Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
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Agradecemos aos membros do laboratório Sanchez-Gurmaches e Wallace pelas valiosas discussões. Este trabalho foi apoiado por subsídios da American Heart Association (18CDA34080527 para JSG e 19POST34380545 para RM), do NIH (R21OD031907 para JSG), um CCHMC Trustee Award, um CCHMC Center for Pediatric Genomics Award e um CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH P30 DK078392 do Digestive Diseases Research Core Center em Cincinnati. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. RT e MW foram apoiados por uma UCD Ad Astra Fellowship.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Preparação de D2O
NOTA: Para evitar variações experimentais, prepare solução/água potável suficiente para todos os ratos durante a duração do experimento.
<ol><li>Para injeção intraperitoneal: gerar 0,9% p/v de solução salina D 2 O dissolvendo 9 g de NaCl por litro de D 2</...

A compreensão do equilíbrio e da interação entre vias metabólicas complexas é um passo indispensável para a compreensão das bases biológicas das doenças relacionadas ao metabolismo. Aqui, mostramos uma metodologia não invasiva e de baixo custo para determinar alterações na síntese de novos ácidos graxos. Este método é adaptado de métodos publicados anteriormente que desenvolveram cálculos para estimar o fluxo de síntese de novo a partir do enriquecimento de deutério com ácidos graxos<sup cl...

A obesidade e as doenças metabólicas associadas constituem uma pandemia que coloca em risco as gerações presentes e futuras 1,2. Comumente simplificada como consequência do desequilíbrio entre ingestão e gasto energético, a desregulação metabólica associada à obesidade afeta um grande número de vias metabólicas controladas por fatores ambientais eendógenos3. No entanto, apenas algumas vias são rotineiramente testadas em modelos animais de desregulação metabólica.
Como exemplo, a disponibilidade de glicose é rotineiramente medida por testes de tolerância à glicose e à insulina, provavelmente devido à simplicidade do uso de monitores portáteis de glicose4. As taxas relativas de glicose de corpo inteiro e oxidação lipídica também são rotineiramente estimadas com base na razão de troca respiratória de ensaios de calorimetria indireta 5,6. No entanto, a maioria de todos os outros aspectos do metabolismo não é rotineiramente avaliada funcionalmente. Isso leva a interpretações incompletas do estado metabólico e opções terapêuticas perdidas. Uma das principais vias é a lipogênese de novo.
A lipogênese de novo (DNL) é o processo pelo qual novos ácidos graxos são gerados a partir de precursores. A glicose é considerada o principal precursor que contribui para o DNL7 de corpo inteiro, porém outros precursores, como acetato, frutose, lactato e aminoácidos de cadeia ramificada, têm se mostrado fontes relevantes de carbono de forma espacial e dependente da condição 8,9,10,11,12. A DNL é um importante contribuinte para a homeostase metabólica e é essencial para o desenvolvimento normal13. Além disso, alterações no DNL têm sido associadas a câncer14,15 e metabólicos16,17,18 e doenças cardiovasculares19,20.
A via DNL é composta pelos componentes enzimáticos centrais ATP citrato liase (ACLY), acetil-CoA carboxilase (ACC1/2) e ácido graxo sintase (FAS) que produzem principalmente palmitato, um ácido graxo saturado de 16 carbonos. No entanto, ácidos graxos de cadeia ímpar e cadeia ramificada também podem ser produzidos em taxas mais baixas9. Elongases e desaturases modificam ainda mais esses ácidos graxos, criando uma gama diversificada de espécies de ácidos graxos úteis para uma variedade de funções (por exemplo, armazenamento de energia a longo prazo e manipulação da fluidez da membrana).
A expressão da maquinaria enzimática DNL é controlada por um pequeno número de fatores de transcrição. Os mais bem descritos até o momento incluem a família de proteínas ligadoras de elementos regulatórios esteróis (SREBP), proteínas ligadoras de elementos de resposta a carboidratos (ChREBP) e receptores X hepáticos (LXR)21,22,23,24,25,26. Apesar de uma aparente sobreposição em suas funções, regulações individuais baseadas na dominância do tipo celular e condições fisiológicas ou patológicas têm sido relatadas21,22,27,28.
Notavelmente, vários inibidores para etapas selecionadas da via DNL foram aprovados para uso clínico ou estão nos estágios pré-clínicos ou clínicos de desenvolvimento para uma série de doenças, incluindo obesidade, doença hepática gordurosa não alcoólica/esteatohepatite não alcoólica (DHGNA/EHNA) e doença cardiovascular29. Esses esforços destacam a relevância da DNL na saúde e na doença.
Nos últimos anos, o emprego de métodos para avaliar quantitativamente a síntese de novos ácidos graxos tem aumentado30. O método mais comum para avaliar isso é o uso de água marcada pesada (D2O), onde o hidrogênio marcado pesado é incorporado às cadeias acilas durante a síntese direta e indiretamente, via troca de deutério com os hidrogênios dos substratos DNL NAPDH, acetil-CoA e malonil-CoA. Embora essa abordagem esteja ganhando popularidade, há uma falta de protocolos detalhados disponíveis publicamente adequados para recém-chegados no campo. Aqui, delineamos um método para avaliar quantitativamente a síntese de novo de produtos de FAS usando D2O e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS), com cálculos previamente desenvolvidos por Lee et al.31. Este método mede a síntese de novos ácidos graxos independentemente de uma fonte de carbono, e é potencialmente útil para praticamente qualquer tecido, em qualquer modelo de camundongo e sob qualquer perturbação externa. Aqui, nos concentramos na análise do tecido adiposo marrom (BAT) devido aos seus altos níveis de DNL e papéis críticos na manutenção da homeostase metabólica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

A síntese de ácidos graxos é uma via metabólica complexa e altamente exigente em energia, com importantes papéis funcionais no controle da homeostase metabólica de todo o corpo e de outros processos fisiológicos e patológicos. Ao contrário de outras vias metabólicas importantes, como o descarte de glicose, a síntese de ácidos graxos não é rotineiramente avaliada funcionalmente, levando a interpretações incompletas do estado metabólico. Além disso, há uma falta de protocolos detalhados disponíveis publicamente adequados para os recém-chegados no campo. Aqui, descrevemos um método quantitativo de baixo custo utilizando óxido de deutério e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) para a análise da síntese de novos ácidos graxos totais em tecido adiposo marrom in vivo. Este método mede a síntese dos produtos da sintase de ácidos graxos independentemente de uma fonte de carbono, e é potencialmente útil para praticamente qualquer tecido, em qualquer modelo de camundongo e sob qualquer perturbação externa. São fornecidos detalhes sobre a preparação da amostra para o GCMS e os cálculos a jusante. Nós nos concentramos na análise da gordura marrom devido aos seus altos níveis de síntese de novos ácidos graxos e papéis críticos na manutenção da homeostase metabólica.

Com base na dosagem de D 2 O descrita na etapa 1, tipicamente descobrimos que a água corporal é enriquecida na faixa de2,5% a 6%, e que um nível basal de enriquecimento de deutério em água corporal é rapidamente alcançado em 1 h e mantido durante o estudo por meio de 8% de água potável enriquecida (Figura 1). O enriquecimento contínuo de água corporal em estado estacionário é uma suposição dos cálculos utilizados na etapa 6, e por isso recomendamos a valid...

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Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Apresentamos um método quantitativo de baixo custo utilizando óxido de deutério e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) para a análise da lipogênese de novo de ácidos graxos totais em tecido adiposo marrom in vivo.

Determinação quantitativa da síntese de novos ácidos graxos em tecido adiposo marrom utilizando óxido de deutério

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

Ao contrário de outras vias metabólicas, como o descarte de glicose, a síntese de ácidos graxos não é rotineiramente avaliada, levando a interpretações incompletas do estado metabólico. Os principais benefícios deste método é que ele é relativamente não invasivo, e é provavelmente um reflexo melhor do fluxo de síntese de ácidos graxos do que o uso de glicose marcada com isótopos, onde mudanças na manipulação de glicose a montante podem afetar os resultados. Aqui, nos concentramos no tecido adiposo marrom, mas este método é potencialmente útil para estudar qualquer tecido em qualquer modelo de camundongo.Para começar, coloque as amostras em gelo seco. Pegue um tubo de microcentrífuga pré-marcado, coloque-o em uma balança analítica e amarre a balança. Em seguida, coloque uma pinça e um bisturi ou lâmina de barbear de aço sobre gelo seco por 10 a 20 segundos para esfriar.Use a pinça para retirar a amostra de tecido congelado do tubo e colocá-la em um barco de peso plástico, que pode ser posicionado em um bloco plano de gelo seco ou outra superfície pré-resfriada. Usando o bisturi ou lâmina de barbear de aço, disseque uma pequena porção do tecido equivalente a 5 a 15 miligramas de peso e coloque-o no tubo de microcentrífuga. Registre o peso exato e repita para cada amostra.Adicionar um microlitro por miligrama de ácido hexadecanóico D31 de 10 milimolares seguido de três esferas de aço inoxidável de cinco milímetros a cada amostra. Em seguida, adicione 250 microlitros de metanol, 250 microlitros de água e 500 microlitros de clorofórmio a cada amostra com miçangas. Coloque os tubos num bloco pré-arrefecido de um moinho e misture as amostras a uma frequência vibracional de 25 hertz durante cinco minutos.Retire as contas usando um ímã e centrifugar as amostras a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Usando uma micropipeta, pegue um volume fixo da fase inferior de cada amostra em tubos de microcentrífuga correspondentemente marcados. Adicione 500 microlitros de clorofórmio à amostra restante e repita estes passos.Coloque os tubos com a fase inferior combinada sob gás nitrogênio ou em um vácuo centrífugo refrigerado resistente ao clorofórmio a quatro graus Celsius até secar completamente. Pipetar 98 mililitros de metanol anidro para uma garrafa de meio de vidro. E adicione lentamente dois mililitros de ácido sulfúrico anidro no exaustor para fazer 2% de ácido sulfúrico em metanol.Misture girando o frasco fechado. Adicione 500 microlitros deste ácido sulfúrico a 2% em solução de metanol a cada amostra e volte brevemente. Incubar as amostras no bloco térmico a 50 graus Celsius durante duas horas e adicionar 100 microlitros de solução saturada de cloreto de sódio e 500 microlitros de hexano a cada amostra.Vórtice as amostras vigorosamente à temperatura ambiente durante um minuto e deixe as amostras sentar-se durante um minuto. As duas fases devem ser aparentes depois disso. Recolha a fase superior num tubo de microcentrífuga fresco.Em seguida, repita a adição de hexano. E após a separação de fases, colete as amostras da segunda fase superior nos mesmos tubos marcados. Secar as amostras à temperatura ambiente sob gás nitrogênio e ressuspender as amostras em 20 microlitros de hexano por miligrama de peso do tecido original.Transfira imediatamente as amostras para um frasco para injetáveis de cromatografia gasosa de vidro com uma pastilha de vidro. Injectar as amostras num único espectrómetro de massas por cromatografia gasosa quádrupla para determinar a abundância de ésteres metílicos de ácidos gordos ou isotopólogos FAME. Injete um microlitro de amostra em uma entrada dividida ou sem divisão a uma temperatura de entrada de 270 graus Celsius usando hélio como gás transportador.Em tubos de microcentrífuga marcados, combinar 10 microlitros de cada amostra de plasma ou quatro microlitros padrão de hidróxido de sódio 10 molar e quatro microlitros de acetona 5% em acetonitrila. Execute isso em triplicata para cada amostra. Depois de incubar as amostras durante a noite à temperatura ambiente, adicione 450 a 550 miligramas de sulfato de sódio a cada amostra, adicione 600 microlitros de clorofórmio a cada tubo no exaustor e agite vigorosamente durante 15 segundos.Centrifugar as amostras a 300 G durante dois minutos. Pegue frascos de vidro rotulados com pastilhas de vidro e transfira a triplicata e, em seguida, alíquotas de 80 microlitros do sobrenadante de cada amostra para os frascos. Tampe bem os frascos para a análise do GCMS.A porcentagem de enriquecimento de D2O no plasma de camundongos em vários pontos de tempo é mostrada aqui. Verificou-se que a água corporal é enriquecida na faixa de 2,5 a 6% que um nível basal de enriquecimento de deutério na água corporal é rapidamente alcançado em uma hora e mantido durante o estudo. A distribuição isotopológica de massa do palmitato no tecido adiposo marrom após três dias de administração de D2O à temperatura ambiente e termoneutralidade é mostrada aqui.Este resultado mostra um maior enriquecimento de deutério M1 e M2 à temperatura ambiente. O enriquecimento molar do tecido adiposo marrom e o enriquecimento molar plasmático de uma variedade de ácidos graxos após três dias de administração de D2O à temperatura ambiente e termoneutralidade são apresentados nesta figura. O enriquecimento com temperatura mais fria foi encontrado em uma ampla gama de ácidos graxos no tecido adiposo marrom.Notavelmente, o enriquecimento de ácidos graxos totais plasmáticos não segue a mesma tendência que o tecido adiposo marrom, mas em vez disso, o enriquecimento de ácidos graxos é aumentado com termoneutralidade. Estas imagens representam a abundância total e o palmitato sintetizado de novo no tecido adiposo marrom após três dias da administração de D2O. O resultado mostra um aumento na síntese total de palmitato à temperatura ambiente.Tenha cuidado ao executar ácidos graxos no GCMS. Certifique-se de que o palmitato não está sobrecarregado, pois apenas pode dar valores de enriquecimento de isótopos artificialmente altos. Além disso, ao analisar a acetona no GCMS, certifique-se de que não há nenhum pico de acetona de fundo antes de executar as amostras, portanto, execute espaços em branco para remover qualquer acetona no sistema.Este método analisa os ácidos graxos totais em várias classes lipídicas, mas se você quiser entender como a síntese de ácidos graxos está impactando classes lipídicas específicas, você pode primeiro separar essas classes lipídicas usando cromatografia e, em seguida, extrair ácidos graxos dessas frações. Como a lipogênese é um contribuinte chave para o desenvolvimento normal, mas também para muitas doenças, este protocolo pode ser útil em muitos campos.

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