Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 til SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 til SM, 15KK0340 til ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 til HB og JP17H06313 til KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 til SM, JP19dm0207079 til HB og JP19dm0207080 til KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (til SM), Tilskud til ung forsker fra Yamanashi Prefecture (til SM) og Takeda Science Foundation (til SM) og delvist støttet af The Frontier Brain Research Grant fra Univ. Yamanashi.
Vi takker N. Yaguchi og K. Okazaki for dyrepleje og teknisk bistand og medlemmer af Kitamura-laboratoriet for nyttige diskussioner.

De eksperimentelle procedurer blev godkendt af Animal Experiment Committee ved University of Yamanashi. Wild-type (C57BL/6J, Japan SLC) og transgene mus, der udtrykker membranforankret GECI (Lck-GCaMP6f) i astrocytter, blev anvendt i denne undersøgelse. De transgene mus blev opnået ved at krydse AldH1l1-CreERT2 mus [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, kommercielt fremstillet, se Materialetabel] og Flx-Lck-GCaMP6f mus [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-GCaMP6f)Khak>/J, kommercielt opnåede] mus. De transgene mus blev behandlet med tamoxifen (20 mg/ml) i 5 dage (0,05 ml/10 g legemsvægt, i.p.) for at udtrykke GCaMP6f. Alle mus, der blev brugt, var hanner og hunner, der var mindst 4 uger gamle. Vinduets skema er vist i figur 1A, og den kirurgiske procedure er opsummeret i figur 1B.
1. Forberedelse til kranial vindueskirurgi
<ol><li>Anæstetik mus med isofluran (induktion: 3%, kirurgi: 1% -1,5%, strømningshastighed: 0,2-0,3 l / min). Bekræft dybden af anæstesi ved tab af hale eller tå klemmerefleks. Bevar kropstemperaturen ved hjælp af en varmepude (36-38 °C). Påfør øjensalve med en vatpind for at forhindre musens øjne i at tørre ud under anæstesi.</li>
	<li>15 % mannitolopløsning (se materialetabel) injiceres intraperitonealt (3 ml/100 g legemsvægt). Fastgør musens hoved på en stereotaxisk ramme med ørestænger. Fjern hår fra musens hoved ved hjælp af en barbermaskine og hårfjerningscreme.</li>
	<li>Desinficer hudoverfladen med povidon-jod og alkohol tre gange. Påfør lidokain topisk for at give forebyggende analgesi. Fjern huden over interesseområdet med kirurgisk saks og udsæt kraniet (størrelse: 15 x 15 mm). Hvis der er blødning, skal du bruge en vatpind til at stoppe blødningen. BEMÆRK: I denne undersøgelse blev huden fjernet for at observere den præfrontale cortex til den visuelle cortex.</li>
	<li>Fjern periosteum over det udsatte kranium ved hjælp af en mikrocurette og tør kraniets overflade for at fastgøre hovedpladen fast til kraniet med tandcement (se Materialetabel) (figur 2B). BEMÆRK: Den specialfremstillede hovedplade oprettes ved hjælp af en 3D-printer. Designfilen deponeres i Github-depotet (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).</li>
	<li>Fastgør hovedpladen ved hjælp af tandcement (figur 2C). Vent mindst 20 minutter på, at cementen hærder. Fastgør hovedpladen med hovedpladeholderen35.</li>
</ol>2. Gør kranialvinduet
<ol><li>Fjern den ekstra cement over kraniet med en tandbor (se Materialetabel). Pas på ikke at bore gennem knoglen og beskadige hjernen ved at bore.</li>
	<li>Marker det område, der skal skæres med en pen og skæres ind i knoglen med en skalpel. Stump spidsen af skalpellen for at sikre, at spidsen ikke trænger ind i kraniet (supplerende figur 1). Henvis til hjerneatlaset for at bestemme, hvor vinduet skal laves. BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev der skabt et vindue mellem -2 mm og +4 mm fra bregma i anteroposterioraksen og fra sagittal sutur til +3 mm i den middelmådige akse, herunder motoriske, somatosensoriske og visuelle cortices.</li>
	<li>Skrab knoglen gentagne gange med en skalpel for at uddybe rillen, indtil knoglen i det område, der skal trimmes, bevæger sig godt, når den berøres let.</li>
	<li>Fjern den indskårne knogle med en fin pincet. Skub ikke knogleklappen ind i hjernen, hvilket kan beskadige hjernen (figur 1Ba). BEMÆRK: Hvis der observeres blødning efter fjernelse af knoglen, skal du straks anvende og aspirere kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, se Materialetabel) og gentage denne proces, indtil blødningen stopper. Alternativt kan du placere en hæmostatisk gelatinesvamp (ca. 3 mm firkantede terninger) gennemblødt i ACSF på blødningspunktet.</li>
	<li>Hvis dura ikke fjernes, skal du fortsætte til trin 2.7.</li>
	<li>Fjern dura mater ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Fjern dura, for eksempel i følgende situationer; transfektion ved hjælp af fibroin-AAV-filmmetoden36 og observation af små strukturer såsom dendritiske rygsøjler.</li>
		<li>Skær duraen ved hjælp af en trukket glaspipette med en tilspidset spids på ca. 10 μm. For at udvide dette snit over hele vinduet skal du bruge en U-formet nål.</li>
		<li>Indstil stereomikroskopzoom til 60-100x og fjern den afskårne dura mater med ultrafin pincet. Hvis fjernelse af dura mater forårsager blødning, skylles med ACSF eller brug en gelatinesvamp til at stoppe blødningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Skær PVDC-indpakningen ud.<ol><li>Steriliser et stort (for eksempel 10 x 15 mm) stykke PVDC-wrap (ca. 11 μm, se Materialetabel, figur 2Aa) ved autoklavering og med 70% ethanol.</li>
		<li>Under et stereomikroskop skal du bruge pincet og en skalpel til at skære en wrap af den ønskede størrelse ud. BEMÆRK: Wrap-størrelsen skal være ca. 10 mm større end kranievinduets størrelse, men mindre end åbningen af hovedpladen. For et 6 x 3 mm2 kranievindue skal du forberede en 15 x 10 mm2 wrap.</li>
	</ol></li>
	<li>Placer indpakningen nøjagtigt ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Placer indpakningen på hjerneoverfladen, og lad ACSF stå på overfladen. Sug ACSF ud fra kanten af viklen, så viklen kan klæbe fast til hjerneoverfladen (figur 1Bb, c). BEMÆRK: Den anvendte wrap er rynkebestandig, så bare at placere den på hjernens overflade producerer næsten ingen rynker.</li>
		<li>Trim indpakningen med en skalpel og pincet, så der er ca. 1 mm margen mellem kanten af kranievinduet og indpakningen (figur 1Bd).</li>
		<li>Når viklen er på plads, limes kanten af viklen på kraniet med et biologisk klæbemiddel (se Materialetabel, figur 2D). Lad klæbemidlet tørre i ca. 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Påfør den gennemsigtige silikone elastomer.<ol><li>Påfør den kommercielt tilgængelige gennemsigtige silikoneelastomerer (se Materialetabel) oven på indpakningen ved hjælp af en dispenser med en blandingsspids (figur 1Be, 2A b-d), og anbring dækglasset (0,12-0,17 mm tykkelse) ovenpå (figur 2E).</li>
		<li>Forsegl omkredsen af dækglasset med vandtæt film, superlim eller tandcement (figur 1Bf).</li>
	</ol></li>
	<li>Efter operationen skal du overvåge musen, indtil den genvinder bevidstheden for at opretholde sternal recumbency. Derefter skal du holde musene individuelt og lade dem komme sig i deres hjemmebur i mindst 7 dage.<ol><li>For at reducere stress og smerte skal du administrere antiinflammatoriske og smertestillende midler (f.eks. Dexamethason og ketoprofen, 5 mg / kg hver, i.p.).</li>
	</ol></li>
	<li>Overvåg musene regelmæssigt for infektion. Hvis en infektion bekræftes, administreres et antimikrobielt lægemiddel (f.eks. 10 % enrofloxacin, 1,7 μL/ml) i drikkevandet, indtil infektionen er elimineret (typisk mindre end 4 uger).</li>
</ol>3. Fremstilling af AAV-film på plastfolie ved hjælp af fibroinopløsning
BEMÆRK: Trin 3 er valgfrit.
<ol><li>Forbered fibroinopløsning fra silkeormskokoner efter en tidligere offentliggjort metode37.<ol><li>Kort sagt, kog kommercielt tilgængelige normale silkeormskokoner (5 g, se Materialetabel) i natriumcarbonatopløsning (0,02 M, 2 L). Vask kokonerne i ultrarent vand og tør natten over.</li>
		<li>De tørrede kokoner opløses i lithiumbromidopløsning (9,3 M, 20 % w/v fibroin) under opvarmning i en ovn ved 60 °C i 4 timer. Dialysér opløsningen af den opløste kokon, centrifuge (to gange ved 12.700 x g, ved 4 °C i 20 min)37, og opsamling supernatanten.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered fibroin-AAV-filmen ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Bland fibroin- og AAV-opløsninger20 i forholdet 1:4 i et lille prøverør ved hjælp af en mikropipette. Slip en aliquot af den blandede fibroin-AAV-opløsning på plastfolien til kranialvinduet, og tør den i mindst 3 timer. BEMÆRK: Til udtryk i et område på 3 mm i diameter påføres en 5 μL dråbe fibroin-AAV-opløsning. Dette forhold bestemmer mængden af opløsning for et givet område.</li>
		<li>Efter tørring skæres plastfolien i den ønskede størrelse til vinduet (for eksempel 10 x 15 mm) og placeres på hjerneoverfladen. Følg derefter ovennævnte metode fra trin 2.8.1 og fremefter. BEMÆRK: Før du placerer indpakningen på hjerneoverfladen, skal du fjerne ACSF på hjerneoverfladen så meget som muligt. Dette skyldes, at ACSF forventes at opløse fibroin-AAV-filmen og reducere koncentrationen af AAV-partikler.</li>
		<li>Vent ca. 2-4 uger efter oprettelse af det AAV-behandlede vindue, indtil GECI'erne er udtrykt tilstrækkeligt. Under denne proces skal du regelmæssigt kontrollere musens og vinduernes tilstand.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Calciumbilleddannelse og analyse
BEMÆRK: For detaljer om billeddannelse og analyse, se tidligere offentliggjorte rapporter 1,2,38.
<ol><li>Udfør vidvinkelbillede ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Immobiliser musen ved hjælp af en hovedfikseringsanordning under et tandemlinsefluorescensmakroskop (se Materialetabel).</li>
		<li>Belys hjernebarken hos mus med excitationslys fra en 465 nm LED-lyskilde gennem et excitationsfilter, dikroisk spejl og objektiv linse.</li>
		<li>Saml fluorescensbillederne af hjernebarken ved hjælp af et CCD-kamera gennem et objektivt objektiv (1,0x), dikroisk spejl, emissionsfilter og billedobjektiv (2,0x). Kombinationen af disse linser giver en samlet forstørrelse på ca. 0, 5x.</li>
		<li>Anskaf billeder med en samplingfrekvens på 50 Hz. Efter dataindsamling skal du analysere billederne ved hjælp af ImageJ-software. Vælg interesseområdet manuelt. Beregn fluorescensændring i hver ROI som ΔF/F = (Ft - F0) / F0, hvor Ft er den rå fluorescensværdi for hver ramme, og F0 er den gennemsnitlige fluorescensværdi opnået fra et gennemsnitligt billede af alle rammer. BEMÆRK: Et makroprogram til ImageJ deponeres til GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), som beregner ΔF/F-billeder ud fra calciumbilleddata.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør to-fotonbilleddannelse ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Immobiliser musen under et to-fotonmikroskop ved hjælp af en hovedfikseringsenhed. Identificer det område, der skal afbildes, ved hjælp af mikroskopet i lysfelttilstand med et objektiv med lav forstørrelse (5x).</li>
		<li>Skift til to-fotonbilleddannelse. Brug et objektiv med høj forstørrelsesmål (16x eller 25x), og belys laseren til to-foton excitation. BEMÆRK: Green Lck-GCaMP6f22 og rød XCaMP-R36 blev ophidset af en ultrahurtig laser ved excitationsbølgelængder på henholdsvis 920 nm og 1070 nm.</li>
		<li>Anskaf fluorescensbilleder ved 30 Hz. Efter dataindsamling skal du rette bevægelsesartefakter ved hjælp af registreringsfunktionen i suite2p-softwaren39. Få ROI og ΔF/F fra billeder ved hjælp af den samme metode til bredfeltsbilleddannelse.</li>
	</ol></li>
	<li>Afbild dataene ved hjælp af python med følgende biblioteker: NumPy, Matplotlib og Pandas (se Materialetabel).</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne artikel præsenterer en billig metode til at skabe et stort kranialvindue ved hjælp af en PVDC plastfolie, gennemsigtig silikone og dækglas. Ved hjælp af denne metode viste vi, at bredfelt calciumbilleddannelse kunne udføres over et stort område af hjernebarken. To-foton calcium billeddannelse kan udføres fra flere forskellige kortikale regioner i den samme mus, der har gennemgået bredfeltsbilleddannelse. Desuden har det vist sig, at en fibroin-AAV-film på plastfolien, der blev brugt til vinduet, kunne udtrykke GECI over et stort område af cortex.
Kritiske skridt Det er vigtigt at undgå infektion og skade på hjernen, når man laver kraniale vinduer ved hjælp af plastfolie. Under disse forhold kan neural og glial aktivitet ikke observeres, og billeddannelse af dybere områder er umulig. Skade på blodkar resulterer også i blødning, hvilket gør billeddannelse umulig på grund af blod. For at undgå infektion er det afgørende at gøre hjerneoverfladen og indpakningen fastgjort så tæt som muligt ved at suge ACSF ud. Mannitol administration er vigtigt for at undgå hjerne- og blodkarskader ved at forhindre øget hjernetryk under operationen. Dette opretholder mellemrummet mellem hjernens overflade og dura mater og forhindrer hjernen og blodkarrene i at blive rørt under fjernelsen af kraniet og dura mater. Et stereomikroskop med høj forstørrelse og pincet med skarpe spidser er også effektive til nøjagtig kirurgi.
I fibroin-AAV-metoden er det vigtigt at anvende kødsilkeormskokoner, ikke at fryse fibroinopløsning, at tørre fibroin-AAV-opløsningen tilstrækkeligt og at anvende tilstrækkeligt volumen opløsning (5 μL pr. 3 mm diameter). Når ældre kokoner blev brugt, var udtrykseffektiviteten lavere. Dette skyldes, at fibroin fra gamle kokoner let kan denatureres. Når fibroinopløsningen blev frosset ned ved -80 °C og optøet på anvendelsestidspunktet, var ekspressionseffektiviteten dårlig. Dette kan skyldes denaturering af proteinet på grund af frysning og optøning. Da fibroinopløsninger, der opbevares ved 4 °C, kan anvendes effektivt indtil gelering, anbefales det, at fibroinopløsninger opbevares nedkølet og renses fra kokoner igen efter gelering. Fibroin-AAV-opløsningen skal tørres i mindst 3 timer, da ekspressionen er dårlig efter mindre end 3 timer. Endelig afhænger ekspressionsområdet af mængden af anvendt fibroin-AAV-opløsning. I eksemplet i figur 3M var mængden lille (5 μL); fibroin-AAV-filmen dækkede således kun den øverste halvdel af vinduet, hvilket resulterede i et ikke-ensartet udtryk over vinduet. Hvis der anvendes en tilstrækkelig mængde fibroin-AAV, vil udtrykket være ensartet over hele vinduet.
Modifikationer af teknikken Den nye kraniale vinduesteknik gør det muligt at undersøge den makroskopiske aktivitet af kortikale kredsløb og deres underliggende enkeltcelleaktivitet i samme mus. Metoden kan således anvendes på en række neurovidenskabelige undersøgelser. For eksempel kan det bruges til at observere kortikal aktivitet under beslutningsopgaver, motorisk læring og i musemodeller af hjerneskade og sygdom. Vi mener også, at metoden ikke kun kan anvendes på gnavere, men også på ikke-menneskelige primater.
Dette papir viser, at det store kranialvindue er effektivt til billeddannelse af transgene mus og mus injiceret med AAV, der udtrykker funktionelle proteiner. Det er især vist, at fibroin-AAV-filmen på wrap er meget lettere end en konventionel AAV-injektionsmetode til at udtrykke GECI'er over cortexens brede område. Ved hjælp af en blanding af to AAV'er, der koder for GECI'er i forskellige farver41, kan korrelationen mellem neuron- og gliacelleaktivitet samtidig afbildes over et bredt område af cortex. Desuden kan fibroin-AAV-filmmetoden også anvendes på andre genetisk kodede biosensorer 42,43,44,45,46,47.
Det større kraniale vindue, som kan afbilde begge halvkugler, er også muligt. To-fotonmikroskoper med et meget bredere synsfelt (~ 25 mm2) er for nylig blevet udviklet 25,26,27,28,29. Ved at kombinere denne to-fotonbilleddannelsesteknik med en-foton bredfeltsbilleddannelse ved hjælp af det brede kraniale vindue, der er beskrevet her, vil vi kunne undersøge forholdet mellem befolkningsaktivitet og enkeltcelleaktivitet fra hidtil usete skalaer.
Begrænsninger Madindpakningen tillader ingen stoffer at passere igennem. Dette gør metoden vanskelig at anvende til farmakologiske forsøg. Det er også vanskeligt at fjerne indpakningen, hvilket gør det umuligt at indsætte en glaspipette eller elektrode. Derfor er det svært at gennemføre eksperimenter kombineret med andre metoder såsom samtidig calciumbilleddannelse og elektrofysiologiske optagelser og lokal administration af lægemidler ved hjælp af en glaspipette. En mulig løsning på disse begrænsninger er at bruge wrap og glasvindue med et hul. Dette giver adgang til hjernen via en glaspipette eller en optageelektrode, samtidig med at kranievinduet holdes sterilt i lang tid48.

Wide-field calcium imaging undersøger effektivt det spatiotemporale aktivitetsmønster over et stort område af dyrehjernen 1,2,3. Bredfeltsbilleddannelse er blevet brugt i vid udstrækning til at observere gnaveres hele kortikale overflade, da deres cortex er relativt flad 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgene mus eller mus injiceret med adeno-associeret virus (AAV), som specifikt udtrykker GECI'er i forskellige celler såsom neuroner og gliaceller, kan bruges til bredfelt calciumbilleddannelse11,12,13. Imidlertid er den rumlige opløsning af denne teknik normalt ikke nok til at løse aktiviteten af individuelle celler in vivo14. Det er heller ikke egnet til billeddannelsesceller placeret i dybere lag.
På den anden side kan to-foton calciumbilleddannelse observere aktiviteten af flere celler samtidigt med subcellulær rumlig opløsning, hvilket tillader observation af aktiviteten af individuelle celler selv i neuronale dendritter og glialprocesser 15,16,17,18,19,20,21,22. Det kan også observere celler i dybere lag af hjernebarken23,24. Selvom de seneste teknologiske fremskridt inden for to-fotonmikroskopi muliggør billeddannelse fra millimeterbrede kortikale regioner 25,26,27,28,29, er det stadig vanskeligt at observere et område, der kan sammenlignes med bredfeltsbilleddannelse ved to-fotonbilleddannelse.
For at forstå den fysiologiske relevans af hjerneaktivitet fra enkeltcelle til hele hjernen er det afgørende at bygge bro mellem aktiviteten af kortikale regioner over hele cortex og den ved enkeltcelleopløsning i lokale neurale kredsløb. Derfor er en kombination af bredfelts- og to-fotoncalciumbilleddannelse udført i samme mus særlig effektiv. For at realisere dette skal der oprettes et bredt og stabilt kranievindue, ideelt set over en lang periode.
Tidligere er der udviklet flere teknikker til fremstilling af kraniale vinduer for at gøre det muligt at udføre bredfelts- og tofotonbilleddannelse i samme mus30,31. Trapezformede dækglasvinduer (krystalkraniet), der er støbt i form af den kortikale overflade for at erstatte den fjernede knogle, tillader optisk adgang over hele cortex32. Alternativt kan polymerbaserede kranialvinduer fremstilles med polyethylenterephthalat (PET)33 eller polyethylenoxidbelagte amorfe fluorpolymerer nanoark34. Hver metode har vist sig at opretholde et stabilt vindue i mere end 1 måned. Det er dog ikke let at producere disse vinduer, og de anvendte materialer og udstyr er ofte dyre.
Denne undersøgelse beskriver en ny metode til fremstilling af et stort kranievindue ved hjælp af PVDC-folien (plastfolie) (figur 1). Ved hjælp af dette vindue kan in vivo wide-field og to-foton billeddannelseseksperimenter udføres i de samme mus. Det har også vist sig, at GECI'er kunne udtrykkes i neuroner over et stort område af cortex hos mus ved at danne et tyndt lag film indeholdende AAV-partikler på wrap.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

Wide-field calcium billeddannelse fra musens neocortex gør det muligt at observere cortex-bred neural aktivitet relateret til forskellige hjernefunktioner. På den anden side kan to-fotonbilleddannelse løse aktiviteten af lokale neurale kredsløb på enkeltcelleniveau. Det er vigtigt at lave et stort kranievindue til at udføre analyse i flere skalaer ved hjælp af begge billeddannelsesteknikker i samme mus. For at opnå dette skal man fjerne en stor del af kraniet og dække den udsatte kortikale overflade med gennemsigtige materialer. Tidligere er glaskranier og polymerbaserede kranialvinduer blevet udviklet til dette formål, men disse materialer er ikke let fremstillet. Den nuværende protokol beskriver en enkel metode til fremstilling af et stort kranievindue bestående af kommercielt tilgængelig polyvinylidenchlorid (PVDC) indpakningsfilm, en gennemsigtig silikoneprop og et dækglas. Til billeddannelse af dorsaloverfladen på en hel halvkugle var vinduesstørrelsen ca. 6 x 3 mm2. Alvorlige hjernevibrationer blev ikke observeret uanset et så stort vindue. Det er vigtigt, at tilstanden af hjerneoverfladen ikke forværres i mere end en måned. Wide-field imaging af en mus, der udtrykker en genetisk kodet calciumindikator (GECI), GCaMP6f, specifikt i astrocytter, afslørede synkroniserede reaktioner i nogle få millimeter. To-fotonbilleddannelse af den samme mus viste fremtrædende calciumresponser i individuelle astrocytter over flere sekunder. Desuden blev et tyndt lag af en adeno-associeret virus påført PVDC-filmen og med succes udtrykt GECI i kortikale neuroner over kranialvinduet. Denne teknik er pålidelig og omkostningseffektiv til fremstilling af et stort kranialvindue og letter undersøgelsen af neurale og glialdynamikker og deres interaktioner under adfærd på makroskopiske og mikroskopiske niveauer.

Evaluering af et stort kranievindue fremstillet ved hjælp af PVDC-wrap-metoderne Umiddelbart efter operationen kan succes eller fiasko kontrolleres med et øjeblik af tilstanden af den kortikale overflade, såsom blødning og farveændring på grund af skade eller iskæmi. Lang tid efter operationen kan den kortikale overflade være dækket af en uigennemsigtig hvid membran på grund af infektion, eller blod kan dække vinduet på grund af blødning (figur 2G). I disse tilfælde er cortex muligvis ikke i sund tilstand, og billeddannelse er muligvis ikke mulig. Disse kan være forårsaget af delvist afskårne wraps eller utilstrækkelig fiksering af wrap af klæbemidlet. Hvis infektionen observeres gentagne gange, kan det være effektivt at anvende antibiotika, for eksempel gentaminsulfat (10 μL, 50 mg / ml), over hjerneoverfladen ved vinduesplacering. Regenerering af meninges eller knogler ses også, når det lodrette mellemrum mellem den kortikale overflade og wrap er stort. For at forhindre dette er det afgørende at anvende indpakningen så tæt som muligt på hjerneoverfladen under vinduesforberedelse. Dette kan opnås ved at placere plastfolie på hjerneoverfladen og suge så meget ACSF ud som muligt. I mangel af ACSF kan det gøres ved blot at placere plastfolien på hjerneoverfladen. Hjernen og blodkarrene er bestemt til at være ubeskadiget af det faktum, at hjernens farve ikke er misfarvet, og blodkarrene ikke er afskåret.
Vinduets levetid afhænger i vid udstrækning af kvaliteten af operationen. Når tilstanden er god, er der ingen tegn på infektion, blødning eller regenerering mere end 1 måned efter operationen (figur 2F og figur 3B). Hos 8 ud af 10 mus kunne vinduet holdes klart op til 10 uger eller længere. Vinduer i to af musene kunne ikke vedligeholdes korrekt på grund af infektion eller blødning. Selvom det store vindue kan være udsat for mekanisk belastning eller stød, blev der ikke observeret ødelagte eller revnede vinduer.
For at evaluere billedkvaliteten af det nye kranialvindue med wrap, silikone og glas blev punktspredningsfunktionen sammenlignet under det nye vindue med den under det konventionelle glasvindue ved at afbilde 0,1 μm fluorescerende perler i agar (se supplerende fil 1). Resultaterne viste ingen forskel i fuld bredde ved halv maksimum (FWHM) for begge forhold. [X-akse (μm): kun glas, 1,99 ± 0,07, wrap, 1,76 ± 0,13, Y-akse (μm): kun glas, 2,11 ± 0,27, wrap, 1,90 ± 0,15, Z-akse (μm): kun glas, 25,29 ± 0,71, wrap, 26,64 ± 1,02, N = 7 perler, p > 0,05, Mann-Whitney U-testen, supplerende figur 2A,B]. Derfor forringede de nye elementer (wrap og silikone) ikke billeddannelseskvaliteten.
Vibrationsartefakter forårsaget af åndedræt, hjerteslag og kropsbevægelse er til stede i bredfelt- og to-fotonbilleddannelse. For at bestemme, hvor meget det nye kranievindue vibrerer, blev en lille fluorescerende partikel valgt fra in vivo to-fotonbilleddata og undersøgt, hvor meget dets billede bevægede sig i løbet af 60 s. Det blev konstateret, at standardafvigelsen for centroiden af den fluorescerende partikel var ca. 0,3 μm, hvilket kan sammenlignes med den under et konventionelt glasvindue (supplerende figur 2C). Dette indikerer, at fordi hjernen blev holdt nede af et gennemsigtigt silikonestik og dækglas, var vibrationerne sammenlignelige med det, der blev observeret i konventionelle mindre vinduer, og offline billedregistrering var tilstrækkelig til at eliminere vibrationsartefakter.
I bredfelt calciumbilleddannelse kunne den kortikale aktivitet observeres formere sig over cortex induceret af sensorisk stimulering (figur 3A-D, K-N). To-fotonbilleddannelse tillod observation af enkeltcellede fluorescensbilleder, der er specifikke for neuroner og gliaceller (figur 3E, O). Fluorescensændringer induceret af sensorisk stimulering kunne observeres i individuelle celler (figur 3E-J, O-T).
Ekspression af genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er) i et stort område af hjernebarken ved hjælp af PVDC-wrap og AAV PVDC-indpakningen til vinduet kunne anvendes til at udtrykke funktionelle proteiner i et stort område af cortex. Dette opnås ved hjælp af AAV og fibroin, et komponentprotein af silkeormskokoner, der er blevet anvendt bredt som biomaterialer37. En tidligere undersøgelse viste, at fibroin kunne blandes med AAV'er og danne film implanteret i hjernen for at udtrykke funktionelle proteiner såsom fotoaktiverbare opsiner eller GECI'er36. I denne undersøgelse blev AAV, der udtrykker GECI og fibroin, blandet og tørret på wrap, og AAV-belagt wrap blev brugt til kranialvinduet. Dette resulterede i ekspression af GECI over det brede område af cortex 2-4 uger efter operationen (figur 3K-M). Da vinduet var stort, kan forskellige kortikale områder af den samme mus afbildes (figur 3M-T).
For at bekræfte ekspressionseffektiviteten af denne metode blev antallet af celler, der udtrykker GECI, talt i den faste hjerne (supplerende figur 2D). Det blev konstateret, at den nuværende strategi ved hjælp af wrap med fibroin-AAV resulterede i ekspression af GECI med en effektivitet på ca. 20% i både overfladiske og dybere lag (L2/3: 20,78%, XCaMP-R ekspressionscelle: 32 celler, DAPI: 154 placeringer, L5: 20,08%, XCaMP-R udtrykker celle: 51 celler, DAPI: 254 placeringer). Således udtrykte denne metode GECI'er i celler ikke kun i overfladelag, men også i dybere lag.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig01.jpg"> Figur 1: Konceptdiagram over det store kranievindue. (A) Til venstre, skematisk tegning af det nye kranievindue. Det er større end det konventionelle vindue (3 mm diameter). Højre, tværsnitsvisning. Metoden til fremstilling af et stort kranievindue bruger madindpakning, gennemsigtig silikoneelastomer og dækglas, hvilket muliggør bredfelts- og tofotonbilleddannelse fra den samme mus. (B) Procedure for fremstilling af kraniale vinduer: a) Fjernelse af knogler. b) Fjernelse af ACSF under indpakningen. c) Pakningens vedhæftning til hjerneoverfladen ved at fjerne ACSF. d) Fjernelse af overskydende indpakning. e) Anvendelse af gennemsigtig silikone. f) Anbringelse af dækglas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig02.jpg"> Figur 2: Oversigt over kranievindueskirurgi . (A) Materialer og udstyr, der kræves til kranialvinduet. a) Indpakningsfilm af polyvinylidenchlorid (PVDC). b) En dispenser af gennemsigtig silikoneelastomerer med en blandespids. c) Dækglas. d) Gennemsigtig silikone anbragt mellem to stykker dækglas. (B) Fotografi af musehovedhud, der er indskåret for at afsløre kraniet. Musen blev bedøvet, og musens hoved blev immobiliseret ved hjælp af ørestænger. Hovedet blev derefter afhåret, behandlet med lokal analgesi, og huden blev indskåret. (C) Foto efter montering af en hovedplade. En hovedplade (lavet af harpiks fra en 3D-printer) blev fastgjort til musens hoved med tandcement. (D) Fotografi af et kranievindue. Kranievinduet blev skabt i cortex på højre halvkugle af musehjernen. Dura mater blev fjernet, og indpakningen blev limet på plads. (E) Et foto af vinduet lavet af indpakningen med den gennemsigtige silikone og dækglas ovenpå. (F) Et typisk eksempel på et vellykket vindue (højre halvkugle, 7 uger efter operationen). (G) Eksempel på mislykket vindue (begge halvkugler, 5 uger efter operationen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig03.jpg"> Figur 3: Det store vindue tillader bredfelts- og to-foton calciumbilleddannelse fra den samme mus. (A) Calciumbilleddannelse blev udført i en transgen mus, der udtrykker membranforankret GECI (Lck-GCaMP6f) i astrocytter40. (B) Til venstre blev der skabt et stort vindue med plastfolie, gennemsigtig silikone og dækglas. Wide-field billeddannelse blev udført gennem dette vindue. Til højre blev et billede taget 79 dage efter installationen af kranialvinduet. (C) Når luftpuststimulering blev anvendt på de kontralaterale knurhår, blev der observeret fluorescensændringer. (D) Tidsforløbet for fluorescensændringen i den somatosensoriske cortex (rød firkant i C) blev plottet. Røde og blå bjælker angiver henholdsvis luftpust timing og "før", "under" og "efter" timing i (C). (E) Synsfeltet (FOV 1 i C) af to-foton calciumbilleddannelse. Fordi GCaMP6f blev udtrykt for at lokalisere til membranen, blev interesseområderne (hvide firkanter) manuelt placeret for at detektere det lokale respons i astrocytprocesser. (F) Fluorescensændringerne i de farvede firkanter i (E) afbildes. (G) Fluorescensændringerne i alle kvadrater af (E) afbildes. Vandrette og lodrette akser angiver henholdsvis tid og cellenummer. (H-J) Data for FOV 2 (i den visuelle cortex) i (C) vises. FOV 2 blev afbildet efter billeddannelsen i FOV 1. (K) Rød GECI, XCaMP-R, blev udtrykt i neuroner ved fibroin-AAV-metoden i vildtypemusen. (L) Fotografi taget to uger efter operationen, hvor vinduet blev oprettet ved hjælp af fibroinfilmen. (M) Bredfelt calciumbilleddannelse blev udført på denne mus. (N) Fluorescensændringen fremkaldt af whisker-stimulering blev plottet fra det mest fremtrædende sted (somatosensorisk cortex, rød firkant i (M)). Røde og blå linjer angiver henholdsvis luftpust timing og "før" og "under" timing i (M). (O) Synsfelt (somatosensorisk cortex, FOV 1 in (M)) af to-foton calciumbilleddannelse i 300 μm dybde. ROI'er blev manuelt placeret ved neuronal somata. (P) Fluorescensændringerne i de farvede firkanter i (O) afbildes. (Q) Fluorescensændringerne i alle kvadrater af (O) er afbildet i farve. (R-T) Data for FOV 2 i (M) placeret i parietal cortex vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: Tips til skalpeller. Spidsen af den nye skalpel (øverst) sammenlignet med skalpellen, der bruges til at skære kraniet med en stump spids (nederst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Validering af det nye kranievindue og fibroin-AAV-ekspressionsmetoden. (A) Fluorescensintensitetsprofil for 0,1 μm fluorescerende perler i agar. Den øverste række viser data fra en tilstand, hvor kun dækglas blev placeret over fluorescerende perler blandet i agar, og den nederste række viser data fra en tilstand, hvor wrap, gennemsigtig silikone og dækglas blev placeret. De grå spor viser den gaussiske pasform til fluorescensintensitetsprofilen for hver perle, og de røde spor viser deres gennemsnitsværdier (n = 7). (B) Sammenfatning af data i (A). Hver graf viser den fulde bredde ved halv maksimum (FWHM) af punktspredningsfunktionen på XYZ-aksen. Det grå plot viser dataene for hver perle, og den røde viser deres middel- og standardfejl. (C) Fra de 2.000 billeder (60 s optagelse) af in vivo-billeddata blev en lille fluorescerende partikel udvalgt og undersøgt, hvor meget billedet bevægede sig i løbet af 60'erne. Det fluorescerende billede i midten repræsenterer gennemsnittet af 2.000 billeder. Billederne blev projiceret ved gennemsnit i X- og Y-aksens retninger. Histogrammerne viser fordelingen af centroiden i hver ramme. Standardafvigelserne for centroiden var X: 0,36 og Y: 0,315 μm. (D) Eksempel på GECI-ekspression ved fibroin-AAV-metoden. Til venstre: Et stykke hjernebark påførte fibroin-AAV-ekspressionsmetoden. Rød og blå indikerer fluorescens fra henholdsvis XCaMP-R og DAPI; XCaMP-R blev udtrykt ikke kun i lag 2/3 celler, men også i lag 5 celler. Center og højre. Forstørrede visninger af lagene henholdsvis 2/3 og 5 i venstre figur (cyan firkanter). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1: (A) Viklets ekspressionseffektivitet med fibroin-AAV-filmmetoden og (B) Evaluering af punktspredningsfunktionen under tofotonbilleddannelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20File%201_FINAL.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Den nuværende protokol beskriver at lave et stort (6 x 3 mm2) kranievindue ved hjælp af madindpakning, gennemsigtig silikone og dækglas. Dette kraniale vindue tillader in vivo wide-field og to-foton calcium billeddannelse eksperimenter i samme mus.

In vivo Bredfelts- og to-foton calciumbilleddannelse fra en mus ved hjælp af et stort kranievindue

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Denne protokol viser en oprettelse af stort kranievindue til måling af bredfelts- og enkeltcellereservationsaktiviteter i samme mus. Ved hjælp af vores metode kan stort og stabilt kranievindue laves med madindpakning til lave omkostninger. Denne metode er effektiv til at studere neurale og gliale aktiviteter under adfærd på makroskopiske og mikroskopiske niveauer.Det anbefales at starte med et lille kranievindue. Så hvis det lykkes, skal du øge vinduets størrelse. Begynd med at fjerne den ekstra cement over kraniet med en tandboremaskine.Marker det område, der skal skæres med en pen. Skær ind i knoglen ved hjælp af en skalpel med en stump spids for at sikre, at spidsen ikke trænger ind i kraniet. Skrab knoglen gentagne gange med en skalpel for at uddybe rillen, indtil knoglen i det område, der skal trimmes, bevæger sig, når den berøres let.Fjern den indskårne knogle med en fin pincet. Vær forsigtig med ikke at skubbe knogleklappen ind i hjernen, som kan skade hjernen. For at fjerne dura mater skal du skære dura ved hjælp af en trukket glaspipette med en tilspidset spids på ca. 10 mikrometer.Brug en U-formet nål til at udvide dette snit over hele vinduet. Under et stereomikroskop indstillet til 60 til 100x zoom skal du fjerne den afskårne dura mater med ultra fin pincet. I tilfælde af blødning skylles med aCSF eller bruges en gelatinesvamp til at stoppe blødningen.Steriliser derefter et stort stykke PVDC-wrap ved autoklavering og med 70% ethanol. Under et stereomikroskop skal du bruge pincet og en skalpel til at skære en wrap af den krævede størrelse ud. Placer indpakningen på hjerneoverfladen, mens du efterlader aCSF på overfladen.Sug aCSF ud fra kanten af indpakningen, så indpakningen klæber fast til hjerneoverfladen. Trim indpakningen med en skalpel og pincet, så der er cirka en millimeter margen mellem kanten af kranialvinduet og viklen. Når viklen er på plads, lim kanten af viklen til kraniet med et biologisk klæbemiddel.Lad klæbemidlet tørre i ca. 30 minutter. Brug en dispenser med en blandingsspids til at påføre en gennemsigtig silikoneelastomerer oven på indpakningen. Placer dækglasset med tykkelse 0,12 til 0,17 millimeter ovenpå.Forsegl omkredsen af dækglasset med vandtæt film, superlim eller tandcement. Bland først fibroin- og AAV-opløsninger i et forhold på en til fire i et lille prøverør. Slip en aliquot af opløsningen på plastfolien til kranialvinduet og tør det i mindst tre timer.Fastgør derefter indpakningen til hjerneoverfladen som vist i det foregående afsnit. Kontroller musens og vinduernes tilstand regelmæssigt, to til fire uger. På dette tidspunkt vil de genetisk kodede calciumindikatorer blive udtrykt tilstrækkeligt efter oprettelse af det AAV-behandlede vindue.Ved hjælp af denne protokol kunne kranialvinduer vedligeholdes i otte af 10 mus i op til 10 uger. Et bredt vindue er skabt med plastfolie, gennemsigtig silikone og dækglas i en transgen mus, der udtrykker membranforankret genetisk kodet calciumindikator i astrocytter. Wide-field calcium billeddannelse blev udført gennem dette vindue, og fluorescensændringer blev observeret, når luftpuststimulering blev påført de kontralaterale whiskers.Tidsforløbet for fluorescensændringen i den somatosensoriske cortex viste kortikal aktivitet. To-fotonbilleddannelse tillod observation af enkeltcellefluorescensbilleder, der er specifikke for gliaceller. Fluorescensændringer induceret af sensorisk stimulering blev observeret i individuelle celler fra forskellige kortikale regioner.Wrap kodet med AAV, der udtrykker genetisk kodet calciumindikator;og fibroin blev brugt til fremstilling af kranialvinduet. Wide-field calcium billeddannelse viste kortikal aktivitet formering over cortex induceret af sensorisk stimulering to til fire uger efter operationen. Da vinduet var stort, blev forskellige kortikale områder af den samme mus afbildet, og fluorescensændringer induceret af sensorisk stimulering blev set i individuelle celler.Det er vigtigt at undgå skader på hjernen, når man laver kranievindue. Man kan udføre adfærdsopgaver på mus med et stort kranievindue. Dette vil gøre det muligt at undersøge forholdet mellem neural aktivitet og museadfærd.Denne metode kan anvendes til en række neurovidenskabelige undersøgelser. For eksempel kan det bruges til at observere kortikal aktivitet under beslutningsopgaver, motorløb og i massemodeller af hjerneskade og sygdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-foton<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af dendritiske spidser i Mouse Cortex Ved hjælp af en tyndere-kranium Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

En stor lateral kraniotomiprocedure for mesoscale bredfelt optisk billeddannelse af hjerneaktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation af Neuronal indbyggere ved hjælp af en to-foton Laser og dets vurdering ved hjælp af Calcium Imaging og adfærdsmæssige optagelse i zebrafisk larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillær to-foton In vivo Billeddannelse af musens nethinde

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation af et kranievindue til gentagen In Vivo-billeddannelse i vågne mus

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...