Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

Эта работа была поддержана Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) «Glial Decoding» (JP21H05621 to SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 to SM, 15KK0340 to ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 to HB и JP17H06313 to KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm02079h0002 to SM, JP19dm0207079 to HB и JP19dm0207080 to KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (to SM), Грант для молодых исследователей из префектуры Яманаси (в SM) и Научного фонда Такэда (в SM) и частично поддерживается грантом Frontier Brain Research Grant от Университета Яманаси.
Мы благодарим Н. Ягути и К. Окадзаки за уход за животными и техническую помощь, а также членов лаборатории Китамура за полезные обсуждения.

Авторам нечего раскрывать.

В данной статье представлен недорогой способ создания большого черепного окна с использованием полиэтиленовой пленки PVDC, прозрачного силикона и покровного стекла. Используя этот метод, мы показали, что широкоугольная визуализация кальция может быть выполнена над широкой областью коры головного мозга. Двухфотонная визуализация кальция может быть выполнена из нескольких различных областей коры у одной и той же мыши, которая подверглась широкоугольной визуализации. Кроме того, было показано, что фиброин-AAV пленка на пластиковой пленке, используемой для окна, может экспрессировать GECI над широкой областью коры.
Критические шаги Важно избегать инфицирования и повреждения головного мозга при изготовлении черепных окон с использованием полиэтиленовой пленки. В этих условиях нейронная и глиальная активность не могут наблюдаться, а визуализация более глубоких областей невозможна. Повреждение кровеносных сосудов также приводит к кровотечению, что делает визуализацию невозможной из-за крови. Чтобы избежать инфекции, важно сделать поверхность мозга и обертку прикрепленной как можно плотнее, высасывая ACSF. Введение маннитола важно, чтобы избежать повреждения мозга и кровеносных сосудов, предотвращая повышенное давление в мозге во время операции. Это поддерживает пространство между поверхностью мозга и твердой мозговой оболочкой и предотвращает прикосновение к мозгу и кровеносным сосудам во время удаления черепа и твердой мозговой оболочки. Стереомикроскоп с большим увеличением и пинцет с острыми наконечниками также эффективны для точной операции.
В методе фиброин-ААВ важно использовать коконы из плоти шелкопряда, не замораживать раствор фиброина, достаточно сушить раствор фиброина-ААВ и наносить достаточный объем раствора (5 мкл на 3 мм диаметра). Когда использовались старые коконы, эффективность экспрессии была ниже. Это связано с тем, что фиброин из старых коконов может быть легко денатурирован. Когда раствор фиброина замораживали при -80 °C и размораживали во время использования, эффективность экспрессии была низкой. Это может быть связано с денатурацией белка из-за замораживания и оттаивания. Поскольку растворы фиброина, хранящиеся при 4 °C, могут быть эффективно использованы до гелеобразования, рекомендуется, чтобы растворы фиброина хранились в холодильнике и очищались от коконов снова после гелеобразования. Раствор фиброина-ААВ следует сушить в течение не менее 3 ч, так как экспрессия плохая менее чем через 3 ч. Наконец, область экспрессии зависит от количества используемого раствора фиброина-AAV. В примере на рисунке 3M количество было небольшим (5 мкл); таким образом, фиброин-AAV пленка покрывала только верхнюю половину окна, что приводило к неравномерному выражению над окном. Если используется достаточное количество фиброина-AAV, выражение будет равномерным по всему окну.
Модификации техники Новый метод черепного окна позволяет исследовать макроскопическую активность корковых цепей и лежащую в их основе активность на уровне одной клетки у одной и той же мыши. Таким образом, метод может быть применен к различным исследованиям в области неврологии. Например, его можно использовать для наблюдения за активностью коры во время принятия решений, моторного обучения, а также в мышиных моделях черепно-мозговых травм и заболеваний. Мы также считаем, что метод может быть применен не только к грызунам, но и к нечеловеческим приматам.
В этой статье показано, что большое краниальное окно эффективно для визуализации трансгенных мышей и мышей, которым вводят AAV,экспрессирующие функциональные белки. В частности, показано, что фиброин-AAV пленка на обертке намного проще, чем обычный метод инъекции AAV для экспрессии GECI через широкую область коры. Используя смесь двух AAV, кодирующих GECI разных цветов41, корреляция между активностью нейронов и глиальных клеток может быть одновременно визуализирована на широкой области коры. Кроме того, метод фиброин-AAV пленки также может быть применен к другим генетически закодированным биосенсорам 42,43,44,45,46,47.
Также возможно большее краниальное окно, которое может отображать оба полушария. Двухфотонные микроскопы с гораздо более широким полем зрения (~25мм2) недавно были разработаны 25,26,27,28,29. Сочетание этого метода двухфотонной визуализации с однофотонной широкоугольной визуализацией с использованием широкого черепного окна, описанного здесь, позволит нам изучить взаимосвязь между активностью популяции и активностью одиночных клеток с беспрецедентных масштабов.
Ограничения Пищевая обертка не пропускает никаких веществ. Это затрудняет использование метода для фармакологических экспериментов. Также трудно снять обертку, что делает невозможным вставку стеклянной пипетки или электрода. Поэтому трудно проводить эксперименты в сочетании с другими методами, такими как одновременная визуализация кальция и электрофизиологические записи, а также местное введение лекарств с использованием стеклянной пипетки. Возможным решением этих ограничений является использование обертывания и стеклянного окна с отверстием. Это позволяет получить доступ к мозгу через стеклянную пипетку или записывающий электрод, сохраняя при этом краниальное окно стерильным в течение длительного периода48.

Широкоугольная визуализация кальция эффективно исследует паттерн пространственно-временной активности на большой площади мозга животных 1,2,3. Широкоугольная визуализация широко используется для наблюдения за всей кортикальной поверхностью грызунов, поскольку их кора относительно плоская 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Трансгенные мыши или мыши, которым вводили аденоассоциированный вирус (AAV), которые специфически экспрессируют GECI в различных клетках, таких как нейроны и глиальные клетки, могут быть использованы для широкоугольной визуализации кальция 11,12,13. Однако пространственного разрешения этого метода обычно недостаточно для разрешения активности отдельных клеток in vivo14. Он также не подходит для визуализации клеток, расположенных в более глубоких слоях.
С другой стороны, двухфотонная кальциевая визуализация может наблюдать активность нескольких клеток одновременно с субклеточным пространственным разрешением, что позволяет наблюдать активность отдельных клеток даже в нейрональных дендритах и глиальных процессах 15,16,17,18,19,20,21,22. Он также может наблюдать клетки в более глубоких слоях коры головного мозга23,24. Хотя последние технологические достижения в области двухфотонной микроскопии позволяют получать изображения из областей коры шириной в миллиметр 25,26,27,28,29, все еще трудно наблюдать область, сопоставимую с широкоугольной визуализацией с помощью двухфотонной визуализации.
Чтобы понять физиологическую значимость активности мозга от одноклеточной к целой голове, важно преодолеть разрыв между активностью корковых областей по всей коре и активностью одноклеточных разрешений в локальных нейронных цепях. Поэтому комбинация широкоугольной и двухфотонной кальциевой визуализации, выполненной на одной и той же мыши, особенно эффективна. Чтобы реализовать это, необходимо создать широкое и стабильное черепное окно, в идеале в течение длительного периода.
Ранее было разработано несколько методов изготовления черепных окон, позволяющих выполнять широкоугольную и двухфотонную визуализацию в одной и той же мыши 30,31. Трапециевидной формы покрывают стеклянные окна (хрустальный череп), которые отливаются в форму кортикальной поверхности для замены удаленной кости, обеспечивают оптический доступ по всей коре32. Альтернативно, краниальные окна на полимерной основе могут быть изготовлены из полиэтилентерефталата (ПЭТ)33 или полиэтиленоксидного покрытия с аморфными фторполимераминанолиста 34. Было показано, что каждый метод поддерживает стабильное окно в течение более 1 месяца. Однако производить эти окна непросто, а используемые материалы и оборудование часто стоят дорого.
В настоящем исследовании описан новый метод изготовления большого черепного окна с использованием пленки PVDC (пластиковая пищевая пленка) (рисунок 1). Используя это окно, эксперименты in vivo с широкоугольной и двухфотонной визуализацией могут быть выполнены на одних и тех же мышах. Также было показано, что GECI могут быть экспрессированы в нейронах над широкой областью коры мышей, образуя тонкий слой пленки, содержащей частицы AAV на обертке.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

Широкоугольная визуализация кальция из неокортекса мыши позволяет наблюдать нейронную активность всей коры, связанную с различными функциями мозга. С другой стороны, двухфотонная визуализация может разрешать активность локальных нейронных цепей на уровне одной клетки. Крайне важно сделать большое краниальное окно для выполнения многомасштабного анализа с использованием обоих методов визуализации в одной мыши. Для этого необходимо удалить большой участок черепа и покрыть открытую кортикальную поверхность прозрачными материалами. Ранее для этой цели были разработаны стеклянные черепа и краниальные окна на полимерной основе, но эти материалы нелегко изготавливать. Настоящий протокол описывает простой способ изготовления большого черепного окна, состоящего из коммерчески доступной пленки из поливинилиденхлоридной (PVDC), прозрачной силиконовой пробки и покровного стекла. Для визуализации дорсальной поверхности целого полушария размер окна составлял примерно 6 х 3мм2. Сильные вибрации мозга не наблюдались независимо от такого большого окна. Важно отметить, что состояние поверхности мозга не ухудшалось более одного месяца. Широкопольная визуализация мыши, экспрессирующей генетически закодированный индикатор кальция (GECI), GCaMP6f, особенно в астроцитах, выявила синхронизированные ответы в нескольких миллиметрах. Двухфотонная визуализация той же мыши показала заметные реакции кальция в отдельных астроцитах в течение нескольких секунд. Кроме того, тонкий слой аденоассоциированного вируса был нанесен на пленку PVDC и успешно экспрессировал GECI в корковых нейронах над краниальным окном. Этот метод является надежным и экономически эффективным для создания большого черепного окна и облегчает исследование нейронной и глиальной динамики и их взаимодействий во время поведения на макроскопическом и микроскопическом уровнях.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Настоящий протокол описывает изготовление большого (6 х 3мм2) черепного окна с использованием пищевой пленки, прозрачного силикона и покровного стекла. Это краниальное окно позволяет проводить эксперименты in vivo с широкоугольной и двухфотонной визуализацией кальция на одной и той же мыши.

В городе Виво Широкоугольная и двухфотонная визуализация кальция с помощью мыши с помощью большого краниального окна

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Этот протокол показывает создание большого краниального окна для измерения широкоугольных и одноклеточных действий резервирования в одной мыши. Используя наш метод, большое и стабильное краниальное окно может быть изготовлено с пищевой пленкой по низкой цене. Этот метод эффективен для изучения нейронной и глиальной деятельности во время поведения на макроскопическом и микроскопическом уровнях.Начинать рекомендуется с небольшого черепного окна. Затем, если это удалось, увеличьте размер окна. Начните с удаления лишнего цемента над черепом с помощью бормашины.Пометьте область, которую нужно вырезать, ручкой. Врежьте в кость скальпелем с тупым кончиком, чтобы наконечник не проник в череп. Соскребайте кость несколько раз скальпелем, чтобы углубить бороздку, пока кость в области, подлежащей обрезке, не сдвинется при легком прикосновении.Удалите разрезанную кость тонким пинцетом. Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть костный лоскут в мозг, который может повредить мозг. Чтобы удалить твердую мозговую оболочку, отрежьте твердое вещество с помощью вытянутой стеклянной пипетки с коническим наконечником около 10 микрометров.Используйте U-образную иглу, чтобы расширить этот разрез по всему окну. Под стереомикроскопом, установленным на 60-100-кратный зум, удалите отрезанную твердую мозговую оболочку с помощью ультратонкого пинцета. В случае кровотечения смойте с помощью aCSF или используйте желатиновую губку, чтобы остановить кровотечение.Затем стерилизуйте большой кусок pvdc-пленки путем автоклавирования и 70% этанола. Под стереомикроскопом используйте пинцет и скальпель, чтобы вырезать обертку необходимого размера. Поместите обертку на поверхность мозга, оставив aCSF на поверхности.Высасывайте aCSF с края обертывания, позволяя обертке прочно прилипать к поверхности мозга. Обрежьте обертку скальпелем и пинцетом так, чтобы между краем краниального окна и оберткой было примерно одно миллиметровое поле. Как только обертка будет на месте, приклейте край обертывания к черепу биологическим клеем.Дайте клею высохнуть в течение примерно 30 минут. Используя дозатор со смесительным наконечником, нанесите прозрачный силиконовый эластомер поверх обертки. Поместите сверху покровное стекло толщиной от 0,12 до 0,17 миллиметра.Запечатайте периметр покровного стекла водонепроницаемой пленкой, суперклеем или зубным цементом. Сначала смешайте растворы фиброина и AAV в соотношении от одного до четырех в небольшой пробирке. Капните аликвоту раствора на полиэтиленовую пленку для краниального окна и высушите ее не менее трех часов.Затем прикрепите обертку к поверхности мозга, как показано в предыдущем разделе. Проверяйте состояние мышей и окон регулярно, от двух до четырех недель. К этому времени генетически закодированные показатели кальция будут достаточно выражены после создания окна, обработанного AAV.Используя этот протокол, краниальные окна могут поддерживаться у восьми из 10 мышей в течение 10 недель. Широкое окно создается полиэтиленовой пленкой, прозрачным силиконом и закрытым стеклом в трансгенной мыши, экспрессирующей мембранно-закрепленный генетически закодированный показатель кальция в астроцитах. Через это окно была выполнена широкоугольная визуализация кальция, и флуоресцентные изменения наблюдались при применении стимуляции воздушной затяжки к контралатеральным усам.Временной ход изменения флуоресценции в соматосенсорной коре показал корковую активность. Двухфотонная визуализация позволила наблюдать изображения флуоресценции одиночных клеток, специфичные для глиальных клеток. Флуоресцентные изменения, индуцированные сенсорной стимуляцией, наблюдались в отдельных клетках из разных областей коры.Обертка, закодированная AAV, экспрессирующим генетически закодированный индикатор кальция; и фиброин использовался для создания краниального окна. Широкоугольная визуализация кальция показала кортикальную активность, распространяющуюся по коре, вызванную сенсорной стимуляцией через две-четыре недели после операции. Поскольку окно было большим, различные области коры одной и той же мыши были изображены, и флуоресцентные изменения, вызванные сенсорной стимуляцией, были замечены в отдельных клетках.Важно избегать повреждения головного мозга при изготовлении краниального окна. Можно выполнять задачи поведения на мышах с большим краниальным окном. Это позволит изучить взаимосвязь между нейронной активностью и поведением мыши.Этот метод может быть применен к различным исследованиям в области неврологии. Например, его можно использовать для наблюдения за активностью коры во время принятия решений, двигательного бега, а также в массовых моделях черепно-мозговых травм и заболеваний.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

A Большой процедура Боковой Краниотомии для мезомасштабного широкоугольных оптического Визуализация активности мозга

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Аблация нейрональных населения с помощью двух Фотон лазера и его оценки с использованием изображений кальция и поведенческих запись в Zebrafish личинки

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Имплантация краниального окна для повторной визуализации In Vivo у бодрствующих мышей

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

В естественных условиях Хроническая двухфотонная визуализация микроглии в гиппокампе мыши

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...