Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلية (أ) "فك التشفير الدبقي" (JP21H05621 إلى SM) ، JSPS KAKENHI (JP19K06883 إلى SM ، 15KK0340 إلى ES ، JP22H00432 ، JP22H05160 ، JP17H06312 إلى HB ، و JP17H06313 إلى KK) ، منحة في المعونة لرسم خرائط الدماغ بواسطة التقنيات العصبية المتكاملة لدراسات الأمراض (الدماغ / العقول) (JP19dm0207079h0002 إلى SM ، JP19dm0207079 إلى HB ، و JP19dm0207080 إلى KK) ، مؤسسة ناريشيج لأبحاث علم الأعصاب (إلى SM) ، منحة للباحثين الشباب من محافظة ياماناشي (إلى SM) ، ومؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى SM) وبدعم جزئي من منحة أبحاث الدماغ الحدودية من جامعة ياماناشي.
نشكر N. Yaguchi و K. Okazaki على رعاية الحيوانات والمساعدة الفنية وأعضاء مختبر Kitamura على المناقشات المفيدة.

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة التجارب على الحيوانات بجامعة ياماناشي. تم استخدام النوع البري (C57BL / 6J ، اليابان SLC) والفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن GECI المثبت بالغشاء (Lck-GCaMP6f) في الخلايا النجمية في هذه الدراسة. تم الحصول على الفئران المعدلة وراثيا عن طريق تهجين الفئران AldH1l1-CreERT2 [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J، تم الحصول عليها تجاريا، انظر جدول المواد] وفئران Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-GCaMP6f)Khak>/J، تم الحصول عليها تجاريا] الفئران. عولجت الفئران المحورة وراثيا بعقار تاموكسيفين (20 ملغم/مل) لمدة 5 أيام (0.05 مل/10 غ من وزن الجسم) للتعبير عن GCaMP6f. كانت جميع الفئران المستخدمة من الذكور والإناث بعمر 4 أسابيع على الأقل. يظهر مخطط النافذة في الشكل 1 أ ، ويتم تلخيص الإجراء الجراحي في الشكل 1 ب.
1. التحضير لجراحة نافذة الجمجمة
<ol><li>تخدير الفئران باستخدام إيزوفلوران (التحريض: 3٪ ، الجراحة: 1٪ -1.5٪ ، معدل التدفق: 0.2-0.3 لتر / دقيقة). تأكد من عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس قرصة الذيل أو إصبع القدم. الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة (36-38 درجة مئوية). ضع مرهم العين بقطعة قطن لمنع عيون الفئران من الجفاف تحت التخدير.</li>
	<li>حقن 15٪ محلول مانيتول (انظر جدول المواد) داخل الصفاق (3 مل / 100 غرام من وزن الجسم). ثبت رأس الماوس على إطار مجسم مع قضبان الأذن. قم بإزالة الشعر من رأس الماوس باستخدام ماكينة حلاقة وكريم إزالة الشعر.</li>
	<li>تطهير سطح الجلد مع البوفيدون اليود والكحول ثلاث مرات. تطبيق يدوكائين موضعيا لتوفير تسكين وقائي. إزالة الجلد فوق المنطقة محل الاهتمام بمقص جراحي وفضح الجمجمة (الحجم: 15 × 15 مم). في حالة وجود نزيف ، استخدم قطعة قطن لوقف النزيف. ملاحظة: في هذه الدراسة ، تمت إزالة الجلد لمراقبة قشرة الفص الجبهي إلى القشرة البصرية.</li>
	<li>قم بإزالة السمحاق فوق الجمجمة المكشوفة باستخدام مكشطة دقيقة وجفف سطح الجمجمة لربط لوحة الرأس بالجمجمة بإحكام بأسمنت الأسنان (انظر جدول المواد) (الشكل 2 ب). ملاحظة: يتم إنشاء لوحة الرأس حسب الطلب باستخدام طابعة 3D. يتم إيداع ملف التصميم في مستودع Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).</li>
	<li>قم بتوصيل لوحة الرأس باستخدام الأسمنت السني (الشكل 2C). انتظر 20 دقيقة على الأقل حتى يتصلب الأسمنت. قم بتأمين لوحة الرأس بحامل لوحة الرأس35.</li>
</ol>2. جعل نافذة الجمجمة
<ol><li>قم بإزالة الأسمنت الزائد فوق الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان (انظر جدول المواد). احرص على عدم الحفر من خلال العظام وتلف الدماغ عن طريق الحفر.</li>
	<li>ضع علامة على المنطقة المراد قطعها بقلم وتقطيعها إلى العظم بمشرط. اجعل طرف المشرط غير مخترق الجمجمة (الشكل التكميلي 1). قم بالرجوع إلى أطلس الدماغ لتحديد مكان عمل النافذة. ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم إنشاء نافذة بين -2 مم و +4 مم من bregma في المحور الأمامي الخلفي ومن الخيط السهمي إلى +3 مم في المحور المتوسط الجانبي ، بما في ذلك القشرة الحركية والحسية الجسدية والبصرية.</li>
	<li>كشط العظم بشكل متكرر باستخدام مشرط لتعميق الأخدود حتى يتحرك العظم في المنطقة المراد قصها جيدا عند لمسه برفق.</li>
	<li>قم بإزالة العظم المقطوع بملاقط دقيقة. لا تدفع رفرف العظم إلى الدماغ ، مما قد يؤدي إلى تلف الدماغ (الشكل 1 بأ). ملاحظة: إذا لوحظ نزيف بعد إزالة العظم ، فقم بتطبيق وشفط السائل النخاعي الاصطناعي على الفور (ACSF ، انظر جدول المواد) وكرر هذه العملية حتى يتوقف النزيف. بدلا من ذلك ، ضع إسفنجة جيلاتينية مرقئ (حوالي 3 مم مكعبات مربعة) منقوعة في ACSF على نقطة النزيف.</li>
	<li>إذا لم تتم إزالة الجافية ، فانتقل إلى الخطوة 2.7.</li>
	<li>قم بإزالة الأم الجافية باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>قم بإزالة dura، على سبيل المثال، في الحالات التالية؛ النقل باستخدام طريقة فيلم fibroin-AAV36 ومراقبة الهياكل الصغيرة مثل العمود الفقري التغصني.</li>
		<li>قطع الجافية باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة مع طرف مدبب من حوالي 10 ميكرومتر. لتوسيع هذا القطع على النافذة بأكملها ، استخدم إبرة على شكل حرف U.</li>
		<li>اضبط تكبير المجهر المجسم على 60-100x وقم بإزالة الأم الجافية المقطوعة بملاقط متناهية الصغر. إذا كانت إزالة الأم الجافية تسبب النزيف ، اشطفها باستخدام ACSF أو استخدم إسفنجة جيلاتينية لوقف النزيف.</li>
	</ol></li>
	<li>قطع التفاف PVDC.<ol><li>تعقيم قطعة كبيرة (على سبيل المثال ، 10 × 15 مم) من غلاف PVDC (حوالي 11 ميكرومتر ، انظر جدول المواد ، الشكل 2 أ أ) عن طريق التعقيم والإيثانول بنسبة 70٪.</li>
		<li>تحت المجهر المجسم ، استخدم ملاقط ومشرط لقطع غلاف بالحجم المطلوب. ملاحظة: يجب أن يكون حجم الغلاف أكبر بحوالي 10 مم من حجم نافذة الجمجمة ولكن أصغر من فتحة لوحة الرأس. للحصول على نافذة جمجمة 6 × 3 مم 2 ، قم بإعداد غلاف 15 × 10 مم2.</li>
	</ol></li>
	<li>ضع الغلاف بدقة باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>ضع الغلاف على سطح الدماغ ، تاركا ACSF على السطح. قم بامتصاص ACSF من حافة الغلاف ، مما يسمح للغلاف بالالتصاق بقوة بسطح الدماغ (الشكل 1Bب ، ج). ملاحظة: الغلاف المستخدم مقاوم للتجاعيد ، لذا فإن مجرد وضعه على سطح الدماغ لا ينتج عنه أي تجاعيد تقريبا.</li>
		<li>قم بقص الغلاف بمشرط وملاقط بحيث يكون هناك هامش 1 مم تقريبا بين حافة نافذة الجمجمة والتفاف (الشكل 1Bد).</li>
		<li>بمجرد وضع الغلاف في مكانه ، قم بلصق حافة الغلاف على الجمجمة بمادة لاصقة بيولوجية (انظر جدول المواد ، الشكل 2 د). اترك المادة اللاصقة تجف لمدة 30 دقيقة.</li>
	</ol></li>
	<li>ضع المطاط الصناعي السيليكوني الشفاف.<ol><li>ضع المطاط الصناعي السيليكوني الشفاف المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) أعلى الغلاف باستخدام موزع بطرف خلط (الشكل 1B e ، 2Ab-d) وضع زجاج الغطاء (سمك 0.12-0.17 مم) في الأعلى (الشكل 2E).</li>
		<li>أغلق محيط زجاج الغطاء بغشاء مقاوم للماء أو غراء فائق أو أسمنت أسنان (الشكل 1 بو).</li>
	</ol></li>
	<li>بعد الجراحة ، راقب الفأر حتى يستعيد وعيه للحفاظ على رقد القص. بعد ذلك ، احتفظ بالفئران بشكل فردي ، واسمح لها بالتعافي في قفصها المنزلي لمدة 7 أيام على الأقل.<ol><li>لتقليل التوتر والألم، يتم تطبيق العوامل المضادة للالتهابات والمسكنات (على سبيل المثال، ديكساميثازون وكيتوبروفين، 5 ملغ/كغ لكل منهما).</li>
	</ol></li>
	<li>مراقبة الفئران بانتظام للعدوى. إذا تم تأكيد العدوى، يجب إعطاء دواء مضاد للميكروبات (على سبيل المثال، 10٪ إنروفلوكساسين، 1.7 ميكرولتر/مل) في مياه الشرب حتى يتم القضاء على العدوى (عادة أقل من 4 أسابيع).</li>
</ol>3. صنع فيلم AAV على غلاف بلاستيكي باستخدام محلول فيبروين
ملاحظة: الخطوة 3 اختيارية.
<ol><li>تحضير محلول فيبروين من شرانق دودة القز باتباع طريقة منشورة مسبقا37.<ol><li>باختصار ، قم بغلي شرانق دودة القز العادية المتاحة تجاريا (5 جم ، انظر جدول المواد) في محلول كربونات الصوديوم (0.02 م ، 2 لتر). اغسل الشرانق في ماء عالي النقاء وجففها طوال الليل.</li>
		<li>قم بإذابة الشرانق المجففة في محلول بروميد الليثيوم (9.3 م ، 20٪ وزن / وزن فيبروين) أثناء تسخينها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قم بغسيل محلول الشرنقة المذاب ، جهاز الطرد المركزي (مرتين عند 12700 × جم ، عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة)37 ، واجمع المادة الطافية.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بإعداد فيلم fibroin-AAV باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>امزج محاليل الفبروين و AAV20 بنسبة 1: 4 في أنبوب عينة صغير باستخدام ماصة دقيقة. قم بإسقاط حصة من محلول fibroin-AAV المختلط على الغلاف البلاستيكي لنافذة الجمجمة ، وجففه لمدة 3 ساعات على الأقل. ملاحظة: للتعبير في منطقة قطرها 3 مم ، ضع قطرة 5 ميكرولتر من محلول fibroin-AAV. تحدد هذه النسبة مقدار الحل لمنطقة معينة.</li>
		<li>بعد التجفيف ، قم بقص الغلاف البلاستيكي بالحجم المطلوب للنافذة (على سبيل المثال ، 10 × 15 مم) وضعه على سطح الدماغ. ثم اتبع الطريقة المذكورة أعلاه من الخطوة 2.8.1 فصاعدا. ملاحظة: قبل وضع الغلاف على سطح الدماغ ، قم بإزالة ACSF على سطح الدماغ قدر الإمكان. وذلك لأنه من المتوقع أن يقوم ACSF بإذابة فيلم fibroin-AAV وتقليل تركيز جزيئات AAV.</li>
		<li>انتظر حوالي 2-4 أسابيع بعد إنشاء النافذة المعالجة ب AAV حتى يتم التعبير عن GECIs بشكل كاف. خلال هذه العملية ، تحقق من حالة الفئران والنوافذ بانتظام.</li>
	</ol></li>
</ol>4. تصوير وتحليل الكالسيوم
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول التصوير والتحليل ، يرجى الاطلاع على التقارير المنشورة مسبقا1،2،38.
<ol><li>قم بإجراء تصوير واسع المجال باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>شل حركة الماوس باستخدام جهاز تثبيت الرأس تحت مجهر مضان العدسة الترادفية (انظر جدول المواد).</li>
		<li>قم بإضاءة القشرة الدماغية للفئران بضوء الإثارة من مصدر ضوء LED 465 نانومتر من خلال مرشح الإثارة ومرآة ثنائية اللون وعدسة موضوعية.</li>
		<li>اجمع صور مضان القشرة الدماغية بواسطة كاميرا CCD من خلال عدسة موضوعية (1.0x) ومرآة ثنائية اللون ومرشح انبعاث وعدسة تصوير (2.0x). مزيج من هذه العدسات يعطي تكبير إجمالي يبلغ حوالي 0.5x.</li>
		<li>الحصول على صور بتردد أخذ عينات يبلغ 50 هرتز. بعد الحصول على البيانات ، قم بتحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ. حدد منطقة الاهتمام (ROI) يدويا. احسب التغير الفلوري في كل عائد استثمار ك ΔF / F = (Ft - F0) / F0 ، حيث Ft هي قيمة التألق الخام لكل إطار و F0 هي متوسط قيمة التألق التي تم الحصول عليها من صورة متوسطة لجميع الإطارات. ملاحظة: يتم إيداع برنامج ماكرو ل ImageJ إلى GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro) ، الذي يحسب صور ΔF / F من بيانات تصوير الكالسيوم.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بإجراء تصوير ثنائي الفوتون باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>شل حركة الماوس تحت مجهر ثنائي الفوتون باستخدام جهاز تثبيت الرأس. حدد المنطقة المراد تصويرها باستخدام المجهر في وضع المجال الساطع باستخدام عدسة موضوعية منخفضة التكبير (5x).</li>
		<li>قم بالتبديل إلى التصوير ثنائي الفوتون. استخدم عدسة موضوعية عالية التكبير (16x أو 25x) وقم بإضاءة الليزر لإثارة فوتونين. ملاحظة: تم إثارة Lck-GCaMP6f22 الأخضر والأحمر XCaMP-R36 بواسطة ليزر فائق السرعة بأطوال موجية إثارة تبلغ 920 نانومتر و 1070 نانومتر على التوالي.</li>
		<li>الحصول على صور مضان عند 30 هرتز. بعد الحصول على البيانات ، قم بتصحيح القطع الأثرية للحركة من خلال وظيفة التسجيل لبرنامج suite2p39. احصل على عائد استثمار و ΔF / F من الصور باستخدام نفس الطريقة للتصوير واسع المجال.</li>
	</ol></li>
	<li>ارسم البيانات باستخدام python باستخدام المكتبات التالية: NumPy و Matplotlib و Pandas (انظر جدول المواد).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تقدم هذه المقالة طريقة غير مكلفة لإنشاء نافذة جمجمة كبيرة باستخدام غلاف بلاستيكي PVDC وسيليكون شفاف وغطاء زجاجي. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا أنه يمكن إجراء تصوير الكالسيوم واسع المجال على مساحة واسعة من القشرة الدماغية. يمكن إجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون من عدة مناطق قشرية مختلفة في نفس الفأر الذي خضع لتصوير واسع المجال. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن فيلم fibroin-AAV على الغلاف البلاستيكي المستخدم للنافذة يمكن أن يعبر عن GECI على مساحة واسعة من القشرة.
خطوات حاسمة من المهم تجنب العدوى وتلف الدماغ عند صنع نوافذ الجمجمة باستخدام غلاف بلاستيكي. في هذه الظروف ، لا يمكن ملاحظة النشاط العصبي والدبقي ، وتصوير المناطق العميقة أمر مستحيل. تؤدي إصابة الأوعية الدموية أيضا إلى النزيف ، مما يجعل التصوير مستحيلا بسبب الدم. لتجنب العدوى ، فإن جعل سطح الدماغ والالتفاف متصلا بإحكام قدر الإمكان أمر بالغ الأهمية عن طريق امتصاص ACSF. إدارة مانيتول مهمة لتجنب تلف الدماغ والأوعية الدموية عن طريق منع زيادة ضغط الدماغ أثناء الجراحة. هذا يحافظ على المسافة بين سطح الدماغ والأم الجافية ويمنع لمس الدماغ والأوعية الدموية أثناء إزالة الجمجمة والأم الجافية. مجهر ستيريو ذو تكبير عالي وملاقط ذات أطراف حادة فعالة أيضا لإجراء جراحة دقيقة.
في طريقة fibroin-AAV ، من الضروري استخدام شرانق دودة القز اللحمية ، وليس تجميد محلول الفبروين ، وتجفيف محلول fibroin-AAV بشكل كاف ، وتطبيق حجم كاف من المحلول (5 ميكرولتر لكل قطر 3 مم). عندما تم استخدام الشرانق القديمة ، كانت كفاءة التعبير أقل. وذلك لأن الفبروين من الشرانق القديمة قد يتم تغيير طبيعته بسهولة. عندما تم تجميد محلول الفبروين عند -80 درجة مئوية وإذابته في وقت الاستخدام ، كانت كفاءة التعبير ضعيفة. قد يكون هذا بسبب تمسخ البروتين بسبب التجميد والذوبان. نظرا لأنه يمكن استخدام محاليل الفبروين المخزنة عند 4 درجات مئوية بشكل فعال حتى الهلام ، فمن المستحسن أن يتم تبريد محاليل الفبروين وتنقيتها من الشرانق مرة أخرى بعد التبلور. يجب تجفيف محلول fibroin-AAV لمدة 3 ساعات على الأقل ، لأن التعبير ضعيف بعد أقل من 3 ساعات. أخيرا ، تعتمد منطقة التعبير على كمية محلول fibroin-AAV المستخدم. في المثال في الشكل 3M ، كانت الكمية صغيرة (5 ميكرولتر) ؛ وهكذا ، غطى فيلم fibroin-AAV النصف العلوي فقط من النافذة ، مما أدى إلى تعبير غير موحد فوق النافذة. إذا تم استخدام كمية كافية من fibroin-AAV ، فسيكون التعبير موحدا على النافذة بأكملها.
تعديلات على التقنية تسمح تقنية نافذة الجمجمة الجديدة للمرء بفحص النشاط العياني للدوائر القشرية ونشاطها الأساسي على مستوى الخلية الواحدة في نفس الفأر. وبالتالي ، يمكن تطبيق الطريقة على مجموعة متنوعة من دراسات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لمراقبة النشاط القشري أثناء مهام صنع القرار ، والتعلم الحركي ، وفي نماذج الفئران لإصابات الدماغ والمرض. نعتقد أيضا أنه يمكن تطبيق الطريقة ليس فقط على القوارض ولكن أيضا على الرئيسيات غير البشرية.
توضح هذه الورقة أن نافذة الجمجمة الكبيرة فعالة لتصوير الفئران المعدلة وراثيا والفئران المحقونة ب AAV التي تعبر عن البروتينات الوظيفية. على وجه الخصوص ، تبين أن فيلم fibroin-AAV الموجود على الغلاف أسهل بكثير من طريقة حقن AAV التقليدية للتعبير عن GECIs عبر المنطقة الواسعة من القشرة. باستخدام مزيج من اثنين من AAVs ترميز GECIs بألوان مختلفة41 ، يمكن تصوير العلاقة بين نشاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد على مساحة واسعة من القشرة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق طريقة فيلم fibroin-AAV على أجهزة استشعار حيوية أخرى مشفرة وراثيا42،43،44،45،46،47.
نافذة الجمجمة الأكبر ، والتي يمكنها تصوير نصفي الكرة الأرضية ، ممكنة أيضا. تم مؤخرا تطوير مجاهر ثنائية الفوتون ذات مجال رؤية أوسع بكثير (~ 25 مم2)25،26،27،28،29. إن الجمع بين تقنية التصوير ثنائية الفوتون هذه والتصوير واسع المجال لفوتون واحد باستخدام نافذة الجمجمة الواسعة الموصوفة هنا سيسمح لنا بفحص العلاقة بين النشاط السكاني ونشاط الخلية الواحدة من مقاييس غير مسبوقة.
القيود لا يسمح غلاف الطعام بمرور أي مواد. هذا يجعل من الصعب استخدام الطريقة للتجارب الدوائية. من الصعب أيضا إزالة الغلاف ، مما يجعل من المستحيل إدخال ماصة زجاجية أو قطب كهربائي. لذلك ، من الصعب تنفيذ التجارب جنبا إلى جنب مع طرق أخرى مثل تصوير الكالسيوم في وقت واحد والتسجيلات الكهربية ، والإدارة المحلية للأدوية باستخدام ماصة زجاجية. الحل المحتمل لهذه القيود هو استخدام الغلاف والنافذة الزجاجية مع فتحة. هذا يسمح بالوصول إلى الدماغ عبر ماصة زجاجية أو قطب تسجيل مع الحفاظ على نافذة الجمجمة معقمة لفترة طويلة48.

يبحث تصوير الكالسيوم واسع المجال بشكل فعال في نمط النشاط الزماني المكاني على مساحة كبيرة من دماغ الحيوان1،2،3. تم استخدام التصوير واسع المجال على نطاق واسع لمراقبة السطح القشري الكامل للقوارض نظرا لأن قشرتها مسطحة نسبيا2،3،4،5،6،7،8،9،10. يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الفئران المحقونة بالفيروس المرتبط بالغدي (AAV) ، والتي تعبر على وجه التحديد عن GECIs في خلايا مختلفة مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، لتصوير الكالسيوم واسع المجال11،12،13. ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية لهذه التقنية عادة لا تكفي لحل نشاط الخلايا الفردية في الجسم الحي14. كما أنها ليست مناسبة لتصوير الخلايا الموجودة في طبقات أعمق.
من ناحية أخرى ، يمكن لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون مراقبة نشاط خلايا متعددة في وقت واحد مع الدقة المكانية تحت الخلوية ، مما يسمح بمراقبة نشاط الخلايا الفردية حتى في التشعبات العصبية والعمليات الدبقية 15،16،17،18،19،20،21،22. يمكنه أيضا مراقبة الخلايا في الطبقات العميقة من القشرة الدماغية23,24. على الرغم من أن التطورات التكنولوجية الحديثة في الفحص المجهري ثنائي الفوتون تمكن من التصوير من المناطق القشرية بعرض ملليمتر25،26،27،28،29 ، إلا أنه لا يزال من الصعب مراقبة منطقة مماثلة للتصوير واسع المجال عن طريق التصوير ثنائي الفوتون.
لفهم الأهمية الفسيولوجية لنشاط الدماغ من خلية واحدة إلى الدماغ بأكمله ، من الأهمية بمكان سد الفجوة بين نشاط المناطق القشرية على القشرة بأكملها وذلك عند دقة الخلية الواحدة في الدوائر العصبية المحلية. لذلك ، فإن الجمع بين تصوير الكالسيوم واسع المجال والفوتون الذي يتم إجراؤه في نفس الماوس فعال بشكل خاص. لتحقيق ذلك ، يجب إنشاء نافذة جمجمة واسعة ومستقرة ، من الناحية المثالية على مدى فترة طويلة.
في السابق ، تم تطوير العديد من التقنيات لصنع نوافذ الجمجمة للسماح بإجراء تصوير واسع المجال وفوتونين في نفس الماوس30,31. تسمح النوافذ الزجاجية ذات الغطاء شبه المنحرف (الجمجمة البلورية) ، والتي يتم تشكيلها على شكل السطح القشري لتحل محل العظم الذي تمت إزالته ، بالوصول البصري عبر القشرة32 بأكملها. بدلا من ذلك ، يمكن صنع نوافذ الجمجمة القائمة على البوليمر باستخدام البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET)33 أو البوليمرات النانوية غير المتبلورة المطلية بأكسيد البولي إيثيلين34. وقد ثبت أن كل طريقة تحافظ على نافذة مستقرة لأكثر من 1 شهر. ومع ذلك ، فإن إنتاج هذه النوافذ ليس بالأمر السهل ، وغالبا ما تكون المواد والمعدات المستخدمة باهظة الثمن.
تصف الدراسة الحالية طريقة جديدة لصنع نافذة جمجمة كبيرة باستخدام فيلم PVDC (غلاف طعام بلاستيكي) (الشكل 1). باستخدام هذه النافذة ، يمكن إجراء تجارب التصوير واسعة المجال والفوتون في الجسم الحي في نفس الفئران. وقد تبين أيضا أنه يمكن التعبير عن GECIs في الخلايا العصبية على مساحة واسعة من قشرة الفئران عن طريق تشكيل طبقة رقيقة من الفيلم تحتوي على جزيئات AAV على الغلاف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

يسمح تصوير الكالسيوم واسع المجال من القشرة المخية الحديثة للفأر بمراقبة النشاط العصبي على مستوى القشرة المتعلقة بوظائف الدماغ المختلفة. من ناحية أخرى ، يمكن للتصوير ثنائي الفوتون حل نشاط الدوائر العصبية المحلية على مستوى الخلية الواحدة. من الأهمية بمكان إنشاء نافذة جمجمة كبيرة لإجراء تحليل متعدد النطاقات باستخدام تقنيتي التصوير في نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يجب على المرء إزالة جزء كبير من الجمجمة وتغطية السطح القشري المكشوف بمواد شفافة. في السابق ، تم تطوير الجماجم الزجاجية ونوافذ الجمجمة القائمة على البوليمر لهذا الغرض ، ولكن هذه المواد لا يتم تصنيعها بسهولة. يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لصنع نافذة جمجمة كبيرة تتكون من فيلم تغليف كلوريد البولي فينيليدين (PVDC) المتاح تجاريا ، وسدادة سيليكون شفافة ، وغطاء زجاجي. لتصوير السطح الظهري لنصف الكرة بأكمله ، كان حجم النافذة حوالي 6 × 3 مم2. لم تلاحظ اهتزازات الدماغ الشديدة بغض النظر عن هذه النافذة الكبيرة. الأهم من ذلك ، أن حالة سطح الدماغ لم تتدهور لأكثر من شهر واحد. كشف التصوير واسع المجال لفأر يعبر عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GECI) ، GCaMP6f ، وتحديدا في الخلايا النجمية ، عن استجابات متزامنة في بضعة ملليمترات. أظهر التصوير ثنائي الفوتون لنفس الفأر استجابات بارزة للكالسيوم في الخلايا النجمية الفردية على مدى عدة ثوان. علاوة على ذلك ، تم تطبيق طبقة رقيقة من فيروس مرتبط بالغدي على فيلم PVDC وعبر بنجاح عن GECI في الخلايا العصبية القشرية فوق نافذة الجمجمة. هذه التقنية موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لصنع نافذة جمجمة كبيرة وتسهل التحقيق في الديناميات العصبية والدبقية وتفاعلاتها أثناء السلوك على المستويين العياني والمجهري.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

يصف البروتوكول الحالي صنع نافذة جمجمة كبيرة (6 × 3 مم2) باستخدام غلاف الطعام والسيليكون الشفاف وغطاء زجاجي. تسمح هذه النافذة القحفية في الجسم الحي بإجراء تجارب تصوير الكالسيوم واسعة المجال وثنائية الفوتون في نفس الفأر.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم واسع المجال وثنائي الفوتون من فأر باستخدام نافذة جمجمة كبيرة

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

يظهر هذا البروتوكول إنشاء نافذة جمجمة كبيرة لقياس أنشطة الحجز واسعة المجال والخلية الواحدة في نفس الماوس. باستخدام طريقتنا ، يمكن صنع نافذة جمجمة كبيرة ومستقرة مع غلاف الطعام بتكلفة منخفضة. هذه الطريقة فعالة لدراسة الأنشطة العصبية والدبقية أثناء السلوك على المستويات العيانية والمجهرية.من المستحسن أن تبدأ مع نافذة صغيرة في الجمجمة. ثم إذا نجحت ، فقم بزيادة حجم النافذة. ابدأ بإزالة الأسمنت الزائد فوق الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان.ضع علامة على المنطقة المراد قطعها بقلم. قطع في العظام باستخدام مشرط مع طرف حاد للتأكد من أن الطرف لا يخترق الجمجمة. كشط العظم بشكل متكرر بمشرط لتعميق الأخدود حتى يتحرك العظم في المنطقة المراد قصها عند لمسها برفق.قم بإزالة العظم المقطوع بملاقط دقيقة. كن حذرا حتى لا تدفع سديلة العظام إلى الدماغ مما قد يؤدي إلى تلف الدماغ. لإزالة الأم الجافية ، قم بقطع الجافية باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة بطرف مدبب يبلغ حوالي 10 ميكرومتر.استخدم إبرة على شكل حرف U لتوسيع هذا القطع على النافذة بأكملها. تحت مجهر ستيريو مضبوط على تكبير 60 إلى 100x ، قم بإزالة الأم الجافية المقطوعة بملاقط فائقة الدقة. في حالة النزيف، اشطفه باستخدام السائل الدماغي النخاعي أو استخدم إسفنجة الجيلاتين لوقف النزيف.بعد ذلك ، قم بتعقيم قطعة كبيرة من غلاف PVDC عن طريق التعقيم وبنسبة 70٪ من الإيثانول. تحت مجهر ستيريو ، استخدم ملاقط ومشرط لقطع غلاف بالحجم المطلوب. ضع الغلاف على سطح الدماغ مع ترك السائل الدماغي النخاعي على السطح.قم بامتصاص aCSF من حافة الغلاف ، مما يسمح للغلاف بالالتصاق بقوة بسطح الدماغ. تقليم التفاف مع مشرط وملاقط بحيث يكون هناك ما يقرب من هامش ملليمتر واحد بين حافة نافذة الجمجمة والتفاف. بمجرد وضع الغلاف في مكانه ، قم بلصق حافة الغلاف على الجمجمة بمادة لاصقة بيولوجية.اترك المادة اللاصقة تجف لمدة 30 دقيقة. باستخدام موزع بطرف خلط ، ضع مطاطا صناعيا شفافا من السيليكون أعلى الغلاف. ضع غطاء الزجاج بسمك 0.12 إلى 0.17 ملم في الأعلى.أغلق محيط زجاج الغطاء بغشاء مقاوم للماء أو غراء فائق أو أسمنت أسنان. أولا ، امزج محاليل الفبروين و AAV بنسبة واحد إلى أربعة في أنبوب عينة صغير. قم بإسقاط حصة من المحلول على الغلاف البلاستيكي لنافذة الجمجمة وجففها لمدة ثلاث ساعات على الأقل.ثم قم بتوصيل الغلاف بسطح الدماغ كما هو موضح في القسم السابق. تحقق من حالة الفئران والنوافذ بانتظام ، من أسبوعين إلى أربعة أسابيع. بحلول هذا الوقت ، سيتم التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا بشكل كاف بعد إنشاء النافذة المعالجة ب AAV.باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحفاظ على نوافذ الجمجمة في ثمانية من 10 فئران لمدة تصل إلى 10 أسابيع. يتم إنشاء نافذة واسعة مع غلاف بلاستيكي ، سيليكون شفاف ، وغطاء زجاجي في فأر معدل وراثيا يعبر عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا في الخلايا النجمية. تم إجراء تصوير الكالسيوم واسع المجال من خلال هذه النافذة ولوحظت تغيرات مضان عندما تم تطبيق تحفيز نفخة الهواء على الشعيرات المقابلة.أظهر المسار الزمني لتغيير التألق في القشرة الحسية الجسدية نشاطا قشريا. سمح التصوير ثنائي الفوتون بمراقبة صور مضان الخلية المفردة الخاصة بالخلايا الدبقية. لوحظت تغيرات مضان ناجمة عن التحفيز الحسي في الخلايا الفردية من مناطق قشرية مختلفة.التفاف مشفر مع AAV معبرا عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا ؛ و تم استخدام الفبروين لصنع نافذة الجمجمة. أظهر تصوير الكالسيوم واسع المجال نشاطا قشريا ينتشر عبر القشرة الناجم عن التحفيز الحسي بعد أسبوعين إلى أربعة أسابيع من الجراحة. نظرا لأن النافذة كانت كبيرة ، فقد تم تصوير مناطق قشرية مختلفة من نفس الفأر وشوهدت تغيرات مضان ناتجة عن التحفيز الحسي في الخلايا الفردية.من المهم تجنب تلف الدماغ عند صنع نافذة الجمجمة. يمكن للمرء أداء مهام السلوك على الفئران مع نافذة الجمجمة الكبيرة. سيسمح ذلك بفحص العلاقة بين النشاط العصبي وسلوك الفأر.يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من دراسات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لمراقبة النشاط القشري أثناء مهام صنع القرار ، والجري الحركي ، وفي النماذج الجماعية لإصابات الدماغ والمرض.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

إجراء حج القحف الجانبي الكبير ل ميسوسكيل التصوير البصري الميداني واسعة النطاق من نشاط الدماغ

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

في الجسم الحي التصوير المزمن ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة في قرن آمون الفأر

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...