Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Vi takker Sanchez-Gurmaches og Wallace lab medlemmer for verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Heart Association (18CDA34080527 til JSG og 19POST34380545 til RM), NIH (R21OD031907 til JSG), en CCHMC Trustee Award, en CCHMC Center for Pediatric Genomics Award, og en CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH P30 DK078392 av Digestive Diseases Research Core Center i Cincinnati. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. RT og MW ble støttet av et UCD Ad Astra Fellowship.

Alle eksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Fremstilling av D2O
MERK: For å unngå eksperimentell variasjon, lag tilstrekkelig løsning/drikkevann for alle mus i løpet av forsøket.
<ol><li>For intraperitoneal injeksjon: generer 0,9% w / v saltvann D 2 O ved å oppløse 9 g NaCl per liter D 2 O. Filtrer gjennom etikke-pyrogent0,2</...

Å forstå balansen og samspillet mellom komplekse metabolske veier er et uunnværlig skritt mot å forstå det biologiske grunnlaget for metabolske relaterte sykdommer. Her viser vi en ikke-invasiv og billig metodikk for å bestemme endringer i de novo fettsyresyntese. Denne metoden er tilpasset fra tidligere publiserte metoder som utviklet beregninger for estimering av de novo syntesefluks fra fettsyre deuteriumanrikning31 og for bruk av deuterium-acetonutveksling for å bestem...

Fedme og tilhørende metabolske sykdommer er en pandemi som truer nåværende og fremtidige generasjoner 1,2. Vanligvis forenklet som følge av ubalansen mellom energiinntak og forbruk, påvirker metabolsk dysregulering forbundet med fedme et stort antall metabolske veier kontrollert av miljømessige og endogene faktorer3. Imidlertid blir bare noen få veier rutinemessig testet i dyremodeller av metabolsk dysregulering.
Som et eksempel måles glukoseavhending rutinemessig ved glukose- og insulintoleransetester, sannsynligvis på grunn av enkelheten ved å bruke bærbare glukosemonitorer4. Relative rater for glukose og lipidoksidasjon for hele kroppen estimeres også rutinemessig basert på respiratorisk utvekslingsforhold fra indirekte kalorimetrianalyser 5,6. Imidlertid blir flertallet av alle andre aspekter av metabolisme ikke rutinemessig funksjonelt vurdert. Dette fører til ufullstendige tolkninger av metabolsk status og tapte terapeutiske alternativer. En av de viktigste slike veier er de novo lipogenese.
De novo lipogenese (DNL) er prosessen der nye fettsyrer genereres fra forløpere. Glukose anses å være den viktigste forløperen som bidrar til hele kroppen DNL7, men andre forløpere, som acetat, fruktose, laktat og forgrenede aminosyrer, har vist seg å være relevante karbonkilder på en romlig og tilstandsavhengig måte 8,9,10,11,12. DNL er en viktig bidragsyter til metabolsk homeostase og er avgjørende for normal utvikling13. I tillegg har endringer i DNL vært assosiert med kreft 14,15 og metabolsk 16,17,18 og hjerte- og karsykdommer 19,20.
DNL-banen består av kjerneenzymatiske komponenter ATP-citratlyase (ACLY), acetyl-CoA-karboksylase (ACC1/2) og fettsyresyntase (FAS) som primært produserer palmitat, en 16-karbon mettet fettsyre. Imidlertid kan oddekjedede og forgrenede fettsyrer også produseres ved lavere hastigheter9. Elongaser og desaturaser modifiserer disse fettsyrene ytterligere, og skaper et mangfoldig utvalg av fettsyrer som er nyttige for en rekke funksjoner (f.eks. Langsiktig energilagring og manipulering av membranfluiditet).
Ekspresjonen av DNLs enzymatiske maskineri styres av et kort antall transkripsjonsfaktorer. De mest beskrevne til dags dato inkluderer sterol regulatorisk element bindende protein (SREBP) familie, karbohydratresponselement bindende protein (ChREBP) og lever X-reseptor (LXR) 21,22,23,24,25,26. Til tross for en tilsynelatende overlapping i deres funksjoner, har individuelle forskrifter basert på celletypedominans og fysiologiske eller patologiske forhold blitt rapportert21,22,27,28.
Bemerkelsesverdig nok har en rekke hemmere for utvalgte trinn i DNL-banen blitt godkjent for klinisk bruk eller er i prekliniske eller kliniske utviklingsstadier for en rekke sykdommer, inkludert fedme, ikke-alkoholholdig fettleversykdom / ikke-alkoholisk steatohepatitt (NAFLD / NASH) og kardiovaskulær sykdom29. Disse anstrengelsene fremhever relevansen av DNL i helse og sykdom.
I de senere år har bruken av metoder for kvantitativt å vurdere de novo fettsyresyntese økt30. Den vanligste metoden for å vurdere dette er bruk av tungt merket vann (D2O), der det tungt merkede hydrogenet blir inkorporert i acylkjeder under syntese både direkte og indirekte, via deuteriumutveksling med hydrogenene i DNL-substratene NAPDH, acetyl-CoA og malonyl-CoA. Selv om denne tilnærmingen blir stadig mer populær, mangler det offentlig tilgjengelige detaljerte protokoller som passer for nykommere i feltet. Her skisserer vi en metode for kvantitativt å vurdere de novo-syntesen av produkter av FAS ved bruk av D2O og gasskromatografi massespektrometri (GCMS), med beregninger tidligere utviklet av Lee et al.31. Denne metoden måler de novo fettsyresyntese uavhengig av en karbonkilde, og den er potensielt nyttig for nesten alle vev, i hvilken som helst musemodell, og under enhver ekstern forstyrrelse. Her fokuserer vi på analysen av brunt fettvev (BAT) på grunn av dets høye nivåer av DNL og kritiske roller i å opprettholde metabolsk homeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

Fettsyresyntese er en kompleks og svært energikrevende metabolsk vei med viktige funksjonelle roller i kontrollen av helkroppens metabolske homeostase og andre fysiologiske og patologiske prosesser. I motsetning til andre viktige metabolske veier, som glukoseavhending, blir fettsyresyntese ikke rutinemessig funksjonelt vurdert, noe som fører til ufullstendige tolkninger av metabolsk status. I tillegg mangler det offentlig tilgjengelige detaljerte protokoller som passer for nykommere i feltet. Her beskriver vi en billig kvantitativ metode som benytter deuteriumoksid og gasskromatografi massespektrometri (GCMS) for analyse av total fettsyre de novo-syntese i brunt fettvev in vivo. Denne metoden måler syntesen av produktene av fettsyresyntase uavhengig av en karbonkilde, og den er potensielt nyttig for nesten hvilket som helst vev, i hvilken som helst musemodell og under enhver ekstern forstyrrelse. Detaljer om prøveforberedelsen for GCMS og nedstrømsberegninger er gitt. Vi fokuserer på analysen av brunt fett på grunn av dets høye nivåer av de novo fettsyresyntese og kritiske roller i å opprettholde metabolsk homeostase.

Basert på doseringen av D 2 O beskrevet i trinn 1, finner vi vanligvis at kroppsvann anrikes i området2,5% til 6 %, og at et baselinenivå av deuteriumanrikning i kroppsvann raskt oppnås i løpet av 1 time og opprettholdes i løpet av studien via 8 % anriket drikkevann (figur 1). Kontinuerlig steady state kroppsvannberikelse er en forutsetning for beregningene som ble brukt i trinn 6, og vi anbefaler derfor eksperimentell validering av kinetikken til kroppsvannberikels...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Her presenterer vi en billig kvantitativ metode som benytter deuteriumoksid og gasskromatografi massespektrometri (GCMS) for analyse av total fettsyre de novo lipogenese i brunt fettvev in vivo.

Kvantitativ bestemmelse av de novo fettsyresyntese i brunt fettvev ved bruk av deuteriumoksid

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

I motsetning til andre metabolske veier som glukoseavhending, blir fettsyresyntese ikke rutinemessig vurdert, noe som fører til ufullstendige tolkninger av metabolsk status. De viktigste fordelene med denne metoden er at den er relativt ikke-invasiv, og det er sannsynligvis en bedre refleksjon av fettsyresyntesefluks enn å bruke isotopmerket glukose der endringer i oppstrøms glukosehåndtering kan påvirke resultatene. Her fokuserer vi på brunt fettvev, men denne metoden er potensielt nyttig for å studere hvilket som helst vev i en hvilken som helst musemodell.For å begynne, legg prøvene på tørris. Ta et forhåndsmerket mikrosentrifugerør, plasser det på en analytisk vekt og ta balansen på vekten. Legg deretter pinsett og en skalpell eller barberblad av stål på tørris i 10 til 20 sekunder for å avkjøles.Bruk pinsetten til å ta den frosne vevsprøven ut av røret og legg den på en plastvektbåt, som kan plasseres på en flat blokk med tørris eller en annen forkjølt overflate. Bruk skalpellen eller stålbarberbladet, dissekere en liten del av vevet tilsvarende 5 til 15 milligram i vekt, og legg det i mikrosentrifugerøret. Registrer nøyaktig vekt og gjenta for hvert eksemplar.Tilsett en mikroliter per milligram 10 millimolar heksadekanoisk D31-syre, etterfulgt av tre fem millimeter rustfrie stålperler til hver prøve. Deretter tilsettes 250 mikroliter metanol, 250 mikroliter vann og 500 mikroliter kloroform til hver prøve med perler. Plasser rørene i en forkjølt blokk av et slipeverk og bland prøvene med en vibrasjonsfrekvens på 25 hertz i fem minutter.Fjern perlene ved hjelp av en magnet og sentrifuge prøvene ved 12.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Bruk en mikropipette til å ta et fast volum av bunnfasen av hver prøve inn i tilsvarende merkede mikrosentrifugerør. Tilsett 500 mikroliter kloroform til den gjenværende prøven og gjenta disse trinnene.Plasser rørene med den kombinerte nedre fasen under nitrogengass eller i et kloroformresistent nedkjølt sentrifugalvakuum ved fire grader Celsius til det er helt tørt. Pipette 98 ml vannfri metanol i en glassmedieflaske. Og tilsett sakte to milliliter vannfri svovelsyre i avtrekkshetten for å lage 2% svovelsyre i metanol.Bland ved å virvle den lukkede flasken. Tilsett 500 mikroliter av denne 2% svovelsyre i metanoloppløsning til hver prøve og hvirvel kort. Inkuber prøvene på varmeblokken ved 50 grader Celsius i to timer og tilsett 100 mikroliter mettet natriumkloridoppløsning og 500 mikroliter heksan til hver prøve.Virv prøvene kraftig i romtemperatur i ett minutt og la prøvene sitte i ett minutt. De to fasene skal være tydelige etter dette. Samle den øvre fasen i et nytt mikrosentrifugerør.Gjenta deretter tilsetningen av heksan. Og etter faseseparasjon, samle de andre øvre faseprøvene i de samme merkede rørene. Tørk prøvene ved romtemperatur under nitrogengass og resuspender prøvene i 20 mikroliter heksan per milligram opprinnelig vevsvekt.Overfør prøvene umiddelbart til et hetteglass med glassgasskromatografi med en glassinnsats. Injiser prøvene i et enkelt firedobbelt gasskromatografi massespektrometer for å bestemme overflod av fettsyremetylestere eller FAMEs isotopologer. Injiser en mikroliter prøve i et delt eller delt innløp ved en innløpstemperatur på 270 grader Celsius ved bruk av helium som bærergass.I merkede safe-lock mikrosentrifugerør, kombiner 10 mikroliter av hver plasmaprøve eller standard fire mikroliter 10 molar natriumhydroksid og fire mikroliter 5% aceton i acetonitril. Utfør dette i triplikat for hver prøve. Etter å ha inkubert prøvene over natten ved romtemperatur, tilsett 450 til 550 milligram natriumsulfat til hver prøve, tilsett 600 mikroliter kloroform til hvert rør i avtrekkshetten, og kraftig virvel i 15 sekunder.Sentrifuge prøvene ved 300 G i to minutter. Ta GCMS-hetteglass av merket glass med glassinnlegg og overfør de triplikate og deretter 80 mikroliters alikotene av supernatanten fra hver prøve til hetteglassene. Sett lokket på hetteglassene godt for GCMS-analysen.Prosentandelen av D2O-anrikning i plasma av mus over flere tidspunkter er vist her. Det ble funnet at kroppsvann er anriket i området 2,5 til 6% at et baseline nivå av deuteriumanrikning i kroppsvann raskt oppnås på en time og opprettholdes i løpet av studien. Masseisotopologfordelingen av palmitat i brunt fettvev etter tre dager med D2O-administrasjon ved romtemperatur og termonøytralitet er vist her.Dette resultatet viser en høyere M1 og M2 deuteriumanrikning ved romtemperatur. Brun fettvevsmolær anrikning og plasmamolær anrikning av en rekke fettsyrer etter tre dager med D2O-administrasjon ved romtemperatur og termonøytralitet er presentert i denne figuren. Den kaldere temperaturberikelsen ble funnet i et bredt spekter av fettsyrer i brunt fettvev.Spesielt følger plasma total fettsyreanrikning ikke samme trend som brunt fettvev, men i stedet økes fettsyreanrikningen med termonøytralitet. Disse bildene representerer den totale overflod og de novo syntetiserte palmitat i brunt fettvev etter tre dager med D2O-administrasjon. Resultatet viser en økning i total palmitatsyntese ved romtemperatur.Vær forsiktig når du kjører fettsyrer på GCMS. Pass på at palmitat ikke er overbelastet, da det bare kan gi kunstig høye isotopanrikningsverdier. I tillegg, når du analyserer aceton på GCMS, må du kontrollere at det ikke er noen bakgrunns acetontopp før du kjører prøvene, så kjør emner for å fjerne aceton i systemet.Denne metoden ser på totale fettsyrer over flere lipidklasser, men hvis du vil forstå hvordan fettsyresyntese påvirker spesifikke lipidklasser, kan du først skille disse lipidklassene ved hjelp av kromatografi og deretter trekke ut fettsyrer fra disse fraksjonene. Fordi lipogenese er en viktig bidragsyter til normal utvikling, men også til mange sykdommer, kan denne protokollen være nyttig på mange felt.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein visdom; Workbench for<em&gt; I silikon</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design av biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse av fettsyreoksidasjon og lipogenese i Mouse primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Metoder for bestemmelse av priser av glukose og fettsyreoksidasjon i isolerte Working Rat Hjerte

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generasjon av somatiske stamceller ved YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Syntese av 68Ga Core-dopet jernoksid nanopartikler dobbelt fantes et Positron utslipp stengte / (T1) magnetisk resonans Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Vurdering av de novo proteinsyntese priser i caenorhabditt elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering og identifisering av mesenkymale stamceller avledet fra fettvev av Sprague Dawley-rotter

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

Decellulariseringsbasert kvantifisering av skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...