規参入者に適した公開されている詳細なプロトコルが不足しています。ここでは、in vivoでの褐色脂肪組織における全脂肪酸de novo合成の分析のために、酸化重水素とガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS)を利用した安価な定量法について説明します。この方法は、炭素源とは無関係に脂肪酸合成酵素の生成物の合成を測定するものであり、事実上すべての組織、任意のマウスモデル、および外部摂動下で潜在的に有用です。GCMSのサンプル調製とダウンストリーム計算の詳細が記載されています。褐色脂肪は、高レベルのde novo脂肪酸合成と代謝恒常性の維持に重要な役割を果たすため、分析に焦点を当てています。

ステップ1で説明したD2O投与量に基づいて、我々は典型的に、体内水分が2.5%から6%の範囲で濃縮され、体内水分中の重水素濃縮のベースラインレベルが1時間で急速に達成され、8%濃縮飲料水 を介して 研究期間中維持されることを見出す(図1)。継続的な定常状態の体内水分濃縮は、ステップ 6 で使用される計算の仮定であるため、新しい実験モデルで体内?...

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Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

ここでは、in vivoで褐色脂肪組織における全脂肪酸de novo脂肪生成を分析するために、酸化重水素とガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS)を利用した安価な定量法を紹介します。

酸化重水素を用いた褐色脂肪組織における de novo 脂肪酸合成の定量的測定(英語)

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

グルコース処理などの他の代謝経路とは対照的に、脂肪酸合成は日常的に評価されていないため、代謝状態の解釈が不完全です。この方法の主な利点は、比較的非侵襲的であり、上流のグルコース処理の変化が結果に影響を与える可能性のある同位体標識グルコースを使用するよりも、脂肪酸合成フラックスをよりよく反映する可能性が高いことです。ここでは褐色脂肪組織に焦点を当てていますが、この方法は、あらゆるマウスモデルのあらゆる組織を研究するのに役立つ可能性があります。まず、サンプルをドライアイスの上に置きます。事前にラベル付けされた微量遠心チューブを用意し、分析天びんの上に置き、天びんを風袋引きします。次に、ピンセットとメスまたはスチールカミソリの刃をドライアイスの上に10〜20秒間置き、冷まします。ピンセットを使用して凍結組織サンプルをチューブから取り出し、ドライアイスの平らなブロックまたは別の予冷された表面に配置できるプラスチック製のウェイトボートに置きます。メスまたはスチール製のカミソリの刃を使用して、重量5〜15ミリグラムに相当する組織のごく一部を解剖し、微量遠心チューブに入れます。正確な重量を記録し、各試験片について繰り返します。10ミリモルのヘキサデカン酸D31酸を1ミリグラムあたり1マイクロリットル添加し、続いて5ミリメートルのステンレス鋼ビーズを3個各サンプルに加えます。次に、250マイクロリットルのメタノール、250マイクロリットルの水、および500マイクロリットルのクロロホルムをビーズで各サンプルに加えます。粉砕機の予冷ブロックにチューブを入れ、25ヘルツの振動周波数でサンプルを5分間混合します。磁石を使用してビーズを取り外し、サンプルを 12 、 000 G で 4 °C で 10 分間遠心分離します。マイクロピペットを使用して、各サンプルの底相を一定容量で、対応するラベルの付いた微量遠心チューブに入れます。残りのサンプルに500マイクロリットルのクロロホルムを加え、これらの手順を繰り返します。結合した下相のチューブを窒素ガス下に置くか、クロロホルム耐性の冷蔵遠心真空に摂氏4度で完全に乾くまで置きます。98ミリリットルの無水メタノールをガラス培地ボトルにピペットで移します。そして、ドラフトに2ミリリットルの無水硫酸をゆっくりと加えて、メタノールに2%の硫酸を作ります。閉じたボトルをくるくる回して混ぜます。この2%硫酸をメタノール溶液に500マイクロリットルずつ各サンプルに加え、短時間ボルテックスします。ヒートブロック上でサンプルを摂氏50度で2時間インキュベートし、各サンプルに100マイクロリットルの飽和塩化ナトリウム溶液と500マイクロリットルのヘキサンを加えます。サンプルを室温で1分間激しくボルテックスし、サンプルを1分間放置します。この後、2つのフェーズが明らかになります。上相を新しい微量遠心チューブに集めます。次に、ヘキサンの添加を繰り返します。そして、相分離後、2番目の上相サンプルを同じラベル付きチューブに集めます。サンプルを窒素ガス下で室温で乾燥させ、元の組織重量1ミリグラムあたり20マイクロリットルのヘキサンにサンプルを再懸濁します。サンプルをガラスインサート付きのガラスガスクロマトグラフィーバイアルにすぐに移します。サンプルを 1 台のクワッドガスクロマトグラフィー質量分析計に注入して、脂肪酸メチルエステル(FAME)同位体の存在量を測定します。ヘリウムをキャリアガスとして使用して、1マイクロリットルのサンプルを、摂氏270度の入口温度でスプリットまたはスプリットレスインレットに注入します。ラベル付きセーフロック微量遠心チューブでは、各血漿サンプル10マイクロリットル、または標準4マイクロリットルの10モル水酸化ナトリウムと4マイクロリットルの5%アセトンをアセトニトリルに混ぜ合わせます。これをサンプルごとに 3 回に分けて実行します。サンプルを室温で一晩インキュベートした後、各サンプルに450〜550ミリグラムの硫酸ナトリウムを加え、ドラフト内の各チューブに600マイクロリットルのクロロホルムを加え、15秒間激しくボルテックスします。サンプルを 300 G で 2 分間遠心分離します。ガラスインサート付きのラベル付きガラス製GCMSバイアルを用意し、上清のトリプリケートと80マイクロリットルのアリコートを各サンプルからバイアルに移します。GCMS 分析のためにバイアルをしっかりとキャップします。複数の時点におけるマウスの血漿中のD2O濃縮の割合をここに示します。体水は2.5〜6%の範囲で濃縮され、体内水分中の重水素濃縮のベースラインレベルが1時間で急速に達成され、研究期間中維持されることがわかりました。室温、熱中性で D2O を 3 日間投与した後の褐色脂肪組織中のパルミチン酸の質量同位体分布をここに示します。この結果は、室温でより高いM1およびM2重水素濃縮を示しています。室温で熱中性で3日間のD2O投与後の褐色脂肪組織のモル濃縮とさまざまな脂肪酸の血漿モル濃縮をこの図に示します。低温の濃縮は、褐色脂肪組織の幅広い脂肪酸に見られました。特に、血漿中の総脂肪酸濃縮は褐色脂肪組織と同じ傾向をたどりませんが、代わりに、脂肪酸濃縮は熱中性とともに増加します。これらの画像は、D2O投与の3日後の褐色脂肪組織中の総存在量とde novo合成パルミチン酸を表しています。結果は、室温での総パルミチン酸合成の増加を示しています。GCMSで脂肪酸を泳動させる場合は注意が必要です。パルミチン酸は人為的に高い同位体濃縮値を与える可能性があるため、過負荷にならないようにしてください。また、GCMS でアセトンを分析する場合は、サンプルを分析する前にバックグラウンドアセトンピークがないことを確認し、ブランクを実行してシステム内のアセトンを除去してください。この方法では、複数の脂質クラスにわたる総脂肪酸を調べますが、脂肪酸合成が特定の脂質クラスにどのような影響を与えているかを理解したい場合は、まずクロマトグラフィーを使用してこれらの脂質クラスを分離し、次にこれらの画分から脂肪酸を抽出します。脂肪生成は正常な発生だけでなく、多くの疾患にも重要な貢献者であるため、このプロトコルは多くの分野で有用です。

Research

JoVE Journal

Biology

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