Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников лаборатории Санчес-Гурмачес и Уоллеса за ценные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами Американской кардиологической ассоциации (18CDA34080527 для JSG и 19POST34380545 для RM), NIH (R21OD031907 для JSG), CCHMC Trustee Award, CCHMC Center for Pediatric Genomics Award и CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Эта работа была частично поддержана NIH P30 DK078392 Центра исследований заболеваний пищеварительной системы в Цинциннати. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. RT и MW были поддержаны стипендиальной программой UCD Ad Astra Fellowship.

Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре детской больницы Цинциннати.
1. ПриготовлениеД2О
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отклонений в эксперименте, приготовьте достаточное количеств...

Понимание баланса и взаимодействия между сложными метаболическими путями является необходимым шагом на пути к пониманию биологической основы заболеваний, связанных с обменом веществ. Здесь мы демонстрируем неинвазивную и недорогую методологию определения изменений в синтезе жирны?...

Ожирение и связанные с ним метаболические заболевания представляют собой пандемию, которая угрожает нынешнему и будущим поколениям 1,2. Метаболическая дисрегуляция, связанная с ожирением, обычно упрощается как следствие дисбаланса между потреблением и расходом энергии, затрагивает большое количество метаболических путей, контролируемых факторами окружающей среды и эндогеннымифакторами. Тем не менее, только несколько путей регулярно тестируются на животных моделях метаболической дисрегуляции.
Например, утилизация глюкозы обычно измеряется с помощью тестов на глюкозу и толерантность к инсулину, вероятно, из-за простоты использования портативных глюкометров4. Относительные скорости окисления глюкозы и липидов во всем организме также обычно оцениваются на основе коэффициента дыхательного обмена по данным непрямых калориметрических анализов 5,6. Тем не менее, большинство других аспектов метаболизма обычно не оцениваются функционально. Это приводит к неполной интерпретации метаболического статуса и упущенным терапевтическим возможностям. Одним из основных таких путей является липогенез de novo.
Липогенез de novo (DNL) — это процесс, с помощью которого из предшественников образуются новые жирные кислоты. Глюкоза считается основным прекурсором, способствующим ДНЛ7 всего тела, однако было показано, что другие предшественники, такие как ацетат, фруктоза, лактат и аминокислоты с разветвленной цепью, являются важными источниками углерода в зависимости от пространстве и состояния 8,9,10,11,12. ДНЛ является ключевым фактором, влияющим на метаболический гомеостаз, и имеет важное значение для нормального развития13. Кроме того, изменения в DNL были связаны с раком14,15 и метаболическими 16,17,18 и сердечно-сосудистыми заболеваниями 19,20.
Путь DNL состоит из основных ферментативных компонентов АТФ-цитратлиазы (ACLY), ацетил-КоА-карбоксилазы (ACC1/2) и синтазы жирных кислот (FAS), которые в основном продуцируют пальмитат, 16-углеродную насыщенную жирную кислоту. Тем не менее, жирные кислоты с нечетной и разветвленной цепью также могут производиться с более низкими показателями. Элонгазы и десатуразы дополнительно модифицируют эти жирные кислоты, создавая разнообразный спектр видов жирных кислот, полезных для различных функций (например, долгосрочное хранение энергии и манипулирование текучестью мембраны).
Экспрессия ферментативного аппарата DNL контролируется небольшим числом транскрипционных факторов. Наиболее хорошо описанными на сегодняшний день являются семейство белка, связывающего регуляторные элементы стерола (SREBP), белок, связывающий элемент углеводного ответа (ChREBP) и Х-рецептор печени (LXR)21,22,23,24,25,26. Несмотря на кажущееся совпадение их функций, сообщалось об индивидуальных регуляциях, основанных на доминировании типа клеток и физиологических или патологических состояниях21,22,27,28.
Примечательно, что ряд ингибиторов для отдельных этапов пути ДНЛ были одобрены для клинического использования или находятся на доклинической или клинической стадии разработки для ряда заболеваний, включая ожирение, неалкогольную жировую болезнь печени/неалкогольный стеатогепатит (НАЖБП/НАСГ) и сердечно-сосудистые заболевания29. Эти усилия подчеркивают актуальность DNL для здоровья и болезней.
В последние годы использование методов количественной оценки синтеза жирных кислот de novo возрослов 30 раз. Наиболее распространенным методом оценки этого является использование тяжелой меченой воды (D2O), где тяжелый меченый водород включается в ацильные цепи во время синтеза как прямо, так и косвенно, посредством обмена дейтерия с водородами субстратов DNL NAPDH, ацетил-КоА и малонил-КоА. Несмотря на то, что этот подход набирает популярность, в открытом доступе не хватает подробных протоколов, подходящих для новичков в этой области. В данной работе мы излагаем метод количественной оценки de novo синтеза продуктов ФАС с использованием D2O и газовой хроматографической масс-спектрометрии (GCMS) с расчетами, ранее разработанными Lee et al.31. Этот метод измеряет синтез жирных кислот de novo независимо от источника углерода, и он потенциально полезен практически для любой ткани, в любой модели мыши и при любых внешних возмущениях. Здесь мы сосредоточимся на анализе бурой жировой ткани (BAT) из-за ее высокого уровня DNL и критической роли в поддержании метаболического гомеостаза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

Синтез жирных кислот является сложным и энергозатратным метаболическим путем, играющим важную функциональную роль в контроле метаболического гомеостаза всего организма и других физиологических и патологических процессов. В отличие от других ключевых метаболических путей, таких как утилизация глюкозы, синтез жирных кислот обычно функционально не оценивается, что приводит к неполной интерпретации метаболического статуса. Кроме того, в открытом доступе отсутствуют подробные протоколы, подходящие для новичков в этой области. В данной статье мы опишем недорогой количественный метод, использующий масс-спектрометрию оксида дейтерия и газовую хроматографию (GCMS) для анализа общего синтеза жирных кислот de novo в бурой жировой ткани in vivo. Этот метод измеряет синтез продуктов синтазы жирных кислот независимо от источника углерода, и он потенциально полезен практически для любой ткани, в любой мышиной модели и при любых внешних возмущениях. Приведена подробная информация о подготовке образцов для GCMS и последующих расчетах. Мы фокусируемся на анализе бурого жира из-за его высокого уровня синтеза жирных кислот de novo и критической роли в поддержании метаболического гомеостаза.

Основываясь на дозировкеD2O, описанной на этапе 1, мы обычно обнаруживаем, что вода в организме обогащается в диапазоне от 2,5% до 6%, и что исходный уровень обогащения дейтерия в воде организма быстро достигается через 1 ч и поддерживается в течение всего исследования с помощью пи...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Здесь мы представляем недорогой количественный метод с использованием масс-спектрометрии оксида дейтерия и газовой хроматографии (GCMS) для анализа общего липогенеза жирных кислот de novo в бурой жировой ткани in vivo.

Количественное определение de novo синтеза жирных кислот в бурой жировой ткани с использованием оксида дейтерия

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

В отличие от других метаболических путей, таких как утилизация глюкозы, синтез жирных кислот обычно не оценивается, что приводит к неполной интерпретации метаболического статуса. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он относительно неинвазивный и, вероятно, лучше отражает поток синтеза жирных кислот, чем использование меченной изотопами глюкозы, где изменения в предшествующей обработке глюкозы могут повлиять на результаты. Здесь мы сосредоточимся на бурой жировой ткани, но этот метод потенциально полезен для изучения любой ткани в любой мышиной модели.Для начала поместите образцы на сухой лед. Возьмите предварительно маркированную пробирку для микроцентрифуги, поместите ее на аналитические весы и тарируйте весы. Затем поместите пинцет и скальпель или стальное лезвие бритвы на сухой лед на 10-20 секунд, чтобы он остыл.С помощью пинцета выньте образец замороженной ткани из пробирки и поместите его на пластиковую грузовую лодочка, которую можно расположить на плоском блоке сухого льда или другой предварительно охлажденной поверхности. Используя скальпель или стальное бритвенное лезвие, рассеките небольшую часть ткани, эквивалентную весу от 5 до 15 миллиграммов, и поместите ее в пробирку микроцентрифуги. Запишите точный вес и повторите для каждого образца.Добавьте один микролитр на миллиграмм 10 миллимолярной гексадекановой кислоты D31, а затем три пятимиллиметровых шарика из нержавеющей стали в каждый образец. Затем добавьте в каждый образец с шариками 250 микролитров метанола, 250 микролитров воды и 500 микролитров хлороформа. Поместите пробирки в предварительно охлажденный блок мельницы и перемешайте образцы с частотой колебаний 25 герц в течение пяти минут.Извлеките шарики с помощью магнита и центрифугируйте образцы при 12 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью микропипетки возьмите фиксированный объем нижней фазы каждого образца в пробирки для микроцентрифуг с соответствующей маркировкой. Добавьте 500 микролитров хлороформа к оставшемуся образцу и повторите эти действия.Поместите пробирки с комбинированной нижней фазой под газообразный азот или в устойчивый к хлороформу охлаждаемый центробежный вакуум при температуре четыре градуса Цельсия до полного высыхания. Пипетка 98 миллилитров безводного метанола в стеклянный флакон с носителем. И медленно добавьте два миллилитра безводной серной кислоты в вытяжной шкаф, чтобы получить 2% серной кислоты в метаноле.Перемешайте, взбалтывая закрытую бутылку. Добавьте 500 микролитров этой 2%-ной серной кислоты в растворе метанола к каждому образцу и кратковременно перемешайте. Инкубируют образцы на тепловом блоке при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух часов и добавляют в каждый образец 100 микролитров насыщенного раствора хлорида натрия и 500 микролитров гексана.Энергично взбалтывайте образцы при комнатной температуре в течение одной минуты и оставьте образцы на одну минуту. После этого должны быть очевидны две фазы. Соберите верхнюю фазу в свежую пробирку для микроцентрифуги.Затем повторите добавление гексана. А после разделения фаз соберите пробы второй верхней фазы в те же маркированные пробирки. Высушите образцы при комнатной температуре под газообразным азотом и повторно суспендируйте образцы в 20 микролитрах гексана на миллиграмм исходного веса ткани.Немедленно переложите образцы в стеклянный флакон для газовой хроматографии со стеклянной вставкой. Введите образцы в один масс-спектрометр четырехкратной газовой хроматографии для определения содержания метиловых эфиров жирных кислот или изотопологов FAME. Введите один микролитр образца в разъемное или неразъемное входное отверстие при температуре на входе 270 градусов Цельсия, используя гелий в качестве газа-носителя.В пробирках для микроцентрифуг с маркировкой с безопасным замком смешайте 10 микролитров каждого образца плазмы или стандартные четыре микролитра 10-молярного гидроксида натрия и четыре микролитра 5%-ного ацетона в ацетонитриле. Выполните это в трех экземплярах для каждого образца. После инкубации образцов в течение ночи при комнатной температуре добавьте от 450 до 550 миллиграммов сульфата натрия в каждый образец, добавьте 600 микролитров хлороформа в каждую пробирку в вытяжном шкафу и энергично встряхивайте в течение 15 секунд.Центрифугируют образцы при 300 G в течение двух минут. Берут маркированные стеклянные флаконы GCMS со стеклянными вставками и переносят трипликат, а затем 80 микролитров аликвот надосадочной жидкости из каждого образца во флаконы. Плотно укупорьте флаконы для анализа GCMS.Процент обогащения D2O в плазме мышей за несколько временных точек показан здесь. Было обнаружено, что вода в организме обогащается в диапазоне от 2,5 до 6%, что исходный уровень обогащения дейтерием в воде организма быстро достигается в течение одного часа и поддерживается в течение всего исследования. Показано массовое изотопологическое распределение пальмитата в бурой жировой ткани после трех дней введения D2O при комнатной температуре и термонейтральности.Этот результат показывает более высокое обогащение дейтерием М1 и М2 при комнатной температуре. Обогащение моляров бурой жировой ткани и обогащение моляров плазмы ряда жирных кислот после трех дней введения D2O при комнатной температуре и термонейтральности представлены на этом рисунке. Более низкое температурное обогащение было обнаружено в широком спектре жирных кислот в бурой жировой ткани.Примечательно, что общее обогащение жирными кислотами в плазме не следует той же тенденции, что и бурая жировая ткань, а вместо этого обогащение жирных кислот увеличивается с помощью термонейтральности. Эти изображения представляют общее количество и de novo синтезированный пальмитат в бурой жировой ткани после трех дней введения D2O. Результат показывает увеличение общего синтеза пальмитата при комнатной температуре.Будьте осторожны при запуске жирных кислот на GCMS. Убедитесь, что пальмитат не перегружен, так как это может дать искусственно завышенные значения обогащения изотопов. Кроме того, при анализе ацетона на GCMS перед запуском образцов убедитесь, что нет фонового пика ацетона, поэтому запускайте пустые места, чтобы удалить ацетон из системы.Этот метод рассматривает общее количество жирных кислот в нескольких классах липидов, но если вы хотите понять, как синтез жирных кислот влияет на определенные классы липидов, вы можете сначала разделить эти классы липидов с помощью хроматографии, а затем извлечь жирные кислоты из этих фракций. Поскольку липогенез является ключевым фактором нормального развития, а также многих заболеваний, этот протокол может быть полезен во многих областях.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Белки МУДРОСТЬ Workbench для<em&gt; В кремнии</em&gt;<em&gt; De Novo</em&gt; Дизайн биомолекул

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Определение жирных кислот и окисления Липогенез в первичных гепатоцитов мышей

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Методы определения ставок глюкозы и жирных кислот Окисление в изолированной рабочей сердца крысы

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Поколение соматических стволовых клеток, YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Синтеза наночастиц 68Ga Core легированных оксида железа для двойной позитронно-эмиссионная томография / (Т1) магнитно-резонансной визуализации

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Оценка показателей синтеза белка de novo в Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Изучение структуры жировой ткани путем очистки метилсалицилата и 3D-изображения

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

Количественная оценка жировой инфильтрации скелетных мышц на основе децеллюляризации

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...