Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

इस कार्य को परिवर्तनकारी अनुसंधान क्षेत्रों (ए) 'ग्लियल डिकोडिंग' (जेपी 21एच05621 से एसएम), जेएसपीएस केकेन्ही (जेपी19के06883 से एसएम, 15के0340 से ईएस, जेपी22एच00432, जेपी22एच05160, जेपी17एच06312 से एचबी तक) और जेपी17एच06312 द्वारा सहायता अनुदान (जेपी17एच06313) द्वारा समर्थित किया गया था। यामानाशी प्रान्त (एसएम के लिए), और टाकेडा साइंस फाउंडेशन (एसएम के लिए) से युवा शोधकर्ता के लिए अनुदान और आंशिक रूप से यूनिवर्सिटी यामानाशी से फ्रंटियर ब्रेन रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित।
यागुची और के ओकाजाकी को पशु देखभाल और तकनीकी सहायता के लिए और उपयोगी चर्चाओं के लिए कितामुरा प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

यह लेख पीवीडीसी प्लास्टिक रैप, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास का उपयोग करके एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने की एक सस्ती विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग की जा सकती है। दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग एक ही माउस में कई अलग-अलग कॉर्टिकल क्षेत्रों से किया जा सकता है जो वाइड-फील्ड इमेजिंग से गुजरा है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि खिड़की के लिए उपयोग की जाने वाली प्लास्टिक की चादर पर एक फाइब्रोइन-एएवी फिल्म कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र पर जीईसीआई को व्यक्त कर सकती है।
महत्वपूर्ण कदम प्लास्टिक रैप का उपयोग करके कपाल खिड़कियां बनाते समय संक्रमण और मस्तिष्क को नुकसान से बचना महत्वपूर्ण है। इन स्थितियों में, तंत्रिका और ग्लियल गतिविधि नहीं देखी जा सकती है, और गहरे क्षेत्रों की इमेजिंग असंभव है। रक्त वाहिकाओं को चोट लगने से रक्तस्राव भी होता है, जिससे रक्त के कारण इमेजिंग असंभव हो जाती है। संक्रमण से बचने के लिए, मस्तिष्क की सतह और लपेट को यथासंभव कसकर संलग्न करना एसीएसएफ को चूसकर महत्वपूर्ण है। सर्जरी के दौरान मस्तिष्क के दबाव को रोककर मस्तिष्क और रक्त वाहिका क्षति से बचने के लिए मैनिटोल प्रशासन महत्वपूर्ण है। यह मस्तिष्क की सतह और ड्यूरा मेटर के बीच की जगह को बनाए रखता है और खोपड़ी और ड्यूरा मैटर को हटाने के दौरान मस्तिष्क और रक्त वाहिकाओं को छूने से रोकता है। उच्च आवर्धन के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और तेज युक्तियों के साथ चिमटी भी सटीक सर्जरी के लिए प्रभावी हैं।
फाइब्रोइन-एएवी विधि में, मांस रेशम कीट कोकून का उपयोग करना आवश्यक है, फाइब्रोइन समाधान को फ्रीज करने के लिए नहीं, फाइब्रोइन-एएवी समाधान को पर्याप्त रूप से सुखाने के लिए, और समाधान की पर्याप्त मात्रा (5 μL प्रति 3 मिमी व्यास) लागू करने के लिए। जब पुराने कोकून का उपयोग किया गया था, तो अभिव्यक्ति दक्षता कम थी। ऐसा इसलिए है क्योंकि पुराने कोकून से फाइब्रोइन आसानी से विकृत हो सकता है। जब फाइब्रोइन समाधान -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे और उपयोग के समय पिघल गए थे, तो अभिव्यक्ति दक्षता खराब थी। यह ठंड और पिघलने के कारण प्रोटीन के विकृतीकरण के कारण हो सकता है। चूंकि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत फाइब्रोइन समाधानों को गेलेशन तक प्रभावी ढंग से उपयोग किया जा सकता है, इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि फाइब्रोइन समाधानों को प्रशीतित रखा जाए और गेलेशन के बाद फिर से कोकून से शुद्ध किया जाए। फाइब्रोइन-एएवी समाधान को कम से कम 3 घंटे के लिए सुखाया जाना चाहिए, क्योंकि अभिव्यक्ति 3 घंटे से कम समय के बाद खराब है। अंत में, अभिव्यक्ति का क्षेत्र उपयोग किए गए फाइब्रोइन-एएवी समाधान की मात्रा पर निर्भर करता है। चित्रा 3 एम में उदाहरण में, राशि छोटी थी (5 μL); इस प्रकार, फाइब्रोइन-एएवी फिल्म ने केवल खिड़की के ऊपरी आधे हिस्से को कवर किया, जिसके परिणामस्वरूप खिड़की पर गैर-समान अभिव्यक्ति हुई। यदि पर्याप्त मात्रा में फाइब्रोइन-एएवी का उपयोग किया जाता है, तो अभिव्यक्ति पूरी खिड़की पर समान होगी।
तकनीक के संशोधन उपन्यास कपाल खिड़की तकनीक कॉर्टिकल सर्किट की मैक्रोस्कोपिक गतिविधि और एक ही माउस में उनकी अंतर्निहित एकल-कोशिका-स्तर की गतिविधि की जांच करने की अनुमति देती है। इस प्रकार, विधि को विभिन्न प्रकार के तंत्रिका विज्ञान अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग निर्णय लेने के कार्यों, मोटर सीखने और मस्तिष्क की चोट और बीमारी के माउस मॉडल के दौरान कॉर्टिकल गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हम यह भी मानते हैं कि विधि को न केवल कृन्तकों पर बल्कि गैर-मानव प्राइमेट्स पर भी लागू किया जा सकता है।
यह पेपर दर्शाता है कि बड़ी कपाल खिड़की ट्रांसजेनिक चूहों और चूहों को कार्यात्मक प्रोटीन व्यक्त करने वाले एएवी के साथ इंजेक्ट किए गए इमेजिंग के लिए प्रभावी है। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि रैप पर फाइब्रोइन-एएवी फिल्म कॉर्टेक्स के विस्तृत क्षेत्र में जीईसीआई को व्यक्त करने के लिए पारंपरिक एएवी इंजेक्शन विधि की तुलना में बहुत आसान है। विभिन्न रंगों41 के जीईसीआई को एन्कोडिंग करने वाले दो एएवी के मिश्रण का उपयोग करके, न्यूरॉन और ग्लियल सेल गतिविधि के बीच सहसंबंध को कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में एक साथ चित्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, फाइब्रोइन-एएवी फिल्म विधि को अन्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर42,43,44,45,46,47 पर भी लागू किया जा सकता है।
बड़ी कपाल खिड़की, जो दोनों गोलार्धों की छवि बना सकती है, भी संभव है। दृश्य के बहुत व्यापक क्षेत्र (~ 25मिमी 2) के साथ दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप हाल ही में 25,26,27,28,29 विकसित किए गए हैं। यहां वर्णित विस्तृत कपाल विंडो का उपयोग करके एक-फोटॉन वाइड-फील्ड इमेजिंग के साथ इस दो-फोटॉन इमेजिंग तकनीक को संयोजित करने से हमें अभूतपूर्व पैमाने से जनसंख्या गतिविधि और एकल-कोशिका गतिविधि के बीच संबंधों की जांच करने की अनुमति मिलेगी।
सीमाओं खाद्य लपेटने से किसी भी पदार्थ को गुजरने की अनुमति नहीं मिलती है। इससे औषधीय प्रयोगों के लिए विधि का उपयोग करना मुश्किल हो जाता है। रैप को हटाना भी मुश्किल है, जिससे ग्लास पिपेट या इलेक्ट्रोड डालना असंभव हो जाता है। इसलिए, अन्य तरीकों जैसे एक साथ कैल्शियम इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, और ग्लास पिपेट का उपयोग करके दवाओं के स्थानीय प्रशासन के साथ संयुक्त प्रयोगों को लागू करना कठिन है। इन सीमाओं के लिए एक संभावित समाधान एक छेद के साथ रैप और ग्लास विंडो का उपयोग करना है। यह कपाल खिड़की को लंबे समय तक बाँझ रखते हुए ग्लास पिपेट या रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से मस्तिष्क तक पहुंच की अनुमतिदेता है।

वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग प्रभावी रूप से पशु मस्तिष्क 1,2,3 के एक बड़े क्षेत्र में स्थानिक गतिविधि पैटर्न की जांच करता है। कृन्तकों की पूरी कॉर्टिकल सतह का निरीक्षण करने के लिए वाइड-फील्ड इमेजिंग का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है क्योंकि उनका कॉर्टेक्स अपेक्षाकृत सपाट 2,3,4,5,6,7,8,9,10 है। ट्रांसजेनिक चूहों या चूहों को एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) के साथ इंजेक्ट किया जाता है, जो विशेष रूप से न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं जैसे विभिन्न कोशिकाओं में जीईसीआई को व्यक्त करते हैं, का उपयोग वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग 11,12,13 के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक का स्थानिक संकल्प आमतौर पर विवो14 में व्यक्तिगत कोशिकाओं की गतिविधि को हल करने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह गहरी परतों में स्थित इमेजिंग कोशिकाओं के लिए भी उपयुक्त नहीं है।
दूसरी ओर, दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग उपकोशिकीय स्थानिक संकल्प के साथ एक साथ कई कोशिकाओं की गतिविधि का निरीक्षण कर सकती है, जिससे न्यूरोनल डेंड्राइट और ग्लियल प्रक्रियाओं 15,16,17,18,19,20,21,22 में भी व्यक्तिगत कोशिकाओं की गतिविधि का अवलोकन किया जा सकता है। यह सेरेब्रल कॉर्टेक्स23,24 की गहरी परतों में कोशिकाओं का भी निरीक्षण कर सकता है। यद्यपि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी में हालिया तकनीकी प्रगति मिलीमीटर-वाइड कॉर्टिकलक्षेत्रों 25,26,27,28,29 से इमेजिंग को सक्षम करती है, फिर भी दो-फोटॉन इमेजिंग द्वारा वाइड-फील्ड इमेजिंग के बराबर क्षेत्र का निरीक्षण करना मुश्किल है।
एकल-कोशिका से पूरे मस्तिष्क तक मस्तिष्क गतिविधि की शारीरिक प्रासंगिकता को समझने के लिए, पूरे कॉर्टेक्स पर कॉर्टिकल क्षेत्रों की गतिविधि और स्थानीय तंत्रिका सर्किट में एकल-कोशिका संकल्प के बीच की खाई को पाटना महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक ही माउस में किए गए वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग का संयोजन विशेष रूप से प्रभावी है। इसे महसूस करने के लिए, एक विस्तृत और स्थिर कपाल खिड़की बनाई जानी चाहिए, आदर्श रूप से लंबी अवधि में।
इससे पहले, कपाल खिड़कियां बनाने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है ताकि वाइड-फील्ड और टू-फोटॉन इमेजिंग को एक ही माउस30,31 में किया जा सके। ट्रेपोज़ॉइडल के आकार की कवर ग्लास खिड़कियां (क्रिस्टल खोपड़ी), जिन्हें हटाई गई हड्डी को बदलने के लिए कॉर्टिकल सतह के आकार में ढाला जाता है, पूरे कॉर्टेक्स32 पर ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट (पीईटी) 33 या पॉलीथीन-ऑक्साइड-लेपित अनाकार फ्लोरोपॉलिमर नैनोशीट34 के साथ बहुलक आधारित कपाल खिड़कियां बनाई जा सकती हैं। प्रत्येक विधि को 1 महीने से अधिक समय तक एक स्थिर खिड़की बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इन खिड़कियों का उत्पादन करना आसान नहीं है, और उपयोग की जाने वाली सामग्री और उपकरण अक्सर महंगे होते हैं।
वर्तमान अध्ययन पीवीडीसी फिल्म (प्लास्टिक फूड रैप) (चित्रा 1) का उपयोग करके एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है। इस विंडो का उपयोग करके, विवो वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन इमेजिंग प्रयोगों को एक ही चूहों में किया जा सकता है। यह भी दिखाया गया है कि जीईसीआई को चूहों के कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जा सकता है, जिससे रैप पर एएवी कणों वाली फिल्म की एक पतली परत बन जाती है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

माउस के नियोकॉर्टेक्स से वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग विभिन्न मस्तिष्क कार्यों से संबंधित कॉर्टेक्स-वाइड तंत्रिका गतिविधि का निरीक्षण करने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, दो-फोटॉन इमेजिंग एकल-कोशिका स्तर पर स्थानीय तंत्रिका सर्किट की गतिविधि को हल कर सकती है। एक ही माउस में दोनों इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके कई पैमाने पर विश्लेषण करने के लिए एक बड़ी कपाल खिड़की बनाना महत्वपूर्ण है। इसे प्राप्त करने के लिए, किसी को खोपड़ी के एक बड़े हिस्से को हटाना होगा और पारदर्शी सामग्री के साथ उजागर कॉर्टिकल सतह को कवर करना होगा। इससे पहले, इस उद्देश्य के लिए कांच की खोपड़ी और बहुलक-आधारित कपाल खिड़कियां विकसित की गई हैं, लेकिन ये सामग्री आसानी से निर्मित नहीं होती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीविनाइलिडेन क्लोराइड (पीवीडीसी) रैपिंग फिल्म, एक पारदर्शी सिलिकॉन प्लग और एक कवर ग्लास से युक्त एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है। पूरे गोलार्ध की पृष्ठीय सतह की इमेजिंग के लिए, खिड़की का आकार लगभग 6 x 3 मिमी2 था। इतनी बड़ी खिड़की की परवाह किए बिना गंभीर मस्तिष्क कंपन नहीं देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, मस्तिष्क की सतह की स्थिति एक महीने से अधिक समय तक खराब नहीं हुई। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई), जीसीएएमपी 6 एफ को व्यक्त करने वाले माउस की वाइड-फील्ड इमेजिंग, विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स में, कुछ मिलीमीटर में सिंक्रनाइज़ प्रतिक्रियाओं का पता चला। एक ही माउस के दो-फोटॉन इमेजिंग ने कई सेकंड में व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स में प्रमुख कैल्शियम प्रतिक्रियाएं दिखाईं। इसके अलावा, एक एडेनो से जुड़े वायरस की एक पतली परत पीवीडीसी फिल्म पर लागू की गई थी और कपाल खिड़की पर कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में जीईसीआई को सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था। यह तकनीक एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने के लिए विश्वसनीय और लागत प्रभावी है और मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्म स्तरों पर व्यवहार के दौरान तंत्रिका और ग्लियल गतिशीलता और उनकी बातचीत की जांच की सुविधा प्रदान करती है।

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In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

वर्तमान प्रोटोकॉल खाद्य लपेट, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास का उपयोग करके एक बड़ी (6 x 3 मिमी2) कपाल खिड़की बनाने का वर्णन करता है। यह कपाल विंडो एक ही माउस में विवो वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों में अनुमति देती है।

Vivo में एक बड़ी कपाल विंडो का उपयोग करके माउस से वाइड-फील्ड और टू-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

यह प्रोटोकॉल एक ही माउस में वाइड-फील्ड और सिंगल-सेल आरक्षण गतिविधियों को मापने के लिए बड़ी कपाल विंडो का निर्माण दिखाता है। हमारी विधि का उपयोग करके, कम लागत पर भोजन की चादर के साथ बड़ी और स्थिर कपाल खिड़की बनाई जा सकती है। यह विधि मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्म स्तरों पर व्यवहार के दौरान तंत्रिका और ग्लियल गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए प्रभावी है।एक छोटी कपाल खिड़की से शुरू करने की सिफारिश की जाती है। फिर यदि यह सफल होता है, तो खिड़की का आकार बढ़ाएं। दंत ड्रिल के साथ खोपड़ी पर अतिरिक्त सीमेंट को हटाकर शुरू करें।पेन से काटे जाने वाले क्षेत्र को चिह्नित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि नोक खोपड़ी में प्रवेश नहीं करती है, यह सुनिश्चित करने के लिए एक कुंद टिप के साथ स्केलपेल का उपयोग करके हड्डी में काट लें। नाली को गहरा करने के लिए स्केलपेल के साथ हड्डी को बार-बार खुरचें जब तक कि हल्के से छूने पर उस क्षेत्र में हड्डी हिल न जाए।बारीक चिमटी के साथ संक्रमित हड्डी को हटा दें। हड्डी के फ्लैप को मस्तिष्क में धक्का न देने के लिए सतर्क रहें जो मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है। ड्यूरा मेटर को हटाने के लिए, लगभग 10 माइक्रोमीटर की पतली नोक के साथ खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करके ड्यूरा को काटें।पूरी खिड़की पर इस कट का विस्तार करने के लिए यू-आकार की सुई का उपयोग करें। 60 से 100 x ज़ूम पर सेट स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, अल्ट्रा फाइन ट्वीज़र्स के साथ कटे हुए ड्यूरा मैटर को हटा दें। रक्तस्राव के मामले में, एसीएसएफ के साथ कुल्ला करें या रक्तस्राव को रोकने के लिए जिलेटिन स्पंज का उपयोग करें।फिर, ऑटोक्लेविंग द्वारा और 70% इथेनॉल के साथ पीवीडीसी रैप के एक बड़े टुकड़े को निष्फल करें। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, आवश्यक आकार की लपेट को काटने के लिए चिमटी और एक स्केलपेल का उपयोग करें। सतह पर एसीएसएफ छोड़ते समय मस्तिष्क की सतह पर लपेटें।रैप के किनारे से एसीएसएफ को चूसें, जिससे रैप मस्तिष्क की सतह पर मजबूती से चिपक जाए। रैप को स्केलपेल और चिमटी के साथ ट्रिम करें जैसे कि कपाल खिड़की के किनारे और रैप के बीच लगभग एक मिलीमीटर मार्जिन हो। एक बार जब लपेट पूरी हो जाती है, तो लपेट के किनारे को जैविक चिपकने वाले के साथ खोपड़ी पर गोंद करें।चिपकने वाले को लगभग 30 मिनट तक सूखने दें। मिक्सिंग टिप के साथ डिस्पेंसर का उपयोग करके, रैप के शीर्ष पर एक पारदर्शी सिलिकॉन इलास्टोमर लागू करें। शीर्ष पर 0.12 से 0.17 मिलीमीटर मोटाई का कवर ग्लास रखें।कवर ग्लास की परिधि को वाटरप्रूफ फिल्म, सुपरग्लू या डेंटल सीमेंट के साथ सील करें। सबसे पहले, एक छोटे से नमूना ट्यूब में एक से चार अनुपात में फाइब्रोइन और एएवी समाधान मिलाएं। कपाल खिड़की के लिए प्लास्टिक की चादर पर घोल का एक एलिकोट गिराएं और इसे कम से कम तीन घंटे तक सुखाएं।फिर रैप को मस्तिष्क की सतह से संलग्न करें जैसा कि पिछले खंड में दिखाया गया है। चूहों और खिड़कियों की स्थिति की नियमित रूप से जांच करें, दो से चार सप्ताह। इस समय तक, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक एएवी-उपचारित विंडो बनाने के बाद पर्याप्त रूप से व्यक्त किए जाएंगे।इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, 10 चूहों में से आठ में 10 सप्ताह तक कपाल खिड़कियों को बनाए रखा जा सकता है। एस्ट्रोसाइट्स में झिल्ली-लंगर आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक माउस में प्लास्टिक रैप, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास के साथ एक विस्तृत खिड़की बनाई गई है। इस विंडो के माध्यम से वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग की गई थी और प्रतिदीप्ति परिवर्तन देखा गया था जब एयर पफ उत्तेजना को विपरीत मूंछों पर लागू किया गया था।सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स में प्रतिदीप्ति परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम ने कॉर्टिकल गतिविधि दिखाई। दो-फोटॉन इमेजिंग ने ग्लियल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एकल सेल फ्लोरेसेंस छवियों के अवलोकन की अनुमति दी। संवेदी उत्तेजना से प्रेरित प्रतिदीप्ति परिवर्तन विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों से व्यक्तिगत कोशिकाओं में देखे गए थे।आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक व्यक्त करने वाले एएवी के साथ रैप कोडित; और फाइब्रोइन का उपयोग कपाल खिड़की बनाने के लिए किया गया था। वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग ने सर्जरी के दो से चार सप्ताह बाद संवेदी उत्तेजना से प्रेरित कॉर्टेक्स में कॉर्टिकल गतिविधि का प्रसार दिखाया। चूंकि खिड़की बड़ी थी, इसलिए एक ही माउस के विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों को चित्रित किया गया था और संवेदी उत्तेजना से प्रेरित प्रतिदीप्ति परिवर्तन व्यक्तिगत कोशिकाओं में देखे गए थे।कपाल खिड़की बनाते समय मस्तिष्क को नुकसान से बचना महत्वपूर्ण है। एक बड़ी कपाल खिड़की के साथ चूहों पर व्यवहार कार्य कर सकते हैं। यह तंत्रिका गतिविधि और माउस व्यवहार के बीच संबंधों की जांच करने की अनुमति देगा।इस विधि को विभिन्न प्रकार के तंत्रिका विज्ञान अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग निर्णय लेने के कार्यों, मोटर चलाने और मस्तिष्क की चोट और बीमारी के बड़े पैमाने पर मॉडल के दौरान कॉर्टिकल गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

जीर्ण दो photon के लिए एक पतली खोपड़ी विंडो तकनीक Vivo में Murine microglia Neuroinflammation के मॉडल में इमेजिंग

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

माउस रीढ़ की हड्डी दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग गर्भनाल के vivo इमेजिंग में

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

दो photon<em&gt; में विवो</em&gt; एक पतला खोपड़ी तैयारी का उपयोग माउस प्रांतस्था में वृक्ष के समान spines के इमेजिंग

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

मस्तिष्क गतिविधि के मेसोस्केल वाइड-फील्ड ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए एक बड़े पार्श्व क्रैनीओटमी प्रक्रिया

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉनल Dendrites में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा में कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग का उपयोग करके एक दो-फोटॉन लेज़र और उसके मूल्यांकन का उपयोग करके एक न्यूरॉन जनसंख्या का पृथक

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

माउस रेटिना के विवो इमेजिंग में ट्रांसप्युपिलरी टू-फोटॉन

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

वीवो में माउस अवर जैतून में कैल्शियम इमेजिंग

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

जागते चूहों में वीवो इमेजिंग में दोहराया के लिए एक कपाल खिड़की का आरोपण

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Vivo में माउस हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया की क्रोनिक टू-फोटॉन इमेजिंग

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...