Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 til SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 til SM, 15KK0340 til ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 til HB, og JP17H06313 til KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain / MINDS) (JP19dm0207079h0002 til SM, JP19dm0207079 til HB, og JP19dm0207080 til KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (til SM), Grant for Young Researcher fra Yamanashi Prefecture (til SM), og Takeda Science Foundation (til SM) og delvis støttet av The Frontier Brain Research Grant fra Univ. Yamanashi.
Vi takker N. Yaguchi og K. Okazaki for dyrepleie og teknisk assistanse og medlemmer av Kitamura-laboratoriet for nyttige diskusjoner.

De eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av Animal Experiment Committee ved University of Yamanashi. Villtype (C57BL/6J, Japan SLC) og transgene mus som uttrykker membranforankret GECI (Lck-GCaMP6f) i astrocytter ble brukt i denne studien. De transgene musene ble oppnådd ved å krysse AldH1l1-CreERT2-mus [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, kommersielt oppnådd, se Materialtabell] og Flx-Lck-GCaMP6f-mus [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-GCaMP6f)Khak>/J, kommersielt innhentede] mus. De transgene musene ble behandlet med tamoxifen (20 mg / ml) i 5 dager (0,05 ml / 10 g kroppsvekt, i.p.) for å uttrykke GCaMP6f. Alle musene som ble brukt var hanner og hunner som var minst 4 uker gamle. Vinduets skjema er vist i figur 1A, og den kirurgiske prosedyren er oppsummert i figur 1B.
1. Forberedelse for kranial vindu kirurgi
<ol><li>Bedøv mus med isofluran (induksjon: 3%, kirurgi: 1% -1,5%, strømningshastighet: 0,2-0,3 l / min). Bekreft dybden av anestesi ved tap av hale- eller tåklyperefleks. Oppretthold kroppstemperaturen med en varmepute (36-38 °C). Påfør øyesalve med en bomullspinne for å forhindre at musens øyne tørker ut under anestesi.</li>
	<li>Injiser 15% mannitol oppløsning (se tabell over materialer) intraperitonealt (3 ml / 100 g kroppsvekt). Fest musens hode på en stereotaksisk ramme med ørestenger. Fjern hår fra musens hode ved hjelp av barbermaskin og hårfjerningskrem.</li>
	<li>Desinfiser hudoverflaten med povidon-jod og alkohol tre ganger. Påfør Lidokain lokalt for å gi forebyggende analgesi. Fjern huden over interesseområdet med kirurgisk saks og utsett skallen (størrelse: 15 x 15 mm). Hvis blødning er tilstede, bruk en bomullspinne for å stoppe blødningen. MERK: I denne studien ble huden fjernet for å observere prefrontal cortex til den visuelle cortex.</li>
	<li>Fjern periosteum over den eksponerte skallen ved hjelp av en mikro curette og tørk skalleoverflaten for å feste hodeplaten fast til skallen med dental sement (se Materialtabell) (figur 2B). MERK: Den skreddersydde hodeplaten er opprettet ved hjelp av en 3D-skriver. Designfilen deponeres i Github-repositoriet (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).</li>
	<li>Fest hodeplaten med dental sement (figur 2C). Vent minst 20 min til sementen stivner. Fest hodeplaten med hodeplateholderen35.</li>
</ol>2. Å lage kranialvinduet
<ol><li>Fjern den ekstra sementen over skallen med et tannbor (se Materialtabell). Vær forsiktig så du ikke borer gjennom beinet og skader hjernen ved å bore.</li>
	<li>Merk området som skal kuttes med en penn og kuttes inn i beinet med en skalpell. Stump tuppen av skalpellen for å sikre at spissen ikke trenger inn i skallen (supplerende figur 1). Henvis til hjerneatlaset for å bestemme hvor du skal lage vinduet. MERK: For denne studien ble det opprettet et vindu mellom -2 mm og +4 mm fra bregma i anteroposterioraksen og fra sagittal sutur til +3 mm i den mediolaterale aksen, inkludert motor-, somatosensoriske og visuelle cortices.</li>
	<li>Skrap beinet gjentatte ganger med en skalpell for å utdype sporet til beinet i området som skal trimmes, beveger seg godt når det berøres lett.</li>
	<li>Fjern det innskårne beinet med fin pinsett. Ikke skyv benlappen inn i hjernen, noe som kan skade hjernen (figur 1Ba). MERK: Hvis blødning observeres etter fjerning av beinet, må du umiddelbart påføre og aspirere kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, se materialtabell) og gjenta denne prosessen til blødningen stopper. Alternativt kan du plassere en hemostatisk gelatinsvamp (ca. 3 mm firkantede kuber) gjennomvåt i ACSF på blødningspunktet.</li>
	<li>Hvis dura ikke fjernes, fortsett til trinn 2.7.</li>
	<li>Fjern dura materen ved å følge trinnene nedenfor.<ol><li>Fjern dura, for eksempel i følgende situasjoner; transfeksjon ved hjelp av fibroin-AAV-filmmetode36 og observere små strukturer som dendritiske spines.</li>
		<li>Klipp duraen med en trukket glasspipette med en konisk spiss på ca. 10 μm. For å utvide dette kuttet over hele vinduet, bruk en U-formet nål.</li>
		<li>Sett stereomikroskopzoomen til 60-100x og fjern den avskårne dura materen med ultrafin pinsett. Hvis fjerning av dura mater forårsaker blødning, skyll med ACSF eller bruk en gelatinsvamp for å stoppe blødningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Klipp ut PVDC-innpakningen.<ol><li>Steriliser et stort (for eksempel 10 x 15 mm) stykke PVDC-innpakning (ca. 11 μm, se materialtabell, figur 2Aa) ved autoklavering og med 70% etanol.</li>
		<li>Under et stereomikroskop, bruk pinsett og en skalpell for å kutte ut en wrap av ønsket størrelse. MERK: Innpakningsstørrelsen må være omtrent 10 mm større enn størrelsen på kranialvinduet, men mindre enn åpningen på hodeplaten. For et 6 x 3 mm 2 kranialt vindu, lag en 15 x 10 mm2 wrap.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasser innpakningen nøyaktig ved å følge trinnene nedenfor.<ol><li>Plasser omslaget på hjerneoverflaten, og la ACSF ligge på overflaten. Sug ut ACSF fra kanten av pakningen, slik at innpakningen fester seg godt til hjerneoverflaten (figur 1Bb, c). MERK: Innpakningen som brukes er rynkebestandig, så bare å plassere den på hjernens overflate gir nesten ingen rynker.</li>
		<li>Trim innpakningen med skalpell og pinsett slik at det er omtrent 1 mm margin mellom kanten av kranialvinduet og viklingen (figur 1Bd).</li>
		<li>Når innpakningen er på plass, lim kanten av pakningen til skallen med et biologisk lim (se Materialtabell, figur 2D). La limet tørke i ca 30 minutter.</li>
	</ol></li>
	<li>Påfør den gjennomsiktige silikonelastomeren.<ol><li>Påfør den kommersielt tilgjengelige gjennomsiktige silikonelastomeren (se materialtabell) på toppen av pakningen ved hjelp av en dispenser med blandespiss (figur 1Be, 2A b-d) og plasser dekselglasset (0,12-0,17 mm tykkelse) på toppen (figur 2E).</li>
		<li>Forsegl omkretsen av dekselglasset med vanntett film, superlim eller tannsement (figur 1Bf).</li>
	</ol></li>
	<li>Etter operasjonen, overvåke musen til den gjenvinner bevisstheten for å opprettholde sternal recumbency. Deretter holder du musene individuelt, og lar dem komme seg i hjemmeburet i minst 7 dager.<ol><li>For å redusere stress og smerte, administrer antiinflammatoriske og smertestillende midler (f.eks. Deksametason og ketoprofen, 5 mg / kg hver, i.p.).</li>
	</ol></li>
	<li>Overvåk musene regelmessig for infeksjon. Hvis en infeksjon bekreftes, administrer et antimikrobielt legemiddel (f.eks. 10 % enrofloxacin, 1,7 μL/ml) i drikkevannet til infeksjonen er eliminert (vanligvis mindre enn 4 uker).</li>
</ol>3. Lage AAV-film på plastfolie ved hjelp av fibroinoppløsning
MERK: Trinn 3 er valgfritt.
<ol><li>Forbered fibroinoppløsning fra silkeormkokonger etter en tidligere publisert metode37.<ol><li>Kort sagt, kok kommersielt tilgjengelige normale silkeormkokonger (5 g, se Materialtabell) i natriumkarbonatoppløsning (0,02 M, 2 L). Vask kokongene i ultrarent vann og tørk over natten.</li>
		<li>Løs opp de tørkede kokongene i litiumbromidoppløsning (9,3 M, 20 % w/v fibroin) under oppvarming i ovn ved 60 °C i 4 timer. Dialyser den oppløste kokongløsningen, sentrifugen (to ganger ved 12 700 x g, ved 4 °C i 20 min)37, og samle supernatanten.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered fibroin-AAV-filmen ved å følge trinnene nedenfor.<ol><li>Bland fibroin- og AAV-løsninger20 i forholdet 1:4 i et lite prøverør ved hjelp av en mikropipette. Slipp en aliquot av den blandede fibroin-AAV-løsningen på plastfolien for kranialvinduet, og tørk den i minst 3 timer. MERK: For uttrykk i et område på 3 mm i diameter, bruk en 5 μL dråpe fibroin-AAV-løsning. Dette forholdet bestemmer mengden løsning for et gitt område.</li>
		<li>Etter tørking, kutt plastfolien i ønsket størrelse for vinduet (for eksempel 10 x 15 mm) og legg det på hjerneoverflaten. Følg deretter ovennevnte metode fra trinn 2.8.1 og utover. MERK: Før du plasserer pakningen på hjerneoverflaten, fjern ACSF på hjerneoverflaten så mye som mulig. Dette skyldes at ACSF forventes å løse opp fibroin-AAV-filmen og redusere konsentrasjonen av AAV-partikler.</li>
		<li>Vent ca 2-4 uker etter at du har opprettet det AAV-behandlede vinduet til GECIene er uttrykt tilstrekkelig. Under denne prosessen, kontroller tilstanden til musene og vinduene regelmessig.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kalsiumavbildning og analyse
MERK: For detaljer om bildebehandling og analyse, se tidligere publiserte rapporter 1,2,38.
<ol><li>Utfør vidvinkelbilder ved å følge trinnene nedenfor.<ol><li>Immobiliser musen ved hjelp av en hodefikseringsenhet under et tandemlinsefluorescensmakroskop (se Materialtabell).</li>
		<li>Belys hjernebarken til mus med eksitasjonslys fra en 465 nm LED-lyskilde gjennom et eksitasjonsfilter, dikroisk speil og objektivlinse.</li>
		<li>Samle fluorescensbildene av hjernebarken ved hjelp av et CCD-kamera gjennom en objektivlinse (1.0x), dikroisk speil, utslippsfilter og bildeobjektiv (2.0x). Kombinasjonen av disse linsene gir en total forstørrelse på ca. 0, 5x.</li>
		<li>Skaff bilder med en samplingsfrekvens på 50 Hz. Etter datainnsamling, analyser bildene ved hjelp av ImageJ-programvare. Velg interesseområde (ROI) manuelt. Beregn fluorescensendring i hver avkastning som ΔF / F = (Ft - F0) / F0, hvor Ft er den rå fluorescensverdien til hver ramme og F0 er den gjennomsnittlige fluorescensverdien oppnådd fra et gjennomsnittlig bilde av alle rammer. Et makroprogram for ImageJ deponeres til GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), som beregner ΔF/F-bilder fra kalsiumavbildningsdata.</li>
	</ol></li>
	<li>Utfør to-foton avbildning ved å følge trinnene nedenfor.<ol><li>Immobiliser musen under et to-fotonmikroskop ved hjelp av en hodefikseringsenhet. Identifiser området som skal avbildes ved hjelp av mikroskopet i lysfeltmodus med en objektivlinse med lav forstørrelse (5x).</li>
		<li>Bytt til to-foton bildebehandling. Bruk en objektivlinse med høy forstørrelse (16x eller 25x) og lys laseren for to-foton eksitasjon. MERK: Green Lck-GCaMP6f22 og rød XCaMP-R36 ble eksitert av en ultrarask laser ved eksitasjonsbølgelengder på henholdsvis 920 nm og 1070 nm.</li>
		<li>Skaff fluorescensbilder ved 30 Hz. Etter datainnsamling, korriger bevegelsesartefakter ved registreringsfunksjonen til suite2p-programvaren39. Få avkastning og ΔF/F fra bilder ved hjelp av samme metode for bredfeltsavbildning.</li>
	</ol></li>
	<li>Plott dataene ved hjelp av python med følgende biblioteker: NumPy, Matplotlib og Pandas (se Materialtabell).</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne artikkelen presenterer en billig metode for å lage et stort kranialt vindu ved hjelp av en PVDC plastfolie, gjennomsiktig silikon og dekselglass. Ved hjelp av denne metoden viste vi at bredfelts kalsiumavbildning kunne utføres over et bredt område av hjernebarken. To-foton kalsiumavbildning kan utføres fra flere forskjellige kortikale regioner i samme mus som har gjennomgått vidfeltsavbildning. Videre har det vist seg at en fibroin-AAV-film på plastfolien som brukes til vinduet, kan uttrykke GECI over et bredt område av cortex.
Kritiske trinn Det er viktig å unngå infeksjon og skade på hjernen når du lager kranialvinduer ved hjelp av plastfolie. Under disse forholdene kan nevral og glial aktivitet ikke observeres, og avbildning av dypere områder er umulig. Skader på blodkar resulterer også i blødning, noe som gjør bildebehandling umulig på grunn av blod. For å unngå infeksjon er det viktig å gjøre hjerneoverflaten og innpakningen festet så tett som mulig ved å suge ut ACSF. Mannitol administrasjon er viktig for å unngå hjerne- og blodkarskader ved å forhindre økt hjernetrykk under operasjonen. Dette opprettholder mellomrommet mellom overflaten av hjernen og dura mater og forhindrer at hjernen og blodkarene blir berørt under fjerning av skallen og dura mater. Et stereomikroskop med høy forstørrelse og pinsett med skarpe spisser er også effektivt for nøyaktig kirurgi.
I fibroin-AAV-metoden er det viktig å bruke kjøttsilkeormkokonger, ikke å fryse fibroinoppløsning, å tørke fibroin-AAV-løsningen tilstrekkelig, og å påføre nok volum oppløsning (5 μL per 3 mm diameter). Når eldre kokonger ble brukt, var uttrykkseffektiviteten lavere. Dette er fordi fibroin fra gamle kokonger lett kan denatureres. Når fibroinoppløsningen ble frosset ved -80 °C og tint på brukstidspunktet, var uttrykkseffektiviteten dårlig. Dette kan skyldes denaturering av proteinet på grunn av frysing og tining. Siden fibroinoppløsninger lagret ved 4 °C effektivt kan brukes til gelering, anbefales det at fibroinoppløsninger oppbevares i kjøleskap og renses fra kokonger igjen etter gelering. Fibroin-AAV-løsningen skal tørkes i minst 3 timer, da uttrykket er dårlig etter mindre enn 3 timer. Endelig avhenger uttrykksområdet av mengden fibroin-AAV-løsning som brukes. I eksemplet i figur 3M var mengden liten (5 μL); Dermed dekket fibroin-AAV-filmen bare den øvre halvdelen av vinduet, noe som resulterte i ujevnt uttrykk over vinduet. Hvis en tilstrekkelig mengde fibroin-AAV brukes, vil uttrykket være jevnt over hele vinduet.
Modifikasjoner av teknikken Den nye kranialvinduteknikken gjør det mulig å undersøke den makroskopiske aktiviteten til kortikale kretser og deres underliggende enkeltcellenivåaktivitet i samme mus. Dermed kan metoden brukes på en rekke nevrovitenskapsstudier. For eksempel kan den brukes til å observere kortikal aktivitet under beslutningsoppgaver, motorisk læring og i musemodeller av hjerneskade og sykdom. Vi tror også at metoden ikke bare kan brukes på gnagere, men også på ikke-menneskelige primater.
Dette papiret viser at det store kranialvinduet er effektivt for avbildning av transgene mus og mus injisert med AAV som uttrykker funksjonelle proteiner. Spesielt er det vist at fibroin-AAV-filmen på omslaget er mye enklere enn en konvensjonell AAV-injeksjonsmetode for å uttrykke GECIer over det brede området av cortex. Ved hjelp av en blanding av to AAV-er som koder for GECIer i forskjellige farger41, kan korrelasjonen mellom nevron- og glialcelleaktivitet samtidig avbildes over et bredt område av cortex. Videre kan fibroin-AAV-filmmetoden også brukes på andre genetisk kodede biosensorer 42,43,44,45,46,47.
Det større kranialvinduet, som kan avbilde begge halvkule, er også mulig. To-foton mikroskoper med et mye bredere synsfelt (~ 25 mm2) har nylig blitt utviklet 25,26,27,28,29. Kombinere denne to-fotonavbildningsteknikken med en-foton vidvinkelavbildning ved hjelp av det brede kranialvinduet som er beskrevet her, vil tillate oss å undersøke forholdet mellom populasjonsaktivitet og enkeltcelleaktivitet fra enestående skalaer.
Begrensninger Matinnpakningen tillater ikke noen stoffer å passere gjennom. Dette gjør metoden vanskelig å bruke til farmakologiske eksperimenter. Det er også vanskelig å fjerne innpakningen, noe som gjør det umulig å sette inn en glasspipette eller elektrode. Derfor er det vanskelig å gjennomføre eksperimenter kombinert med andre metoder som samtidig kalsiumavbildning og elektrofysiologiske opptak, og lokal administrering av legemidler ved hjelp av en glasspipette. En mulig løsning for disse begrensningene er å bruke innpaknings- og glassvinduet med et hull. Dette gir tilgang til hjernen via en glasspipette eller en opptakselektrode mens kranialvinduet holdes sterilt i lang tid48.

Bredfelts kalsiumavbildning undersøker effektivt det spatiotemporale aktivitetsmønsteret over et stort område av dyrehjernen 1,2,3. Bredfeltsavbildning har blitt mye brukt til å observere gnageres hele kortikale overflate siden deres cortex er relativt flat 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgene mus eller mus injisert med adeno-assosiert virus (AAV), som spesifikt uttrykker GECI i forskjellige celler som nevroner og gliaceller, kan brukes til bredfelts kalsiumavbildning11,12,13. Imidlertid er den romlige oppløsningen av denne teknikken vanligvis ikke nok til å løse aktiviteten til individuelle celler in vivo14. Det er heller ikke egnet for avbildning av celler som ligger i dypere lag.
På den annen side kan to-foton kalsiumavbildning observere aktiviteten til flere celler samtidig med subcellulær romlig oppløsning, noe som tillater observasjon av aktiviteten til individuelle celler selv i nevronale dendritter og glialprosesser 15,16,17,18,19,20,21,22. Det kan også observere celler i dypere lag av hjernebarken23,24. Selv om nyere teknologiske fremskritt innen to-fotonmikroskopi muliggjør avbildning fra millimeterbrede kortikale regioner 25,26,27,28,29, er det fortsatt vanskelig å observere et område som kan sammenlignes med bredfeltsavbildning ved to-fotonavbildning.
For å forstå den fysiologiske relevansen av hjerneaktivitet fra enkeltcelle til helhjerne, er det viktig å bygge bro over gapet mellom aktiviteten til kortikale regioner over hele cortex og den ved enkeltcelleoppløsning i lokale nevrale kretser. Derfor er en kombinasjon av bredfelt og to-foton kalsiumavbildning utført i samme mus spesielt effektiv. For å realisere dette må det opprettes et bredt og stabilt kranialvindu, ideelt over en lang periode.
Tidligere har flere teknikker for å lage kraniale vinduer blitt utviklet for å tillate bredfelt og to-foton avbildning som skal utføres i samme mus30,31. Trapesformede dekselglassvinduer (krystallskalle), som er støpt i form av den kortikale overflaten for å erstatte det fjernede beinet, tillater optisk tilgang over hele cortex32. Alternativt kan polymerbaserte kranialvinduer fremstilles med polyetylentereftalat (PET)33 eller polyetylenoksidbelagte amorfe fluorpolymerer nanoark34. Hver metode har vist seg å opprettholde et stabilt vindu i mer enn 1 måned. Det er imidlertid ikke lett å produsere disse vinduene, og materialene og utstyret som brukes er ofte dyre.
Denne studien beskriver en ny metode for å lage et stort kranialt vindu ved hjelp av PVDC-filmen (plastfolie) (figur 1). Ved hjelp av dette vinduet kan in vivo vidfelt- og to-fotonavbildningseksperimenter utføres i samme mus. Det har også vist seg at GECI kan uttrykkes i nevroner over et bredt område av cortex av mus ved å danne et tynt lag av film som inneholder AAV-partikler på wrap.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

Bredfelts kalsiumavbildning fra musens neocortex gjør det mulig å observere cortex-bred nevral aktivitet relatert til ulike hjernefunksjoner. På den annen side kan to-fotonavbildning løse aktiviteten til lokale nevrale kretser på enkeltcellenivå. Det er viktig å lage et stort kranialt vindu for å utføre flerskala analyse ved hjelp av begge bildebehandlingsteknikkene i samme mus. For å oppnå dette må man fjerne en stor del av skallen og dekke den eksponerte kortikale overflaten med gjennomsiktige materialer. Tidligere har glassskaller og polymerbaserte kranialvinduer blitt utviklet for dette formålet, men disse materialene er ikke lett produsert. Denne protokollen beskriver en enkel metode for å lage et stort kranialt vindu bestående av kommersielt tilgjengelig polyvinylidenklorid (PVDC) innpakningsfilm, en gjennomsiktig silikonplugg og et dekselglass. For avbildning av dorsaloverflaten på en hel halvkule var vindusstørrelsen ca. 6 x 3 mm2. Alvorlige hjernevibrasjoner ble ikke observert uavhengig av et så stort vindu. Det er viktig at tilstanden til hjerneoverflaten ikke forverres i mer enn en måned. Bredfeltsavbildning av en mus som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator (GECI), GCaMP6f, spesielt i astrocytter, avslørte synkroniserte responser på noen få millimeter. To-fotonavbildning av samme mus viste fremtredende kalsiumresponser i individuelle astrocytter over flere sekunder. Videre ble et tynt lag av et adeno-assosiert virus påført PVDC-filmen og vellykket uttrykt GECI i kortikale nevroner over kranialvinduet. Denne teknikken er pålitelig og kostnadseffektiv for å lage et stort kranialt vindu og letter undersøkelsen av nevrale og glialdynamikk og deres interaksjoner under oppførsel på makroskopiske og mikroskopiske nivåer.

Evaluering av et stort kranialt vindu laget ved hjelp av PVDC-innpakningsmetodene Umiddelbart etter operasjonen kan suksess eller fiasko kontrolleres med et øyeblikk av tilstanden til den kortikale overflaten, for eksempel blødning og fargeendring på grunn av skade eller iskemi. Lenge etter operasjonen kan den kortikale overflaten være dekket med en ugjennomsiktig hvit membran på grunn av infeksjon, eller blod kan dekke vinduet på grunn av blødning (figur 2G). I disse tilfellene kan cortex ikke være i sunn tilstand, og bildebehandling kan ikke være mulig. Disse kan være forårsaket av delvis avskårne omslag eller utilstrekkelig fiksering av folien av limet. Hvis infeksjonen observeres gjentatte ganger, kan det være effektivt å bruke antibiotika, for eksempel gentamicinsulfat (10 μL, 50 mg / ml), over hjerneoverflaten ved vindusplassering. Regenerering av hjernehinner eller bein ses også når det vertikale gapet mellom kortikal overflate og wrap er stort. For å forhindre dette er det avgjørende å påføre pakningen så tett som mulig på hjerneoverflaten under vindusforberedelse. Dette kan oppnås ved å plassere plastfolie på hjerneoverflaten og suge ut så mye ACSF som mulig. I fravær av ACSF kan det gjøres ved ganske enkelt å plassere plastfolien på hjerneoverflaten. Hjernen og blodårene er fast bestemt på å være uskadet av det faktum at fargen på hjernen ikke er misfarget og blodårene ikke er kuttet.
Vinduets levetid avhenger i stor grad av kvaliteten på operasjonen. Når tilstanden er god, er det ingen tegn til infeksjon, blødning eller regenerering mer enn 1 måned etter operasjonen (figur 2F og figur 3B). Hos 8 av 10 mus kunne vinduet holdes klart opptil 10 uker eller lenger. Vinduer i to av musene kunne ikke vedlikeholdes ordentlig på grunn av infeksjon eller blødning. Selv om det store vinduet kan være utsatt for mekanisk belastning eller støt, ble det ikke observert knuste eller sprukne vinduer.
For å evaluere bildekvaliteten til det nye kranialvinduet med innpakning, silikon og glass, ble punktspredningsfunksjonen sammenlignet under det nye vinduet med det under det konvensjonelle glassvinduet ved å avbilde 0,1 μm fluorescerende perler i agar (se tilleggsfil 1). Resultatene viste ingen forskjell i full bredde ved halv maksimum (FWHM) for begge forhold. [X-akse (μm): kun glass, 1,99 ± 0,07, wrap, 1,76 ± 0,13, Y-akse (μm): kun glass, 2,11 ± 0,27, wrap, 1,90 ± 0,15, Z-akse (μm): kun glass, 25,29 ± 0,71, wrap, 26,64 ± 1,02, N = 7 perler, p > 0,05, Mann-Whitney U-testen, supplerende figur 2A, B]. Derfor forverret de nye elementene som ble lagt til (wrap og silikon) ikke bildekvaliteten.
Vibrasjonsartefakter forårsaket av respirasjon, hjerteslag og kroppsbevegelse er tilstede i bredfelts- og to-fotonbilder. For å bestemme hvor mye det nye kranialvinduet vibrerer, ble en liten fluorescerende partikkel valgt fra in vivo to-foton imaging data og undersøkt hvor mye bildet beveget seg i løpet av 60 s. Det ble funnet at standardavviket til sentroiden til den fluorescerende partikkelen var ca. 0, 3 μm, noe som er sammenlignbart med det under et konvensjonelt glassvindu (supplerende figur 2C). Dette indikerer at fordi hjernen ble holdt nede av en gjennomsiktig silikonplugg og dekselglass, var vibrasjonene sammenlignbare med det som ble observert i konvensjonelle mindre vinduer, og offline bilderegistrering var tilstrekkelig til å eliminere vibrasjonsartefakter.
Ved bredfelts kalsiumavbildning kunne den kortikale aktiviteten observeres forplantning over cortex indusert av sensorisk stimulering (figur 3A-D, K-N). To-fotonavbildning tillot observasjon av encellede fluorescensbilder som er spesifikke for nevroner og gliaceller (figur 3E, O). Fluorescensendringer indusert av sensorisk stimulering kunne observeres i individuelle celler (figur 3E-J, O-T).
Ekspresjon av genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) i et bredt område av hjernebarken ved hjelp av PVDC-wrap og AAV PVDC-innpakningen for vinduet kan brukes til å uttrykke funksjonelle proteiner i et bredt område av cortex. Dette oppnås ved bruk av AAV og fibroin, et komponentprotein av silkeormkokonger som har blitt mye brukt som biomaterialer37. En tidligere studie viste at fibroin kunne blandes med AAV, og danne filmer implantert i hjernen for å uttrykke funksjonelle proteiner som fotoaktiverbare opsiner eller GECIer36. I denne studien ble AAV som uttrykker GECI og fibroin blandet og tørket på pakningen, og AAV-belagt wrap ble brukt til kranialvinduet. Dette resulterte i ekspresjon av GECI over det brede området av cortex 2-4 uker etter operasjonen (figur 3K-M). Siden vinduet var stort, kan forskjellige kortikale områder av samme mus avbildes (figur 3M-T).
For å bekrefte ekspresjonseffektiviteten til denne metoden ble antall celler som uttrykker GECI talt i den faste hjernen (supplerende figur 2D). Det ble funnet at den nåværende strategien ved bruk av wrap med fibroin-AAV resulterte i ekspresjon av GECI med en effektivitet på ca. 20% i både overfladiske og dypere lag (L2 / 3: 20,78%, XCaMP-R uttrykker celle: 32 celler, DAPI: 154 steder, L5: 20,08%, XCaMP-R uttrykker celle: 51 celler, DAPI: 254 steder). Dermed uttrykte denne metoden GECI i celler ikke bare i overflatelag, men også i dypere lag.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig01.jpg"> Figur 1: Begrepsmessig diagram over det store kranialvinduet. (A) Venstre, skjematisk tegning av det nye kranialvinduet. Det er større enn det konvensjonelle vinduet (3 mm diameter). Høyre, Tverrsnittsvisning. Metoden for å lage et stort kranialvindu bruker matinnpakning, gjennomsiktig silikonelastomer og dekkglass, noe som tillater bredfelt- og tofotonavbildning fra samme mus. (B) Prosedyre for fremstilling av kranialvinduer: (a) Benfjerning. (b) Fjerning av ACSF under innpakningen. (c) Overholdelse av innpakningen til hjerneoverflaten ved å fjerne ACSF. (d) Kutte bort overflødig innpakning. (e) Påføring av gjennomsiktig silikon. (f) Feste dekselglass. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig02.jpg"> Figur 2: Oversikt over kranial vinduskirurgi . (A) Materialer og utstyr som kreves for kranialvinduet. (a) Polyvinylidenklorid (PVDC) innpakningsfilm. (b) En dispenser av gjennomsiktig silikonelastomer med blandespiss. (c) Dekk glass. (d) Gjennomsiktig silikon plassert mellom to stykker av dekselglasset. (B) Fotografi av musens hodehud innskåret for å eksponere skallen. Musen ble bedøvet, og musens hode ble immobilisert ved hjelp av ørestenger. Hodet ble deretter dehaired, behandlet med lokal analgesi, og huden ble skåret inn. (C) Fotografi etter installasjon av en hodeplate. En hodeplate (laget av harpiks fra en 3D-skriver) ble festet til musens hode med dental sement. (D) Fotografi av et kranialt vindu. Kranialvinduet ble opprettet i cortex av høyre halvkule av musehjernen. Dura mater ble fjernet, og viklet ble limt på plass. (E) Et bilde av vinduet laget av wrap med gjennomsiktig silikon og dekke glass på toppen. (F) Et typisk eksempel på et vellykket vindu (høyre halvkule, 7 uker etter operasjonen). (G) Eksempel på mislykket vindu (begge halvkuler, 5 uker etter operasjonen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig03.jpg"> Figur 3: Det store vinduet tillater bredfelts- og to-foton kalsiumavbildning fra samme mus. (A) Kalsiumavbildning ble utført i en transgen mus som uttrykker membranforankret GECI (Lck-GCaMP6f) i astrocytter40. (B) Venstre ble et stort vindu opprettet med plastfolie, gjennomsiktig silikon og dekkglass. Vidvinkelavbildning ble utført gjennom dette vinduet. Høyre, et bilde ble tatt 79 dager etter installasjonen av kranialvinduet. (C) Når luftpuststimulering ble påført de kontralaterale værhårene, ble det observert fluorescensendringer. (D) Tidsforløpet for fluorescensendringen i den somatosensoriske cortex (rød firkant i C) ble plottet. Røde og blå søyler angir luftblåsetid og henholdsvis "før", "under" og "etter" timing i (C). (E) Synsfeltet (FOV 1 i C) av to-foton kalsiumavbildning. Fordi GCaMP6f ble uttrykt for å lokalisere til membranen, ble interesseområdene (hvite firkanter) manuelt plassert for å oppdage den lokale responsen i astrocytprosesser. (F) Fluorescensendringene i de fargede rutene i (E) er plottet. (G) Fluorescensendringene i alle kvadrater av (E) er plottet. Vannrette og vertikale akser angir henholdsvis tid og celletall. (H-J) Data for FOV 2 (i synsbarken) i (C) vises. FOV 2 ble avbildet etter avbildningen i FOV 1. (K) Rød GECI, XCaMP-R, ble uttrykt i nevroner ved fibroin-AAV-metoden i villtypemusen. (L) Fotografi tatt to uker etter operasjonen der vinduet ble opprettet ved hjelp av fibroinfilmen. (M) Bredfelts kalsiumavbildning ble utført på denne musen. (N) Fluorescensendringen fremkalt av whisker-stimulering ble plottet fra det mest fremtredende stedet (somatosensorisk cortex, rød firkant i (M)). Røde og blå linjer angir henholdsvis luftpufftiming og "før" og "under" timing i (M). (O) Synsfelt (somatosensorisk cortex, FOV 1 i (M)) av to-foton kalsiumavbildning ved 300 μm dybde. ROI ble manuelt plassert ved neuronal somata. (P) Fluorescensendringene i de fargede rutene i (O) er plottet. (Q) Fluorescensendringene i alle kvadrater av (O) er plottet i farger. (R-T) Data for FOV 2 i (M) lokalisert i parietal cortex er vist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Tips for skalpeller. Spissen av den nye skalpellen (øverst) sammenlignet med skalpellen pleide å kutte skallen med en stump spiss (nederst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2: Validering av det nye kranialvinduet og fibroin-AAV-ekspresjonsmetoden. (A) Fluorescensintensitetsprofil av 0,1 μm fluorescerende perler i agar. Den øverste raden viser data fra en tilstand der bare dekkglass ble plassert over fluorescerende perler blandet i agar, og den nederste raden viser data fra en tilstand der innpakning, gjennomsiktig silikon og dekkglass ble plassert. De grå sporene viser gaussisk tilpasning til fluorescensintensitetsprofilen for hver perle, og de røde sporene viser gjennomsnittsverdiene (n = 7). (B) Sammendrag av data i (A). Hver graf viser full bredde ved halve maksimum (FWHM) av punktspredningsfunksjonen på XYZ-aksen. Den grå tegningen viser dataene for hver perle, og den røde viser middel- og standardfeilen. (C) Fra de 2000 bildene (60 s opptak) av in vivo bildedata ble en liten fluorescerende partikkel valgt og undersøkt hvor mye bildet beveget seg i løpet av 60-tallet. Det fluorescerende bildet i midten representerer gjennomsnittet av 2000 bilder. Bildene ble projisert ved gjennomsnitt i X- og Y-akseretningene. Histogrammene viser fordelingen av sentroiden i hver ramme. Standardavvikene til sentroid var X: 0,36 og Y: 0,315 μm. (D) Eksempel på GECI-uttrykk ved fibroin-AAV-metoden. Venstre: Et stykke hjernebark anvendte fibroin-AAV-uttrykksmetoden. Rødt og blått indikerer fluorescens fra henholdsvis XCaMP-R og DAPI; XCaMP-R ble uttrykt ikke bare i lag 2/3-celler, men også i lag 5-celler. Sentrum og høyre. Forstørrede visninger av henholdsvis lagene 2/3 og 5 i venstre figur (cyan firkanter). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 1: (A) Ekspresjonseffektivitet av innpakningen med fibroin-AAV-filmmetoden og (B) Evaluering av punktspredningsfunksjonen under to-fotonavbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20File%201_FINAL.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Den nåværende protokollen beskriver å lage et stort (6 x 3 mm2) kranialvindu ved hjelp av matfolie, gjennomsiktig silikon og dekkglass. Dette kraniale vinduet tillater in vivo vidfelt og to-foton kalsiumavbildningseksperimenter i samme mus.

In Vivo Wide-Field og Two-Photon Calcium Imaging fra en mus ved hjelp av et stort kranialt vindu

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Denne protokollen viser en opprettelse av stort kranialt vindu for å måle bredfelts- og encellede reservasjonsaktiviteter i samme mus. Ved hjelp av vår metode kan stort og stabilt kranialt vindu lages med matpakke til lave kostnader. Denne metoden er effektiv for å studere nevrale og gliale aktiviteter under oppførsel på makroskopiske og mikroskopiske nivåer.Det anbefales å starte med et lite kranialvindu. Så hvis det lykkes, øk størrelsen på vinduet. Begynn med å fjerne den ekstra sementen over skallen med en tannbor.Merk området som skal kuttes med en penn. Skjær inn i beinet med en skalpell med en stump spiss for å sikre at spissen ikke trenger inn i skallen. Skrap beinet gjentatte ganger med en skalpell for å utdype sporet til beinet i området som skal trimmes, beveger seg når det berøres lett.Fjern det innskårne beinet med fin pinsett. Vær forsiktig så du ikke skyver beinklaffen inn i hjernen som kan skade hjernen. For å fjerne dura materen, kutt duraen med en trukket glasspipette med en konisk spiss på ca. 10 mikrometer.Bruk en U-formet nål for å utvide dette kuttet over hele vinduet. Under et stereomikroskop satt til 60 til 100x zoom, fjern den avskårne dura materen med ultrafin pinsett. Ved blødning, Skyll med aCSF eller bruk en gelatinsvamp for å stoppe blødningen.Steriliser deretter et stort stykke PVDC-innpakning ved autoklavering og med 70% etanol. Under et stereomikroskop, bruk pinsett og en skalpell for å kutte ut en wrap av ønsket størrelse. Plasser pakningen på hjerneoverflaten mens du forlater aCSF på overflaten.Sug ut aCSF fra kanten av pakningen, slik at innpakningen fester seg godt til hjerneoverflaten. Trim wrap med en skalpell og pinsett slik at det er omtrent en millimeter margin mellom kanten av kranialvinduet og wrap. Når innpakningen er på plass, lim kanten av viklingen til skallen med et biologisk lim.La limet tørke i ca. 30 minutter. Bruk en dispenser med blandespiss, bruk en gjennomsiktig silikonelastomer på toppen av pakningen. Plasser dekselglasset med tykkelse 0,12 til 0,17 millimeter på toppen.Forsegl omkretsen av dekselglasset med vanntett film, superlim eller dental sement. Bland først fibroin- og AAV-løsninger i ett til fire-forhold i et lite prøverør. Slipp en aliquot av løsningen på plastfolien til kranialvinduet og tørk den i minst tre timer.Fest deretter pakningen til hjerneoverflaten som vist i forrige avsnitt. Kontroller tilstanden til musene og vinduene regelmessig, to til fire uker. På dette tidspunktet vil de genetisk kodede kalsiumindikatorene uttrykkes tilstrekkelig etter å ha opprettet det AAV-behandlede vinduet.Ved hjelp av denne protokollen kunne kranialvinduer opprettholdes hos åtte av 10 mus i opptil 10 uker. Et bredt vindu er laget med plastfolie, gjennomsiktig silikon og dekkglass i en transgen mus som uttrykker membranforankret genetisk kodet kalsiumindikator i astrocytter. Bredfelts kalsiumavbildning ble utført gjennom dette vinduet, og fluorescensendringer ble observert når luftpuststimulering ble påført de kontralaterale værhårene.Tidsforløpet for fluorescensendringen i den somatosensoriske cortex viste kortikal aktivitet. To-fotonavbildning tillot observasjon av enkeltcellefluorescensbilder som er spesifikke for gliaceller. Fluorescensendringer indusert av sensorisk stimulering ble observert i individuelle celler fra forskjellige kortikale regioner.Wrap kodet med AAV som uttrykker genetisk kodet kalsiumindikator, og fibroin ble brukt til å lage kranialvinduet. Bredfelts kalsiumavbildning viste kortikal aktivitet som forplantet seg over cortex indusert av sensorisk stimulering to til fire uker etter operasjonen. Siden vinduet var stort, ble forskjellige kortikale områder av samme mus avbildet og fluorescensendringer indusert av sensorisk stimulering ble sett i individuelle celler.Det er viktig å unngå skade på hjernen når du lager kranialvindu. Man kan utføre atferdsoppgaver på mus med et stort kranialvindu. Dette vil tillate å undersøke forholdet mellom nevral aktivitet og museadferd.Denne metoden kan brukes på en rekke nevrovitenskapsstudier. For eksempel kan den brukes til å observere kortikal aktivitet under beslutningsoppgaver, motorkjøring og i massemodeller av hjerneskade og sykdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av dendrittutløperne i Mouse Cortex Bruke en Tynnet-skalle Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

En stor sideveis kraniotomi Prosedyre for mesoskala Wide-field Optical Imaging av hjernens aktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablasjon av Neuronal innbyggere med en to-fotonet Laser og sin vurdering ved hjelp av kalsium Imaging og atferdsmessige opptak i sebrafisk larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillary To-foton In vivo Avbildning av musens netthinne

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantasjon av et kranialvindu for gjentatt in vivo-avbildning i våkne mus

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...