Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 to SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 to SM, 15KK0340 to ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 to HB en JP17H06313 to KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 to SM, JP19dm0207079 to HB, en JP19dm0207080 to KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (naar SM), Subsidie voor jonge onderzoeker uit de prefectuur Yamanashi (naar SM) en Takeda Science Foundation (naar SM) en gedeeltelijk ondersteund door de Frontier Brain Research Grant van Univ. Yamanashi.
We bedanken N. Yaguchi en K. Okazaki voor dierenverzorging en technische assistentie en leden van het Kitamura-lab voor nuttige discussies.

De experimentele procedures werden goedgekeurd door de Animal Experiment Committee van de Universiteit van Yamanashi. Wild-type (C57BL/6J, Japan SLC) en transgene muizen die membraan-verankerde GECI (Lck-GCaMP6f) tot expressie brengen in astrocyten werden gebruikt in deze studie. De transgene muizen werden verkregen door aldH1l1-CreERT2 muizen [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, commercieel verkregen, zie Materiaaltabel] en Flx-Lck-GCaMP6f muizen [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-GCaMP6f)Khak>/J, commercieel verkregen] muizen. De transgene muizen werden behandeld met tamoxifen (20 mg/ml) gedurende 5 dagen (0,05 ml/10 g lg, i.p.) om GCaMP6f tot expressie te brengen. Alle gebruikte muizen waren mannetjes en vrouwtjes van minstens 4 weken oud. Het schema van het venster wordt weergegeven in figuur 1A en de chirurgische ingreep is samengevat in figuur 1B.
1. Voorbereiding op schedelvensterchirurgie
<ol><li>Verdoof muizen met isofluraan (inductie: 3%, operatie: 1%-1,5%, debiet: 0,2-0,3 l/min). Bevestig de diepte van de anesthesie door het verlies van de staart- of teenknijpreflex. Houd de lichaamstemperatuur op peil met een verwarmingskussen (36-38 °C). Breng oogzalf aan met een wattenstaafje om te voorkomen dat de ogen van muizen uitdrogen onder anesthesie.</li>
	<li>Injecteer 15% mannitoloplossing (zie materiaaltabel) intraperitoneaal (3 ml / 100 g lichaamsgewicht). Bevestig de kop van de muis op een stereotaxisch frame met oorbalken. Verwijder het haar van de kop van de muis met behulp van een scheerapparaat en ontharingscrème.</li>
	<li>Desinfecteer het huidoppervlak drie keer met povidon-jodium en alcohol. Breng Lidocaïne topisch aan om preventieve analgesie te bieden. Verwijder de huid over het interessegebied met een chirurgische schaar en leg de schedel bloot (grootte: 15 x 15 mm). Als er bloedingen aanwezig zijn, gebruik dan een wattenstaafje om het bloeden te stoppen. OPMERKING: In deze studie werd de huid verwijderd om de prefrontale cortex naar de visuele cortex te observeren.</li>
	<li>Verwijder het botvlies over de blootgestelde schedel met behulp van een microcurette en droog het schedeloppervlak om de hoofdplaat stevig aan de schedel te bevestigen met tandcement (zie Materiaaltabel) (figuur 2B). OPMERKING: De op maat gemaakte kopplaat wordt gemaakt met behulp van een 3D-printer. Het ontwerpbestand wordt gedeponeerd bij de Github-repository (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).</li>
	<li>Bevestig de kopplaat met tandcement (figuur 2C). Wacht minstens 20 minuten tot het cement is uitgehard. Bevestig de kopplaat met de kopplaathouder35.</li>
</ol>2. Het schedelvenster maken
<ol><li>Verwijder het extra cement over de schedel met een tandboor (zie Materiaaltabel). Pas op dat je niet door het bot boort en de hersenen beschadigt door te boren.</li>
	<li>Markeer het te snijden gebied met een pen en snijd in het bot met een scalpel. Stomp de punt van het scalpel af om ervoor te zorgen dat de punt niet in de schedel dringt (aanvullende figuur 1). Verwijs naar de hersenatlas om te bepalen waar het venster moet worden gemaakt. OPMERKING: Voor deze studie werd een venster gecreëerd tussen -2 mm en +4 mm van bregma in de anteroposterior-as en van sagittale hechting tot +3 mm in de middellaterale as, inclusief de motorische, somatosensorische en visuele cortices.</li>
	<li>Schraap het bot herhaaldelijk met een scalpel om de groef te verdiepen totdat het bot in het te trimmen gebied goed beweegt wanneer het licht wordt aangeraakt.</li>
	<li>Verwijder het ingesneden bot met een fijn pincet. Duw de botflap niet in de hersenen, die de hersenen kan beschadigen (figuur 1Ba). OPMERKING: Als bloedingen worden waargenomen na het verwijderen van het bot, breng dan onmiddellijk kunstmatig hersenvocht (ACSF, zie Tabel met materialen) aan en aspirateer dit proces totdat het bloeden stopt. U kunt ook een hemostatische gelatinespons (ongeveer 3 mm vierkante blokjes) gedrenkt in de ACSF op het bloedingspunt plaatsen.</li>
	<li>Als de dura niet wordt verwijderd, gaat u verder met stap 2.7.</li>
	<li>Verwijder de dura mater volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Verwijder de dura, bijvoorbeeld in de volgende situaties; transfectie met behulp van de fibroïne-AAV-filmmethode36 en het observeren van kleine structuren zoals dendritische stekels.</li>
		<li>Snijd de dura met een getrokken glazen pipet met een taps toelopende punt van ongeveer 10 μm. Om deze snede over het hele venster uit te breiden, gebruikt u een U-vormige naald.</li>
		<li>Stel de stereomicroscoopzoom in op 60-100x en verwijder de afgehakte dura mater met ultrafijn pincet. Als het verwijderen van de dura mater bloedingen veroorzaakt, spoel dan met ACSF of gebruik een gelatinespons om het bloeden te stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Knip de PVDC-wrap uit.<ol><li>Steriliseer een groot (bijvoorbeeld 10 x 15 mm) stuk PVDC-wikkel (ongeveer 11 μm, zie Materiaaltabel, figuur 2Aa) door autoclaveren en met 70% ethanol.</li>
		<li>Gebruik onder een stereomicroscoop een pincet en een scalpel om een wikkel van de vereiste grootte uit te snijden. OPMERKING: De wikkelmaat moet ongeveer 10 mm groter zijn dan de grootte van het schedelvenster, maar kleiner dan de opening van de kopplaat. Voor een 6 x 3 mm2 schedelvenster, bereid een 15 x 10 mm2 wrap.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de wrap nauwkeurig volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Plaats de wrap op het hersenoppervlak en laat de ACSF op het oppervlak achter. Zuig de ACSF uit vanaf de rand van de wrap, zodat de wrap stevig aan het hersenoppervlak blijft plakken (figuur 1Bb,c). OPMERKING: De gebruikte wrap is kreukbestendig, dus alleen al het plaatsen op het oppervlak van de hersenen produceert bijna geen rimpels.</li>
		<li>Snijd de wrap bij met een scalpel en pincet zodat er ongeveer 1 mm marge is tussen de rand van het schedelvenster en de wrap (figuur 1Bd).</li>
		<li>Zodra de wrap op zijn plaats is, lijmt u de rand van de wrap op de schedel met een biologische lijm (zie Tabel met materialen, Figuur 2D). Laat de lijm ongeveer 30 min drogen.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng het transparante siliconenelastomeer aan.<ol><li>Breng het in de handel verkrijgbare transparante siliconenelastomeer (zie materiaaltabel) aan op de wrap met behulp van een dispenser met een mengpunt (figuur 1Be, 2A b-d) en plaats het afdekglas (0,12-0,17 mm dikte) bovenop (figuur 2E).</li>
		<li>Sluit de omtrek van het afdekglas af met waterdichte film, secondelijm of tandcement (figuur 1Bf).</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer na de operatie de muis totdat deze weer bij bewustzijn komt om de sternale lighouding te behouden. Houd daarna de muizen individueel en laat ze minstens 7 dagen in hun thuiskooi herstellen.<ol><li>Om stress en pijn te verminderen, dient u ontstekingsremmende en pijnstillende middelen toe (bijv. Dexamethason en ketoprofen, elk 5 mg / kg, i.p.).</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer de muizen regelmatig op infectie. Als een infectie wordt bevestigd, dien dan een antimicrobieel geneesmiddel (bijv. 10% enrofloxacine, 1,7 μL/ml) toe in het drinkwater totdat de infectie is geëlimineerd (meestal minder dan 4 weken).</li>
</ol>3. AAV-folie maken op plasticfolie met behulp van fibroïne-oplossing
OPMERKING: Stap 3 is optioneel.
<ol><li>Bereid fibroïne-oplossing uit cocons van zijderupsen volgens een eerder gepubliceerde methode37.<ol><li>Kortom, kook in de handel verkrijgbare normale zijderupscocons (5 g, zie materiaaltabel) in natriumcarbonaatoplossing (0,02 M, 2 L). Was de cocons in ultrapuur water en droog ze een nacht.</li>
		<li>Los de gedroogde cocons op in lithiumbromide-oplossing (9,3 M, 20% m/v fibroïne) tijdens verhitting in een oven op 60 °C gedurende 4 uur. Dialyseer de opgeloste coconoplossing, centrifugeer (tweemaal bij 12.700 x g, bij 4 °C gedurende 20 min)37 en verzamel het supernatant.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de fibroïne-AAV-film voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Meng fibroïne en AAV-oplossingen20 in een verhouding van 1:4 in een kleine monsterbuis met behulp van een micropipette. Laat een aliquot van de gemengde fibroïne-AAV-oplossing op de plasticfolie voor het schedelvenster vallen en droog deze gedurende ten minste 3 uur. OPMERKING: Breng voor expressie in een gebied met een diameter van 3 mm een druppel van 5 μL fibroïne-AAV-oplossing aan. Deze verhouding bepaalt de hoeveelheid oplossing voor een bepaald gebied.</li>
		<li>Snijd na het drogen de plasticfolie in de vereiste maat voor het raam (bijvoorbeeld 10 x 15 mm) en plaats deze op het hersenoppervlak. Volg vervolgens de bovengenoemde methode vanaf stap 2.8.1. OPMERKING: Voordat u de wrap op het hersenoppervlak plaatst, verwijdert u de ACSF zoveel mogelijk op het hersenoppervlak. Dit komt omdat de ACSF naar verwachting de fibroïne-AAV-film oplost en de concentratie van AAV-deeltjes vermindert.</li>
		<li>Wacht ongeveer 2-4 weken na het maken van het met AAV behandelde venster totdat de GECI's voldoende zijn uitgedrukt. Controleer tijdens dit proces regelmatig de toestand van de muizen en ramen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Calcium beeldvorming en -analyse
OPMERKING: Voor details over de beeldvorming en analyse, zie eerder gepubliceerde rapporten 1,2,38.
<ol><li>Voer wide-field imaging uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Immobiliseer de muis met behulp van een hoofdfixatieapparaat onder een fluorescentiemacroscoop van de tandemlens (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Verlicht de hersenschors van muizen met excitatielicht van een 465 nm LED-lichtbron door een excitatiefilter, dichroïsche spiegel en objectieve lens.</li>
		<li>Verzamel de fluorescentiebeelden van de hersenschors door een CCD-camera door een objectieve lens (1,0x), dichroïsche spiegel, emissiefilter en beeldlens (2,0x). De combinatie van deze lenzen geeft een totale vergroting van ongeveer 0,5x.</li>
		<li>Verkrijg beelden met een bemonsteringsfrequentie van 50 Hz. Analyseer na data-acquisitie de afbeeldingen met behulp van ImageJ-software. Selecteer de regio van belang (ROI) handmatig. Bereken fluorescentieverandering in elke ROI als ΔF / F = (Ft - F0) / F0, waarbij Ft de ruwe fluorescentiewaarde van elk frame is en F0 de gemiddelde fluorescentiewaarde die wordt verkregen uit een gemiddelde afbeelding van alle frames. OPMERKING: Een macroprogramma voor ImageJ wordt gedeponeerd bij GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), dat ΔF / F-afbeeldingen berekent op basis van calciumbeeldvormingsgegevens.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer tweefotonenbeelden uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Immobiliseer de muis onder een microscoop met twee fotonen met behulp van een hoofdfixatieapparaat. Identificeer het gebied dat moet worden afgebeeld met behulp van de microscoop in de helderveldmodus met een objectief met een lage vergroting (5x).</li>
		<li>Schakel over naar beeldvorming met twee fotonen. Gebruik een lens met een hoge vergrotingsdoelstelling (16x of 25x) en verlicht de laser voor excitatie van twee fotonen. OPMERKING: Groene Lck-GCaMP6f22 en rode XCaMP-R36 werden opgewonden door een ultrasnelle laser bij excitatiegolflengten van respectievelijk 920 nm en 1070 nm.</li>
		<li>Verkrijg fluorescentiebeelden bij 30 Hz. Na data-acquisitie, corrigeer bewegingsartefacten door de registratiefunctie van de suite2p-software39. Verkrijg ROI en ΔF/F uit afbeeldingen met dezelfde methode voor wide-field imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Plot de gegevens met python met de volgende bibliotheken: NumPy, Matplotlib en Pandas (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel presenteert een goedkope methode om een groot schedelvenster te maken met behulp van een PVDC plasticfolie, transparante siliconen en afdekglas. Met behulp van deze methode toonden we aan dat wide-field calcium imaging kon worden uitgevoerd over een groot gebied van de hersenschors. Calciumbeeldvorming met twee fotonen kan worden uitgevoerd vanuit verschillende corticale regio's in dezelfde muis die wide-field imaging heeft ondergaan. Bovendien is aangetoond dat een fibroine-AAV-film op de plasticfolie die voor het venster wordt gebruikt, GECI over een groot gebied van de cortex kan uitdrukken.
Kritieke stappen Het is belangrijk om infectie en schade aan de hersenen te voorkomen bij het maken van schedelramen met behulp van plasticfolie. In deze omstandigheden kan neurale en gliale activiteit niet worden waargenomen en is beeldvorming van diepere gebieden onmogelijk. Letsel aan bloedvaten resulteert ook in bloedingen, waardoor beeldvorming onmogelijk wordt vanwege bloed. Om infectie te voorkomen, is het van cruciaal belang om het hersenoppervlak en de wikkel zo strak mogelijk vast te maken door de ACSF eruit te zuigen. Mannitol toediening is belangrijk om hersen- en bloedvatschade te voorkomen door verhoogde hersendruk tijdens de operatie te voorkomen. Dit behoudt de ruimte tussen het oppervlak van de hersenen en de dura mater en voorkomt dat de hersenen en bloedvaten worden aangeraakt tijdens het verwijderen van de schedel en dura mater. Een stereomicroscoop met hoge vergroting en pincet met scherpe punten zijn ook effectief voor nauwkeurige chirurgie.
Bij de fibroïne-AAV-methode is het essentieel om cocons van vleeszijderupsen te gebruiken, geen fibroïne-oplossing in te vriezen, de fibroïne-AAV-oplossing voldoende te drogen en voldoende volume oplossing aan te brengen (5 μL per 3 mm diameter). Wanneer oudere cocons werden gebruikt, was de expressie-efficiëntie lager. Dit komt omdat fibroïne uit oude cocons gemakkelijk kan worden gedenatureerd. Wanneer fibroïne-oplossing werd ingevroren bij -80 °C en ontdooid op het moment van gebruik, was de expressie-efficiëntie slecht. Dit kan te wijten zijn aan de denaturatie van het eiwit als gevolg van bevriezing en ontdooien. Aangezien fibroïneoplossingen die bij 4 °C zijn opgeslagen, effectief kunnen worden gebruikt tot gelation, wordt aanbevolen om fibroïneoplossingen na gelatatie gekoeld en gezuiverd uit cocons te houden. De fibroïne-AAV-oplossing moet gedurende ten minste 3 uur worden gedroogd, omdat de expressie na minder dan 3 uur slecht is. Ten slotte hangt het expressiegebied af van de hoeveelheid fibroïne-AAV-oplossing die wordt gebruikt. In het voorbeeld in figuur 3M was de hoeveelheid klein (5 μL); de fibroïne-AAV-film bedekte dus alleen de bovenste helft van het venster, wat resulteerde in een niet-uniforme expressie over het venster. Als een voldoende hoeveelheid fibroïne-AAV wordt gebruikt, is de expressie uniform over het hele venster.
Aanpassingen van de techniek De nieuwe craniale venstertechniek maakt het mogelijk om de macroscopische activiteit van corticale circuits en hun onderliggende activiteit op eencellig niveau in dezelfde muis te onderzoeken. De methode kan dus worden toegepast op verschillende neurowetenschappelijke studies. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om corticale activiteit te observeren tijdens besluitvormingstaken, motorisch leren en in muismodellen van hersenletsel en ziekte. We geloven ook dat de methode niet alleen kan worden toegepast op knaagdieren, maar ook op niet-menselijke primaten.
Dit artikel toont aan dat het grote schedelvenster effectief is voor het in beeld brengen van transgene muizen en muizen geïnjecteerd met AAV die functionele eiwitten tot expressie brengen. In het bijzonder wordt aangetoond dat de fibroïne-AAV-film op de wrap veel gemakkelijker is dan een conventionele AAV-injectiemethode om GECI's uit te drukken over het brede gebied van de cortex. Met behulp van een mengsel van twee AAV's die GECI's van verschillende kleurencoderen 41, kan de correlatie tussen neuron- en gliacelactiviteit tegelijkertijd worden afgebeeld over een groot gebied van de cortex. Bovendien kan de fibroïne-AAV-filmmethode ook worden toegepast op andere genetisch gecodeerde biosensoren 42,43,44,45,46,47.
Het grotere schedelvenster, dat beide hemisferen in beeld kan brengen, is ook mogelijk. Twee-fotonen microscopen met een veel breder gezichtsveld (~25 mm2) zijn onlangs ontwikkeld 25,26,27,28,29. Door deze twee-fotonen beeldvormingstechniek te combineren met één-foton wide-field imaging met behulp van het brede schedelvenster dat hier wordt beschreven, kunnen we de relatie tussen populatieactiviteit en eencellige activiteit van ongekende schalen onderzoeken.
Beperkingen De voedselwikkel laat geen stoffen door. Dit maakt de methode moeilijk te gebruiken voor farmacologische experimenten. Het is ook moeilijk om de wrap te verwijderen, waardoor het onmogelijk is om een glazen pipet of elektrode in te brengen. Daarom is het moeilijk om experimenten uit te voeren in combinatie met andere methoden, zoals gelijktijdige calciumbeeldvorming en elektrofysiologische opnames, en lokale toediening van geneesmiddelen met behulp van een glazen pipet. Een mogelijke oplossing voor deze beperkingen is om de wrap en het glazen raam met een gat te gebruiken. Dit maakt toegang tot de hersenen mogelijk via een glazen pipet of een opname-elektrode terwijl het schedelvenster gedurende een lange periode steriel blijft48.

Wide-field calcium imaging onderzoekt effectief het spatiotemporale activiteitspatroon over een groot deel van het dierlijke brein 1,2,3. Wide-field imaging is op grote schaal gebruikt om het volledige corticale oppervlak van knaagdieren te observeren, omdat hun cortex relatief vlak is 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgene muizen of muizen geïnjecteerd met adeno-geassocieerd virus (AAV), die specifiek GECI's tot expressie brengen in verschillende cellen zoals neuronen en gliacellen, kunnen worden gebruikt voor wide-field calcium imaging 11,12,13. De ruimtelijke resolutie van deze techniek is echter meestal niet voldoende om de activiteit van individuele cellen in vivo op te lossen 14. Het is ook niet geschikt voor het afbeelden van cellen in diepere lagen.
Aan de andere kant kan calciumbeeldvorming met twee fotonen de activiteit van meerdere cellen tegelijkertijd observeren met subcellulaire ruimtelijke resolutie, waardoor de activiteit van individuele cellen kan worden waargenomen, zelfs in neuronale dendrieten en gliaprocessen 15,16,17,18,19,20,21,22. Het kan ook cellen observeren in diepere lagen van de hersenschors23,24. Hoewel recente technologische vooruitgang in twee-fotonenmicroscopie beeldvorming mogelijk maakt van millimeterbrede corticale gebieden 25,26,27,28,29, is het nog steeds moeilijk om een gebied waar te nemen dat vergelijkbaar is met wide-field imaging door twee-fotonen beeldvorming.
Om de fysiologische relevantie van hersenactiviteit van eencellige tot hele hersenen te begrijpen, is het van cruciaal belang om de kloof te overbruggen tussen de activiteit van corticale gebieden over de hele cortex en die bij eencellige resolutie in lokale neurale circuits. Daarom is een combinatie van wide-field en twee-foton calcium beeldvorming uitgevoerd in dezelfde muis bijzonder effectief. Om dit te realiseren moet een breed en stabiel schedelvenster worden gecreëerd, idealiter over een lange periode.
Eerder zijn verschillende technieken voor het maken van schedelvensters ontwikkeld om breedveld- en tweefotonenbeeldvorming mogelijk te maken in dezelfde muis30,31. Trapeziumvormige glazen dekvensters (kristallen schedel), die in de vorm van het corticale oppervlak zijn gegoten om het verwijderde bot te vervangen, bieden optische toegang over de gehele cortex32. Als alternatief kunnen op polymeer gebaseerde schedelvensters worden gemaakt met polyethyleentereftalaat (PET)33 of polyethyleenoxide-gecoat amorfe fluorpolymeren nanosheet34. Van elke methode is aangetoond dat het een stabiel venster gedurende meer dan 1 maand handhaaft. Het produceren van deze ramen is echter niet eenvoudig en de gebruikte materialen en apparatuur zijn vaak duur.
De huidige studie beschrijft een nieuwe methode voor het maken van een groot schedelvenster met behulp van de PVDC-film (plastic voedselfolie) (figuur 1). Met behulp van dit venster kunnen in vivo wide-field en twee-foton beeldvormingsexperimenten worden uitgevoerd in dezelfde muizen. Het is ook aangetoond dat GECI's kunnen worden uitgedrukt in neuronen over een groot gebied van de cortex van muizen door een dunne laag film te vormen met AAV-deeltjes op de wrap.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

Wide-field calcium beeldvorming van de neocortex van de muis stelt iemand in staat om cortexbrede neurale activiteit gerelateerd aan verschillende hersenfuncties te observeren. Aan de andere kant kan beeldvorming met twee fotonen de activiteit van lokale neurale circuits op het niveau van één cel oplossen. Het is van cruciaal belang om een groot schedelvenster te maken om analyse op meerdere schaal uit te voeren met behulp van beide beeldvormingstechnieken in dezelfde muis. Om dit te bereiken, moet men een groot deel van de schedel verwijderen en het blootgestelde corticale oppervlak bedekken met transparante materialen. Eerder zijn voor dit doel glazen schedels en op polymeer gebaseerde schedelvensters ontwikkeld, maar deze materialen zijn niet gemakkelijk te fabriceren. Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het maken van een groot schedelvenster bestaande uit in de handel verkrijgbare polyvinylideenchloride (PVDC) wikkelfolie, een transparante siliconenplug en een afdekglas. Voor het in beeld brengen van het dorsale oppervlak van een hele hemisfeer was de venstergrootte ongeveer 6 x 3 mm2. Ernstige hersentrillingen werden niet waargenomen, ongeacht zo'n groot venster. Belangrijk is dat de conditie van het hersenoppervlak niet langer dan een maand verslechterde. Wide-field imaging van een muis die een genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) tot expressie brengt, GCaMP6f, specifiek in astrocyten, onthulde gesynchroniseerde reacties in een paar millimeter. Tweefotonenbeelden van dezelfde muis toonden prominente calciumreacties in individuele astrocyten gedurende enkele seconden. Bovendien werd een dunne laag van een adeno-geassocieerd virus aangebracht op de PVDC-film en met succes GECI uitgedrukt in corticale neuronen over het schedelvenster. Deze techniek is betrouwbaar en kosteneffectief voor het maken van een groot schedelvenster en vergemakkelijkt het onderzoek naar de neurale en gliale dynamiek en hun interacties tijdens gedrag op macroscopisch en microscopisch niveau.

Evaluatie van een groot schedelvenster gemaakt met behulp van de PVDC-wikkelmethoden Direct na de operatie kan succes of falen in één oogopslag worden gecontroleerd aan de hand van de conditie van het corticale oppervlak, zoals bloedingen en kleurverandering als gevolg van schade of ischemie. Lange tijd na de operatie kan het corticale oppervlak bedekt zijn met een ondoorzichtig wit membraan als gevolg van een infectie, of bloed kan het venster bedekken als gevolg van bloedingen (figuur 2G). In deze gevallen is de cortex mogelijk niet in gezonde staat en is beeldvorming mogelijk niet mogelijk. Deze kunnen worden veroorzaakt door gedeeltelijk afgesneden wikkels of onvoldoende fixatie van de wikkel door de lijm. Als de infectie herhaaldelijk wordt waargenomen, kan het effectief zijn om antibiotica toe te passen, bijvoorbeeld gentamicinesulfaat (10 μL, 50 mg / ml), over het hersenoppervlak bij het plaatsen van het venster. Regeneratie van hersenvliezen of botten wordt ook gezien wanneer de verticale opening tussen het corticale oppervlak en de wrap groot is. Om dit te voorkomen, is het cruciaal om de wrap zo strak mogelijk op het hersenoppervlak aan te brengen tijdens de raamvoorbereiding. Dit kan worden bereikt door plasticfolie op het hersenoppervlak te plaatsen en zoveel mogelijk ACSF uit te zuigen. Bij afwezigheid van ACSF kan dit worden gedaan door simpelweg de plasticfolie op het hersenoppervlak te plaatsen. De hersenen en bloedvaten worden bepaald om onbeschadigd te zijn door het feit dat de kleur van de hersenen niet verkleurd is en bloedvaten niet worden doorgesneden.
De levensduur van het raam hangt grotendeels af van de kwaliteit van de operatie. Wanneer de toestand goed is, is er geen teken van infectie, bloeding of regeneratie meer dan 1 maand na de operatie (figuur 2F en figuur 3B). Bij 8 van de 10 muizen kon het venster tot 10 weken of langer helder worden gehouden. Ramen bij twee van de muizen konden niet goed worden onderhouden vanwege infectie of bloeding. Hoewel het grote raam gevoelig kan zijn voor mechanische stress of impact, werden gebroken of gebarsten ramen niet waargenomen.
Om de beeldkwaliteit van het nieuwe schedelvenster met de wrap, siliconen en glas te evalueren, werd de puntspreidingsfunctie onder het nieuwe venster vergeleken met die onder het conventionele glazen venster door fluorescerende kralen van 0,1 μm in agar af te beelden (zie aanvullend dossier 1). De resultaten toonden geen verschil in volledige breedte bij half maximum (FWHM) voor beide omstandigheden. [X-as (μm): alleen glas, 1,99 ± 0,07, wrap, 1,76 ± 0,13, Y-as (μm): alleen glas, 2,11 ± 0,27, wrap, 1,90 ± 0,15, Z-as (μm): alleen glas, 25,29 ± 0,71, wrap, 26,64 ± 1,02, N = 7 kralen, p > 0,05, de Mann-Whitney U-test, aanvullende figuur 2A, B]. Daarom verslechterden de nieuwe toegevoegde elementen (wrap en siliconen) de beeldkwaliteit niet.
Trillingsartefacten veroorzaakt door ademhaling, hartslag en lichaamsbeweging zijn aanwezig in wide-field en twee-fotonen beeldvorming. Om te bepalen hoeveel het nieuwe schedelvenster trilt, werd een klein fluorescerend deeltje geselecteerd uit de in vivo beeldvormingsgegevens met twee fotonen en onderzocht hoeveel het beeld gedurende 60 s bewoog. Er werd vastgesteld dat de standaarddeviatie van het centroïde van dat fluorescerende deeltje ongeveer 0,3 μm was, wat vergelijkbaar is met die onder een conventioneel glazen venster (aanvullende figuur 2C). Dit geeft aan dat omdat de hersenen werden vastgehouden door een transparante siliconenplug en afdekglas, de trillingen vergelijkbaar waren met die waargenomen in conventionele kleinere vensters, en offline beeldregistratie voldoende was om trillingsartefacten te elimineren.
Bij beeldvorming van calcium met een breed veld kon worden waargenomen dat de corticale activiteit zich over de cortex verspreidde, geïnduceerd door sensorische stimulatie (figuur 3A-D, K-N). Twee-fotonen beeldvorming maakte de observatie van eencellige fluorescentiebeelden mogelijk die specifiek zijn voor neuronen en gliacellen (figuur 3E, O). Fluorescentieveranderingen geïnduceerd door sensorische stimulatie konden worden waargenomen in individuele cellen (figuur 3E-J, O-T).
Expressie van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) in een groot gebied van de hersenschors met behulp van de PVDC-wrap en AAV De PVDC-wrap voor het venster kan worden toegepast om functionele eiwitten tot expressie te brengen in een groot deel van de cortex. Dit wordt bereikt met behulp van AAV en fibroïne, een componenteiwit van zijderupscocons die op grote schaal zijn toegepast als biomaterialen37. Een eerdere studie toonde aan dat fibroïne kon worden gemengd met AAV's, waarbij films werden gevormd die in de hersenen werden geïmplanteerd om functionele eiwitten zoals fotoactiveerbare opsins of GECI's36 tot expressie te brengen. In de huidige studie werden AAV-expressies van GECI en fibroïne gemengd en gedroogd op de wrap, en AAV-gecoate wrap werd gebruikt voor het schedelvenster. Dit resulteerde in de expressie van GECI over het brede gebied van de cortex 2-4 weken na de operatie (figuur 3K-M). Omdat het venster groot was, kunnen verschillende corticale gebieden van dezelfde muis in beeld worden gebracht (figuur 3M-T).
Om de expressie-efficiëntie van deze methode te bevestigen, werd het aantal cellen dat GECI tot expressie brengt geteld in de vaste hersenen (aanvullende figuur 2D). Het bleek dat de huidige strategie met behulp van de wrap met fibroin-AAV resulteerde in de expressie van GECI met een efficiëntie van ongeveer 20% in zowel oppervlakkige als diepere lagen (L2/3: 20,78%, XCaMP-R-expressiecel: 32 cellen, DAPI: 154 locaties, L5: 20,08%, XCaMP-R-expressiecel: 51 cellen, DAPI: 254 locaties). Deze methode drukte dus GECI's uit in cellen, niet alleen in oppervlaktelagen, maar ook in diepere lagen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig01.jpg"> Figuur 1: Conceptueel diagram van het grote schedelvenster. (A) Links, schematische tekening van het nieuwe schedelvenster. Het is groter dan het conventionele raam (3 mm diameter). Rechts, dwarsdoorsnedeweergave. De methode voor het maken van een groot schedelvenster maakt gebruik van voedselwikkel, transparant siliconenelastomeer en afdekglas, waardoor breedveld- en tweefotonenbeelden van dezelfde muis mogelijk zijn. (B) Cranial window fabrication procedure: (a) Botverwijdering. b) Verwijdering van ACSF onder de onmiddellijke verpakking. c) Hechting van de omhulling aan het hersenoppervlak door het verwijderen van ACSF. d) Het wegsnijden van de overtollige wrap. e) Het aanbrengen van transparante siliconen. f) Het aanbrengen van afdekglas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig02.jpg"> Figuur 2: Overzicht van schedelvensterchirurgie. (A) Materialen en apparatuur die nodig zijn voor het schedelvenster. a) Polyvinylideenchloride (PVDC) wikkelfolie. b) Een dispenser van transparant siliconenelastomeer met een mengpunt. c) Afdekglas. d) Transparante siliconen geplaatst tussen twee stukken van het afdekglas. (B) Foto van de huid van de muiskop die is ingesneden om de schedel bloot te leggen. De muis werd verdoofd en de kop van de muis werd geïmmobiliseerd met behulp van oorstaven. Het hoofd werd vervolgens onthaard, behandeld met lokale analgesie en de huid werd ingesneden. (C) Foto na installatie van een kopplaat. Een kopplaat (gemaakt van hars uit een 3D-printer) werd met tandcement aan de kop van de muis bevestigd. (D) Foto van een schedelraam. Het schedelvenster werd gecreëerd in de cortex van de rechterhersenhelft van de muis. De dura mater werd verwijderd en de wrap werd op zijn plaats gelijmd. (E) Een foto van het raam gemaakt van de wrap met de transparante siliconen en cover glas erop. (F) Een typisch voorbeeld van een succesvol venster (rechterhersenhelft, 7 weken na de operatie). (G) Voorbeeld van een mislukt venster (beide hemisferen, 5 weken na de operatie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig03.jpg"> Figuur 3: Het grote venster maakt wide-field en twee-foton calcium beeldvorming van dezelfde muis mogelijk. (A) Calcium beeldvorming werd uitgevoerd in een transgene muis die membraan-verankerde GECI (Lck-GCaMP6f) in astrocyten tot expressie brengt40. (B) Links werd een groot raam gemaakt met plasticfolie, transparante siliconen en afdekglas. Wide-field imaging werd uitgevoerd door dit venster. Rechts, een foto werd 79 dagen na de installatie van het schedelraam gemaakt. (C) Wanneer lucht-pufstimulatie werd toegepast op de contralaterale snorharen, werden fluorescentieveranderingen waargenomen. (D) Het tijdsverloop van de fluorescentieverandering in de somatosensorische cortex (rood vierkant in C) werd uitgezet. Rode en blauwe balken geven de timing van de luchtpuf en de timing "voor", "tijdens" en "na" in respectievelijk (C) aan. (E) Het gezichtsveld (FOV 1 in C) van calciumbeeldvorming met twee fotonen. Omdat GCaMP6f werd uitgedrukt om naar het membraan te lokaliseren, werden de interessante gebieden (witte vierkanten) handmatig geplaatst om de lokale respons in astrocytenprocessen te detecteren. (F) De fluorescentieveranderingen in de gekleurde vierkanten in (E) worden uitgezet. (G) De fluorescentieveranderingen in alle kwadraten van (E) worden uitgezet. Horizontale en verticale assen geven respectievelijk tijd en celnummer aan. (H-J) Gegevens voor FOV 2 (in de visuele cortex) in (C) worden getoond. De FOV 2 is in beeld gebracht na de beeldvorming in de FOV 1. (K) Rode GECI, XCaMP-R, werd uitgedrukt in neuronen door de fibroine-AAV-methode in de wild-type muis. (L) Foto gemaakt twee weken na de operatie waarbij het venster werd gemaakt met behulp van de fibroïnefilm. (M) Wide-field calcium imaging werd uitgevoerd op deze muis. (N) De fluorescentieverandering die wordt opgeroepen door snorharstimulatie werd uitgezet vanaf de meest prominente plaats (somatosensorische cortex, rood vierkant in (M)). Rode en blauwe lijnen geven de timing van luchtpuf en "voor" en "tijdens" timing in respectievelijk (M) aan. (O) Gezichtsveld (somatosensorische cortex, FOV 1 in (M)) van calciumbeeldvorming met twee fotonen op 300 μm diepte. ROIs werden handmatig geplaatst bij neuronale somata. (P) De fluorescentieveranderingen in de gekleurde vierkanten in (O) worden uitgezet. (Q) De fluorescentieveranderingen in alle vierkanten van (O) zijn uitgezet in kleur. (R-T) Gegevens voor FOV 2 in (M) in de pariëtale cortex worden getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Tips voor scalpels. De punt van het nieuwe scalpel (boven) in vergelijking met het scalpel werd gebruikt om de schedel te snijden met een stompe punt (onderkant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Validatie van het nieuwe schedelvenster en de fibroïne-AAV-expressiemethode. (A) Fluorescentie-intensiteitsprofiel van de fluorescerende kralen van 0,1 μm in agar. De bovenste rij toont gegevens van een toestand waarin alleen afdekglas werd geplaatst over fluorescerende kralen gemengd in agar, en de onderste rij toont gegevens van een toestand waarin wrap, transparante siliconen en coverglas werden geplaatst. De grijze sporen tonen de Gauss die passen bij het fluorescentie-intensiteitsprofiel voor elke kraal, en de rode sporen tonen hun gemiddelde waarden (n = 7). (B) Samenvatting van de gegevens onder A). Elke grafiek toont de volledige breedte op half maximum (FWHM) van de puntspreidingsfunctie op de XYZ-as. De grijze plot toont de gegevens voor elke kraal en het rood toont hun gemiddelde en standaardfout. (C) Uit de 2.000 frames (60 s opname) van in vivo beeldvormingsgegevens werd een klein fluorescerend deeltje geselecteerd en onderzocht hoeveel het beeld bewoog gedurende de 60 s. Het fluorescerende beeld in het midden vertegenwoordigt het gemiddelde van 2.000 frames. De beelden werden geprojecteerd door middeling in de X- en Y-asrichtingen. De histogrammen tonen de verdeling van het centroïde in elk frame. De standaarddeviaties van het centroïde waren X: 0,36 en Y: 0,315 μm. (D) Voorbeeld van GECI-expressie volgens de fibroine-AAV-methode. Links: Een stukje hersenschors paste de fibroïne-AAV-expressiemethode toe. Rood en blauw duiden op fluorescentie van respectievelijk XCaMP-R en DAPI; XCaMP-R kwam niet alleen tot expressie in laag 2/3 cellen, maar ook in laag 5 cellen. Midden en rechts. Vergrote weergaven van de lagen 2/3 en 5 in de linkerfiguur (cyaanvierkanten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 1: (A) Expressie-efficiëntie van de wrap met de fibroin-AAV-filmmethode en (B) Evaluatie van de puntspreidingsfunctie tijdens beeldvorming met twee fotonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20File%201_FINAL.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Dit protocol toont een creatie van een groot schedelvenster om wide-field en single-cell reserveringsactiviteiten in dezelfde muis te meten. Met behulp van onze methode kan een groot en stabiel schedelvenster worden gemaakt met voedselwikkel tegen lage kosten. Deze methode is effectief om de neurale en gliale activiteiten tijdens gedrag op macroscopisch en microscopisch niveau te bestuderen.Het wordt aanbevolen om te beginnen met een klein schedelvenster. Als het vervolgens lukt, vergroot u de grootte van het venster. Begin met het verwijderen van het extra cement over de schedel met een tandboor.Markeer het gebied dat met een pen moet worden gesneden. Snijd in het bot met behulp van een scalpel met een stompe punt om ervoor te zorgen dat de punt niet in de schedel dringt. Schraap het bot herhaaldelijk met een scalpel om de groef te verdiepen totdat het bot in het te trimmen gebied beweegt wanneer het licht wordt aangeraakt.Verwijder het ingesneden bot met een fijn pincet. Wees voorzichtig om de botflap niet in de hersenen te duwen, wat de hersenen kan beschadigen. Om de dura mater te verwijderen, snijdt u de dura met een getrokken glazen pipet met een taps toelopende punt van ongeveer 10 micrometer.Gebruik een U-vormige naald om deze snede over het hele venster uit te breiden. Onder een stereomicroscoop ingesteld op 60 tot 100x zoom, verwijder de afgehakte dura mater met ultrafijn pincet. In geval van bloeding, spoelen met aCSF of gebruik een gelatinespons om het bloeden te stoppen.Steriliseer vervolgens een groot stuk PVDC-wrap door autoclaveren en met 70% ethanol. Gebruik onder een stereomicroscoop een pincet en een scalpel om een wikkel van de vereiste grootte uit te snijden. Plaats de wrap op het hersenoppervlak terwijl u de aCSF op het oppervlak laat liggen.Zuig de aCSF uit vanaf de rand van de wrap, zodat de wrap stevig aan het hersenoppervlak blijft plakken. Knip de wrap af met een scalpel en pincet zodat er ongeveer een millimeter marge is tussen de rand van het schedelvenster en de wrap. Zodra de wrap op zijn plaats zit, lijm je de rand van de wrap op de schedel met een biologische lijm.Laat de lijm ongeveer 30 minuten drogen. Breng met behulp van een dispenser met een mengpunt een transparant siliconenelastomeer aan op de wrap. Plaats het afdekglas van 0,12 tot 0,17 millimeter erop.Sluit de omtrek van het afdekglas af met waterdichte film, secondelijm of tandcement. Meng eerst fibroïne en AAV-oplossingen in een verhouding van één tot vier in een kleine monsterbuis. Laat een aliquot van de oplossing op de plasticfolie voor het schedelvenster vallen en droog deze minstens drie uur.Bevestig vervolgens de wrap aan het hersenoppervlak zoals weergegeven in de vorige sectie. Controleer de toestand van de muizen en ramen regelmatig, twee tot vier weken. Tegen die tijd zullen de genetisch gecodeerde calciumindicatoren voldoende tot expressie komen na het creëren van het met AAV behandelde venster.Met behulp van dit protocol konden schedelvensters bij acht van de 10 muizen gedurende maximaal 10 weken worden gehandhaafd. Een breed venster wordt gemaakt met plasticfolie, transparante siliconen en afdekglas in een transgene muis die membraanverankerde genetisch gecodeerde calciumindicator in astrocyten tot expressie brengt. Wide-field calcium beeldvorming werd uitgevoerd door dit venster en fluorescentieveranderingen werden waargenomen wanneer luchtpufstimulatie werd toegepast op de contralaterale snorharen.Het tijdsverloop van de fluorescentieverandering in de somatosensorische cortex vertoonde corticale activiteit. Twee-fotonen beeldvorming maakte de observatie van eencellige fluorescentiebeelden mogelijk die specifiek zijn voor gliacellen. Fluorescentieveranderingen geïnduceerd door sensorische stimulatie werden waargenomen in individuele cellen uit verschillende corticale regio's.Wrap gecodeerd met AAV die genetisch gecodeerde calciumindicator tot expressie brengt; en fibroïne werd gebruikt voor het maken van het schedelvenster. Wide-field calcium beeldvorming toonde corticale activiteit die zich verspreidde over de cortex geïnduceerd door sensorische stimulatie twee tot vier weken na de operatie. Omdat het venster groot was, werden verschillende corticale gebieden van dezelfde muis in beeld gebracht en fluorescentieveranderingen geïnduceerd door sensorische stimulatie werden waargenomen in individuele cellen.Het is belangrijk om schade aan de hersenen te voorkomen bij het maken van een schedelvenster. Men kan gedragstaken uitvoeren op muizen met een groot schedelvenster. Dit maakt het mogelijk om de relatie tussen neurale activiteit en muisgedrag te onderzoeken.Deze methode kan worden toegepast op verschillende neurowetenschappelijke studies. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om corticale activiteit te observeren tijdens besluitvormingstaken, motorisch rennen en in massamodellen van hersenletsel en ziekte.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Een grote laterale kraniotomie procedure voor mesoscale breedbeeld optische beeldvorming van hersenactiviteit

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...