Name: quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Vi tackar Sanchez-Gurmaches och Wallaces labbmedlemmar för värdefulla diskussioner. Detta arbete stöddes av anslag från American Heart Association (18CDA34080527 till JSG och 19POST34380545 till RM), NIH (R21OD031907 till JSG), en CCHMC Trustee Award, en CCHMC Center for Pediatric Genomics Award och en CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Detta arbete stöddes delvis av NIH P30 DK078392 vid Digestive Diseases Research Core Center i Cincinnati. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter. RT och MW stöddes av ett UCD Ad Astra Fellowship.

Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Beredning av D2O
OBS: För att undvika experimentell variation, förbered tillräckligt med lösning/dricksvatten för alla möss under hela experimentet.
<ol><li>För intraperitoneal injektion: generera 0,9 % w/v koksaltlösning D 2 O genom att lösa upp 9 g NaCl per liter D 2 O. Filtrera genom etti...

Att förstå balansen och interaktionen mellan komplexa metaboliska vägar är ett oumbärligt steg mot att förstå den biologiska grunden för metabolt relaterade sjukdomar. Här visar vi en icke-invasiv och billig metod för att bestämma förändringar i de novo-fettsyrasyntesen. Denna metod är anpassad från tidigare publicerade metoder som utvecklade beräkningar för att uppskatta de novo-syntesflödet från fettsyradeuteriumanrikning31 och för att använda deuterium-ace...

Fetma och relaterade metabola sjukdomar är en pandemi som utgör en fara för nuvarande och kommande generationer 1,2. Den metabola dysreglering som är förknippad med fetma, som vanligtvis förenklas som en följd av obalansen mellan energiintag och energiförbrukning, påverkar ett stort antal metaboliska vägar som styrs av miljömässiga och endogena faktorer3. Endast ett fåtal vägar testas dock rutinmässigt i djurmodeller av metabol dysreglering.
Som ett exempel mäts glukosbortskaffande rutinmässigt med glukos- och insulintoleranstester, förmodligen på grund av enkelheten att använda bärbara glukosmätare4. Relativa hastigheter för glukos och lipidoxidation i hela kroppen uppskattas också rutinmässigt baserat på andningsutbytesförhållandet från indirekta kalorimetrianalyser 5,6. Majoriteten av alla andra aspekter av metabolismen bedöms dock inte rutinmässigt funktionellt. Detta leder till ofullständiga tolkningar av den metabola statusen och missade behandlingsalternativ. En av de viktigaste sådana vägarna är de novo lipogenes.
De novo lipogenes (DNL) är den process genom vilken nya fettsyror genereras från prekursorer. Glukos anses vara den viktigaste prekursorn som bidrar till helkropps-DNL7, men andra prekursorer, såsom acetat, fruktos, laktat och grenade aminosyror, har visat sig vara relevanta kolkällor på ett rumsligt och tillståndsberoende sätt 8,9,10,11,12. DNL är en viktig bidragsgivare till metabolisk homeostas och är avgörande för normal utveckling13. Dessutom har förändringar i DNL associerats med cancer 14,15 och metabola 16,17,18 och kardiovaskulära sjukdomar 19,20.
DNL-vägen består av de enzymatiska kärnkomponenterna ATP-citratlyas (ACLY), acetyl-CoA-karboxylas (ACC1/2) och fettsyrasyntas (FAS) som främst producerar palmitat, en mättad fettsyra med 16 kolatomer. Men udda och grenade fettsyror kan också produceras i lägre doser9. Elongaser och desaturas modifierar dessa fettsyror ytterligare, vilket skapar ett brett utbud av fettsyraarter som är användbara för en mängd olika funktioner (t.ex. långsiktig energilagring och manipulering av membranfluiditet).
Uttrycket av det enzymatiska DNL-maskineriet styrs av ett kort antal transkriptionsfaktorer. De mest välbeskrivna hittills inkluderar SREBP-familjen (Sterol Regulatory Element Binding Protein), Carb Response Element Binding Protein (ChREBP) och lever X-receptor (LXR)21,22,23,24,25,26. Trots en uppenbar överlappning i deras funktioner har individuella regleringar baserade på celltypsdominans och fysiologiska eller patologiska tillstånd rapporterats21,22,27,28.
Anmärkningsvärt är att ett antal inhibitorer för utvalda steg i DNL-signalvägen har godkänts för klinisk användning eller befinner sig i prekliniska eller kliniska utvecklingsstadier för ett antal sjukdomar, inklusive fetma, icke-alkoholisk fettleversjukdom/icke-alkoholisk steatohepatit (NAFLD/NASH) och kardiovaskulär sjukdom29. Dessa insatser belyser relevansen av DNL för hälsa och sjukdom.
Under de senaste åren har användningen av metoder för att kvantitativt bedöma de novo-fettsyrasyntesen ökat30. Den vanligaste metoden för att bedöma detta är användning av tungmärkt vatten (D2O), där det tungt märkta vätet inkorporeras i acylkedjor under syntesen både direkt och indirekt, via deuteriumutbyte med vätena i DNL-substraten NAPDH, acetyl-CoA och malonyl-CoA. Även om detta tillvägagångssätt blir allt populärare, finns det en brist på offentligt tillgängliga detaljerade protokoll som är lämpliga för nykomlingar inom området. Här skisserar vi en metod för kvantitativ bedömning av de novo-syntesen av FAS-produkter med hjälp av D2O och gaskromatografi masspektrometri (GCMS), med beräkningar som tidigare utvecklats av Lee et al.31. Denna metod mäter de novo-fettsyrasyntesen oberoende av en kolkälla, och den är potentiellt användbar för praktiskt taget vilken vävnad som helst, i vilken musmodell som helst och under alla yttre störningar. Här fokuserar vi på analysen av brun fettvävnad (BAT) på grund av dess höga nivåer av DNL och kritiska roller för att upprätthålla metabolisk homeostas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

Fettsyrasyntes är en komplex och mycket energikrävande metabolisk väg med viktiga funktionella roller i kontrollen av hela kroppens metaboliska homeostas och andra fysiologiska och patologiska processer. I motsats till andra viktiga metaboliska vägar, såsom glukosbortskaffande, utvärderas inte fettsyrasyntesen rutinmässigt funktionellt, vilket leder till ofullständiga tolkningar av metabolisk status. Dessutom saknas det allmänt tillgängliga detaljerade protokoll som är lämpliga för nykomlingar på området. Här beskriver vi en billig kvantitativ metod som använder deuteriumoxid och gaskromatografi masspektrometri (GCMS) för analys av total fettsyra de novo-syntes i brun fettvävnad in vivo. Denna metod mäter syntesen av produkterna av fettsyrasyntas oberoende av en kolkälla, och den är potentiellt användbar för praktiskt taget vilken vävnad som helst, i vilken musmodell som helst och under alla yttre störningar. Information om provberedningen för GCMS och nedströmsberäkningar tillhandahålls. Vi fokuserar på analys av brunt fett på grund av dess höga nivåer av de novo-fettsyrasyntes och kritiska roller för att upprätthålla metabolisk homeostas.

Baserat på doseringen av D 2 O som beskrivs i steg 1 finner vi vanligtvis att kroppsvatten anrikas i intervallet2,5% till 6 % och att en baslinjenivå av deuteriumanrikning i kroppsvatten snabbt uppnås på 1 timme och bibehålls under hela studien via 8 % berikat dricksvatten (figur 1). Kontinuerlig vattenanrikning i stabilt tillstånd är ett antagande av beräkningarna som används i steg 6, och därför rekommenderar vi experimentell validering av kinetiken för vatt...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Här presenterar vi en billig kvantitativ metod som använder deuteriumoxid och gaskromatografi masspektrometri (GCMS) för analys av total fettsyra de novo lipogenes i brun fettvävnad in vivo.

Kvantitativ bestämning av de novo-fettsyrasyntes i brun fettvävnad med hjälp av deuteriumoxid

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

I motsats till andra metaboliska vägar som glukosbortskaffande utvärderas inte fettsyrasyntesen rutinmässigt, vilket leder till ofullständiga tolkningar av den metaboliska statusen. De viktigaste fördelarna med denna metod är att den är relativt icke-invasiv, och det är sannolikt en bättre återspegling av fettsyrasyntesflödet än att använda isotopmärkt glukos där förändringar i uppströms glukoshantering kan påverka resultaten. Här fokuserar vi på brun fettvävnad, men denna metod är potentiellt användbar för att studera vilken vävnad som helst i vilken musmodell som helst.Börja med att placera proverna på torris. Ta ett förmärkt mikrocentrifugrör, placera det på en analysvåg och tarera vågen. Placera sedan en pincett och en skalpell eller rakblad av stål på torris i 10 till 20 sekunder för att svalna.Använd pincetten för att ta ut det frysta vävnadsprovet ur röret och placera det på en viktbåt av plast, som kan placeras på ett platt block av torris eller annan förkyld yta. Använd skalpellen eller rakbladet av stål, dissekera en liten del av vävnaden motsvarande 5 till 15 milligram i vikt och placera den i mikrocentrifugröret. Anteckna den exakta vikten och upprepa för varje prov.Tillsätt en mikroliter per milligram 10 millimolar hexadekansyra D31, följt av tre fem millimeter pärlor av rostfritt stål till varje prov. Tillsätt sedan 250 mikroliter metanol, 250 mikroliter vatten och 500 mikroliter kloroform till varje prov med pärlor. Placera rören i ett förkylt block i en kvarn och blanda proverna med en vibrationsfrekvens på 25 hertz i fem minuter.Ta bort pärlorna med hjälp av en magnet och centrifugera proverna vid 12 000 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Använd en mikropipett och ta en fast volym av bottenfasen av varje sample i motsvarande märkta mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 mikroliter kloroform till det återstående provet och upprepa dessa steg.Placera rören med den kombinerade nedre fasen under kvävgas eller i ett kloroformbeständigt kylt centrifugalvakuum vid fyra grader Celsius tills de är helt torra. Pipettera 98 milliliter vattenfri metanol i en glasmediaflaska. Och tillsätt långsamt två milliliter vattenfri svavelsyra i dragskåpet för att göra 2% svavelsyra i metanol.Blanda genom att snurra den stängda flaskan. Tillsätt 500 mikroliter av denna 2% svavelsyra i metanollösning till varje prov och virvla kort. Inkubera proverna på värmeblocket vid 50 grader Celsius i två timmar och tillsätt 100 mikroliter mättad natriumkloridlösning och 500 mikroliter hexan till varje prov.Virvla proverna kraftigt i rumstemperatur i en minut och låt proverna sitta i en minut. De två faserna bör vara uppenbara efter detta. Samla upp den övre fasen i ett nytt mikrocentrifugrör.Upprepa sedan tillsatsen av hexan. Och efter fasseparation, samla in de andra övre fasproverna i samma märkta rör. Torka proverna vid rumstemperatur under kvävgas och återsuspendera proverna i 20 mikroliter hexan per milligram ursprunglig vävnadsvikt.Överför omedelbart proverna till en glasgaskromatografiflaska med en glasinsats. Injicera proverna i en enda fyrdubbel gaskromatografimasspektrometer för att bestämma förekomsten av fettsyrametylestrar eller FAME-isotopologer. Injicera en mikroliter av provet i ett delat eller splitlöst inlopp vid en inloppstemperatur på 270 grader Celsius med helium som bärgas.I märkta safe-lock mikrocentrifugrör, kombinera 10 mikroliter av varje plasmasample eller standard fyra mikroliter 10 molar natriumhydroxid och fyra mikroliter 5% aceton i acetonitril. Utför detta i tre exemplar för varje prov. Efter inkubation av proverna över natten i rumstemperatur, tillsätt 450 till 550 milligram natriumsulfat till varje prov, tillsätt 600 mikroliter kloroform till varje rör i dragskåpet och virvla kraftigt i 15 sekunder.Centrifugera proverna vid 300 G i två minuter. Ta märkta GCMS-flaskor av glas med glasinsatser och överför de tre alilikorna och sedan 80 mikroliter av supernatanten från varje prov till injektionsflaskorna. Täck injektionsflaskorna ordentligt för GCMS-analysen.Procentandelen D2O-anrikning i plasma hos möss över flera tidpunkter visas här. Det visade sig att kroppsvatten anrikas i intervallet 2,5 till 6 % att en baslinjenivå av deuteriumberikning i kroppsvatten snabbt uppnås på en timme och bibehålls under hela studien. Massisotopologfördelningen av palmitat i brun fettvävnad efter tre dagars D2O-administrering vid rumstemperatur och termoneutralitet visas här.Detta resultat visar en högre M1 och M2 deuteriumanrikning vid rumstemperatur. Molärt berikande av brun fettvävnad och molär anrikning av en rad fettsyror i plasma efter tre dagars administrering av D2O vid rumstemperatur och termoneutralitet visas i denna figur. Den kallare temperaturberikningen hittades i ett brett spektrum av fettsyror i brun fettvävnad.Noterbart är att den totala fettsyraanrikningen i plasma inte följer samma trend som brun fettvävnad, utan istället ökas fettsyraanrikningen med termoneutralitet. Dessa bilder representerar den totala förekomsten och det de novo-syntetiserade palmitatet i brun fettvävnad efter tre dagars D2O-administrering. Resultatet visar en ökning av den totala palmitatsyntesen vid rumstemperatur.Var försiktig när du kör fettsyror på GCMS. Se till att palmitat inte överbelastas eftersom det bara kan ge artificiellt höga isotopanrikningsvärden. Dessutom, när du analyserar aceton på GCMS, se till att det inte finns någon bakgrundsacetontopp innan du kör proverna, så kör ämnen för att ta bort eventuell aceton i systemet.Denna metod tittar på totala fettsyror över flera lipidklasser, men om du vill förstå hur fettsyrasyntesen påverkar specifika lipidklasser kan du först separera dessa lipidklasser med kromatografi och sedan extrahera fettsyror från dessa fraktioner. Eftersom lipogenes är en viktig bidragsgivare till normal utveckling, men också till många sjukdomar, kan detta protokoll vara användbart inom många områden.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein visdom: En Workbench för<em&gt; I silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design av biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Fastställande av fettsyraoxidation och lipogenesen i mus primära hepatocyter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Metoder för bestämning av priser av glukos och fettsyra oxidation i isolerade Working Rat hjärta

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation av somatiska stamceller av YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Syntesen av 68Ga Core-dopade järnoxid nanopartiklar för dubbla positronemissionstomografi / (T1) Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Bedömning av de novo Proteinsyntesen Priser i Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Exploring Adipose Tissue Structure genom Metylsalicylate Clearing och 3D-avbildning

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering och identifiering av mesenkymala stamceller härrörande från fettvävnad från Sprague Dawley-råttor

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

Decellulariseringsbaserad kvantifiering av skelettmuskelfettinfiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...