Name: in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 till SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 till SM, 15KK0340 till ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 till HB och JP17H06313 till KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 till SM, JP19dm0207079 till HB och JP19dm0207080 till KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (till SM), Bidrag för ung forskare från Yamanashi Prefecture (till SM) och Takeda Science Foundation (till SM) och delvis stöds av The Frontier Brain Research Grant från Univ.
Vi tackar N. Yaguchi och K. Okazaki för djurvård och tekniskt bistånd och medlemmar i Kitamura-labbet för hjälpsamma diskussioner.

De experimentella förfarandena godkändes av djurförsökskommittén vid University of Yamanashi. Vildtyp (C57BL/6J, Japan SLC) och transgena möss som uttrycker membranförankrad GECI (Lck-GCaMP6f) i astrocyter användes i denna studie. De transgena mössen erhölls genom att korsa AldH1l1-CreERT2-möss [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, kommersiellt erhållen, se materialtabell] och Flx-Lck-GCaMP6f-möss [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-GCaMP6f)Khak>/J, kommersiellt erhållna] möss. De transgena mössen behandlades med tamoxifen (20 mg/ml) i 5 dagar (0,05 ml/10 g kroppsvikt, i.p.) för att uttrycka GCaMP6f. Alla möss som användes var män och kvinnor minst 4 veckor gamla. Fönstrets schematiska visas i figur 1A, och det kirurgiska ingreppet sammanfattas i figur 1B.
1. Förberedelse för kranial fönsterkirurgi
<ol><li>Bedöva möss med isofluran (induktion: 3%, kirurgi: 1% -1,5%, flödeshastighet: 0,2-0,3 L / min). Bekräfta anestesidjupet genom förlust av svans- eller tåklämreflex. Håll kroppstemperaturen med en värmedyna (36-38 °C). Applicera ögonsalva med en bomullspinne för att förhindra att mössens ögon torkar ut under anestesi.</li>
	<li>Injicera 15% mannitollösning (se materialförteckning) intraperitonealt (3 ml/100 g kroppsvikt). Fäst mushuvudet på en stereotaxisk ram med öronstänger. Ta bort hår från mushuvudet med en rakapparat och hårborttagningskräm.</li>
	<li>Desinficera hudytan med povidon-jod och alkohol tre gånger. Applicera lidokain lokalt för att ge förebyggande analgesi. Ta bort huden över intresseområdet med kirurgisk sax och exponera skallen (storlek: 15 x 15 mm). Om blödning är närvarande, använd en bomullspinne för att stoppa blödningen. OBS: I denna studie avlägsnades huden för att observera prefrontal cortex till den visuella cortexen.</li>
	<li>Ta bort periosteum över den exponerade skallen med hjälp av en mikrocurette och torka skallytan för att fästa huvudplattan ordentligt på skallen med tandcement (se materialtabell) (figur 2B). OBS: Den skräddarsydda huvudplattan skapas med en 3D-skrivare. Designfilen deponeras på Github-lagringsplatsen (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).</li>
	<li>Fäst huvudplattan med tandcement (figur 2C). Vänta minst 20 min tills cementet härdar. Säkra huvudplattan med huvudplattans hållare35.</li>
</ol>2. Gör kranialfönstret
<ol><li>Ta bort den extra cementen över skallen med en tandborr (se Materialförteckning). Var försiktig så att du inte borrar genom benet och skadar hjärnan genom att borra.</li>
	<li>Markera området som ska skäras med en penna och skär i benet med en skalpell. Trubba av skalpellens spets för att säkerställa att spetsen inte tränger in i skallen (kompletterande figur 1). Referera till hjärnatlasen för att avgöra var fönstret ska göras. OBS: För den aktuella studien skapades ett fönster mellan -2 mm och +4 mm från bregma i den anteroposteriora axeln och från sagittal sutur till +3 mm i den mediolaterala axeln, inklusive motoriska, somatosensoriska och visuella kortiker.</li>
	<li>Skrapa benet upprepade gånger med en skalpell för att fördjupa spåret tills benet i området som ska trimmas rör sig bra vid lätt beröring.</li>
	<li>Ta bort det snittade benet med finpincett. Tryck inte in benfliken i hjärnan, vilket kan skada hjärnan (figur 1Ba). OBS: Om blödning observeras efter avlägsnande av benet, applicera omedelbart och aspirera konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF, se materialförteckning) och upprepa denna process tills blödningen slutar. Alternativt kan du placera en hemostatisk gelatinsvamp (cirka 3 mm fyrkantiga kuber) indränkt i ACSF på blödningspunkten.</li>
	<li>Om dura inte tas bort, fortsätt till steg 2.7.</li>
	<li>Ta bort dura mater genom att följa stegen nedan.<ol><li>Ta bort dura, till exempel i följande situationer; transfektion med fibroin-AAV-filmmetod36 och observation av små strukturer såsom dendritiska ryggar.</li>
		<li>Skär dura med en dragen glaspipett med en avsmalnande spets på cirka 10 μm. För att expandera detta snitt över hela fönstret, använd en U-formad nål.</li>
		<li>Ställ in stereomikroskopzoomen på 60-100x och ta bort den avskurna dura mater med ultrafin pincett. Om avlägsnande av dura mater orsakar blödning, skölj med ACSF eller använd en gelatinsvamp för att stoppa blödningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Klipp ut PVDC-omslaget.<ol><li>Sterilisera en stor (till exempel 10 x 15 mm) bit PVDC-omslag (ca 11 μm, se Materialförteckning, figur 2Aa) genom autoklavering och med 70% etanol.</li>
		<li>Under ett stereomikroskop, använd pincett och en skalpell för att klippa ut en omslag av önskad storlek. OBS: Omslagsstorleken måste vara cirka 10 mm större än kranialfönstrets storlek men mindre än huvudplattans öppning. För ett 6 x 3 mm 2 kranialfönster, förbered en 15 x 10 mm2 wrap.</li>
	</ol></li>
	<li>Placera omslaget korrekt enligt stegen nedan.<ol><li>Placera omslaget på hjärnytan och lämna ACSF på ytan. Sug ut ACSF från lindningens kant, så att omslaget fastnar ordentligt på hjärnytan (figur 1Bb,c). OBS: Omslaget som används är rynkbeständigt, så att bara placera det på hjärnans yta ger nästan inga rynkor.</li>
		<li>Putsa omslaget med en skalpell och pincett så att det finns ungefär 1 mm marginal mellan kranialfönstrets kant och omslaget (figur 1Bd).</li>
		<li>När omslaget är på plats, limma lindens kant på skallen med ett biologiskt lim (se materialtabell, figur 2D). Låt limmet torka i ca 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicera den transparenta silikonelastomeren.<ol><li>Applicera den kommersiellt tillgängliga transparenta silikonelastomeren (se materialtabell) ovanpå omslaget med en dispenser med en blandningsspets (figur 1Be, 2A b-d) och placera täckglaset (0,12-0,17 mm tjocklek) ovanpå (figur 2E).</li>
		<li>Försegla täckglasets omkrets med vattentät film, superlim eller tandcement (figur 1Bf).</li>
	</ol></li>
	<li>Efter operationen, övervaka musen tills den återfår medvetandet för att upprätthålla sternal recumbency. Därefter håller du mössen individuellt och låter dem återhämta sig i sin hembur i minst 7 dagar.<ol><li>För att minska stress och smärta, administrera antiinflammatoriska och smärtstillande medel (t.ex. dexametason och ketoprofen, 5 mg / kg vardera, i.p.).</li>
	</ol></li>
	<li>Övervaka mössen regelbundet för infektion. Om en infektion bekräftas, administrera ett antimikrobiellt läkemedel (t.ex. 10 % enrofloxacin, 1,7 μl/ml) i dricksvattnet tills infektionen har eliminerats (vanligtvis mindre än 4 veckor).</li>
</ol>3. Gör AAV-film på plastfolie med fibroinlösning
OBS: Steg 3 är valfritt.
<ol><li>Förbered fibroinlösning från silkesmaskkokonger enligt en tidigare publicerad metod37.<ol><li>I korthet, koka kommersiellt tillgängliga normala silkesmaskkokonger (5 g, se materialtabell) i natriumkarbonatlösning (0,02 M, 2 L). Tvätta kokongerna i ultrarent vatten och torka över natten.</li>
		<li>Lös upp de torkade kokongerna i litiumbromidlösning (9,3 M, 20 % w/v fibroin) under upphettning i ugn vid 60 °C i 4 timmar. Dialysera den upplösta kokonglösningen, centrifugera (två gånger vid 12 700 x g, vid 4 °C i 20 min)37 och samla upp supernatanten.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered fibroin-AAV-filmen genom att följa stegen nedan.<ol><li>Blanda fibroin och AAV-lösningar20 i förhållandet 1:4 i ett litet provrör med användning av en mikropipett. Släpp en alikvot av den blandade fibroin-AAV-lösningen på plastfolien för kranialfönstret och torka den i minst 3 timmar. OBS: För uttryck i ett område med en diameter på 3 mm, applicera en 5 μL droppe fibroin-AAV-lösning. Detta förhållande bestämmer mängden lösning för ett visst område.</li>
		<li>Efter torkning, skär plastfolien i önskad storlek för fönstret (till exempel 10 x 15 mm) och placera den på hjärnytan. Följ sedan ovannämnda metod från steg 2.8.1 och framåt. OBS: Innan du placerar omslaget på hjärnytan, ta bort ACSF på hjärnytan så mycket som möjligt. Detta beror på att ACSF förväntas lösa upp fibroin-AAV-filmen och minska koncentrationen av AAV-partiklar.</li>
		<li>Vänta cirka 2-4 veckor efter att du har skapat det AAV-behandlade fönstret tills GECIs uttrycks tillräckligt. Under denna process, kontrollera mössens och fönstrens tillstånd regelbundet.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kalciumavbildning och analys
OBS: För detaljer om avbildning och analys, se tidigare publicerade rapporter 1,2,38.
<ol><li>Utför bredfältsavbildning enligt stegen nedan.<ol><li>Immobilisera musen med hjälp av en huvudfixeringsanordning under ett tandemlinsfluorescensmakroskop (se materialförteckning).</li>
		<li>Belys hjärnbarken hos möss med excitationsljus från en 465 nm LED-ljuskälla genom ett excitationsfilter, dikroisk spegel, och objektivlins.</li>
		<li>Samla fluorescensbilderna av hjärnbarken med en CCD-kamera genom en objektivlins (1,0x), dikroisk spegel, emissionsfilter och bildlins (2,0x). Kombinationen av dessa linser ger en total förstoring på ca 0,5x.</li>
		<li>Hämta bilder med en samplingsfrekvens på 50 Hz. Efter datainsamling, analysera bilderna med ImageJ-programvaran. Välj intresseområde (ROI) manuellt. Beräkna fluorescensförändring i varje ROI som ΔF / F = (Ft - F0) / F0, där Ft är det råa fluorescensvärdet för varje ram och F0 är det genomsnittliga fluorescensvärdet som erhålls från en genomsnittlig bild av alla ramar. Ett makroprogram för ImageJ deponeras på GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), som beräknar ΔF/F-bilder från kalciumavbildningsdata.</li>
	</ol></li>
	<li>Utför tvåfotonavbildning enligt stegen nedan.<ol><li>Immobilisera musen under ett tvåfotonmikroskop med hjälp av en huvudfixeringsanordning. Identifiera området som ska avbildas med mikroskopet i ljusfältsläge med en objektivlins med låg förstoring (5x).</li>
		<li>Byt till tvåfotonavbildning. Använd en objektivlins med hög förstoring (16x eller 25x) och belys lasern för tvåfotonexcitation. OBS: Grön Lck-GCaMP6f22 och röd XCaMP-R36 exciterades av en ultrasnabb laser vid excitationsvåglängder på 920 nm respektive 1070 nm.</li>
		<li>Skaffa fluorescensbilder vid 30 Hz. Efter datainsamling, korrigera rörelseartefakter genom registreringsfunktionen för suite2p-programvaran39. Hämta ROI och ΔF/F från bilder med samma metod för avbildning med brett fält.</li>
	</ol></li>
	<li>Rita data med python med följande bibliotek: NumPy, Matplotlib och Pandas (se Materialförteckning).</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Den här artikeln presenterar en billig metod för att skapa ett stort kranialfönster med en PVDC-plastfolie, transparent silikon och täckglas. Med hjälp av denna metod visade vi att kalciumavbildning med brett fält kunde utföras över ett brett område av hjärnbarken. Tvåfotonkalciumavbildning kan utföras från flera olika kortikala regioner i samma mus som har genomgått vidfältsavbildning. Dessutom har det visat sig att en fibroin-AAV-film på plastfolien som används för fönstret kan uttrycka GECI över ett brett område av cortex.
Kritiska steg Det är viktigt att undvika infektion och skador på hjärnan när man gör kranialfönster med plastfolie. Under dessa förhållanden kan neural och glial aktivitet inte observeras, och avbildning av djupare områden är omöjlig. Skador på blodkärlen resulterar också i blödning, vilket gör avbildning omöjlig på grund av blod. För att undvika infektion är det viktigt att göra hjärnytan och omslaget fäst så tätt som möjligt genom att suga ut ACSF. Mannitol administrering är viktigt för att undvika skador på hjärnan och blodkärlen genom att förhindra ökat hjärntryck under operationen. Detta upprätthåller utrymmet mellan hjärnans yta och dura mater och förhindrar att hjärnan och blodkärlen berörs under avlägsnandet av skallen och dura mater. Ett stereomikroskop med hög förstoring och pincett med skarpa spetsar är också effektiva för noggrann operation.
I fibroin-AAV-metoden är det viktigt att använda köttsilkesmaskkokonger, att inte frysa fibroinlösning, att torka fibroin-AAV-lösningen tillräckligt och att applicera tillräcklig volym lösning (5 μL per 3 mm diameter). När äldre kokonger användes var uttryckseffektiviteten lägre. Detta beror på att fibroin från gamla kokonger lätt kan denatureras. När fibroinlösningen frystes vid -80 °C och tinades vid användningstillfället var uttryckseffektiviteten dålig. Detta kan bero på denatureringen av proteinet på grund av frysning och upptining. Eftersom fibroinlösningar som lagras vid 4 °C kan användas effektivt fram till gelering rekommenderas att fibroinlösningar hålls kylda och renade från kokonger igen efter gelering. Fibroin-AAV-lösningen bör torkas i minst 3 timmar, eftersom uttrycket är dåligt efter mindre än 3 timmar. Slutligen beror uttrycksområdet på mängden fibroin-AAV-lösning som används. I exemplet i figur 3M var mängden liten (5 μL); Således täckte fibroin-AAV-filmen endast den övre halvan av fönstret, vilket resulterade i ojämnt uttryck över fönstret. Om en tillräcklig mängd fibroin-AAV används kommer uttrycket att vara enhetligt över hela fönstret.
Modifieringar av tekniken Den nya kranialfönstertekniken gör det möjligt för en att undersöka den makroskopiska aktiviteten hos kortikala kretsar och deras underliggande aktivitet på encellsnivå i samma mus. Således kan metoden tillämpas på en mängd olika neurovetenskapliga studier. Det kan till exempel användas för att observera kortikal aktivitet under beslutsfattande uppgifter, motorisk inlärning och i musmodeller av hjärnskada och sjukdom. Vi tror också att metoden kan tillämpas inte bara på gnagare utan också på icke-mänskliga primater.
Detta papper visar att det stora kranialfönstret är effektivt för avbildning av transgena möss och möss injicerade med AAV som uttrycker funktionella proteiner. I synnerhet visas att fibroin-AAV-filmen på omslaget är mycket enklare än en konventionell AAV-injektionsmetod för att uttrycka GECIs över det breda området av cortex. Med hjälp av en blandning av två AAV som kodar för GECIs i olika färger41 kan korrelationen mellan neuron och glialcellsaktivitet samtidigt avbildas över ett brett område av cortex. Dessutom kan fibroin-AAV-filmmetoden också tillämpas på andra genetiskt kodade biosensorer 42,43,44,45,46,47.
Det större kranialfönstret, som kan avbilda båda halvklotet, är också möjligt. Tvåfotonmikroskop med ett mycket bredare synfält (~ 25 mm2) har nyligen utvecklats 25,26,27,28,29. Genom att kombinera denna tvåfotonavbildningsteknik med en-foton-bredfältsavbildning med hjälp av det breda kranialfönstret som beskrivs här kan vi undersöka förhållandet mellan befolkningsaktivitet och encellsaktivitet från oöverträffade skalor.
Begränsningar Matförpackningen tillåter inga ämnen att passera igenom. Detta gör metoden svår att använda för farmakologiska experiment. Det är också svårt att ta bort omslaget, vilket gör det omöjligt att sätta in en glaspipett eller elektrod. Därför är det svårt att genomföra experiment i kombination med andra metoder såsom samtidig kalciumavbildning och elektrofysiologiska inspelningar och lokal administrering av läkemedel med hjälp av en glaspipett. En möjlig lösning för dessa begränsningar är att använda omslaget och glasfönstret med ett hål. Detta ger tillgång till hjärnan via en glaspipett eller en inspelningselektrod samtidigt som kranialfönstret hålls sterilt under en lång period48.

Bredfältskalciumavbildning undersöker effektivt det spatiotemporala aktivitetsmönstret över ett stort område av djurhjärnan 1,2,3. Vidfältsavbildning har använts i stor utsträckning för att observera gnagares hela kortikala yta eftersom deras cortex är relativt platt 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgena möss eller möss injicerade med adenoassocierat virus (AAV), som specifikt uttrycker GECI i olika celler såsom neuroner och gliaceller, kan användas för bredfältkalciumavbildning11,12,13. Den rumsliga upplösningen av denna teknik är emellertid vanligtvis inte tillräcklig för att lösa aktiviteten hos enskilda celler in vivo14. Det är inte heller lämpligt för avbildning av celler som ligger i djupare lager.
Å andra sidan kan tvåfotonkalciumavbildning observera aktiviteten hos flera celler samtidigt med subcellulär rumslig upplösning, vilket möjliggör observation av aktiviteten hos enskilda celler även i neuronala dendriter och glialprocesser 15,16,17,18,19,20,21,22. Det kan också observera celler i djupare lager av hjärnbarken23,24. Även om de senaste tekniska framstegen inom tvåfotonmikroskopi möjliggör avbildning från millimeterbreda kortikala regioner 25,26,27,28,29, är det fortfarande svårt att observera ett område som kan jämföras med bredfältsavbildning genom tvåfotonavbildning.
För att förstå den fysiologiska relevansen av hjärnaktivitet från encell till hel hjärna är det viktigt att överbrygga klyftan mellan aktiviteten hos kortikala regioner över hela cortex och den vid encellsupplösning i lokala neurala kretsar. Därför är en kombination av bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildning utförd i samma mus särskilt effektiv. För att förverkliga detta måste ett brett och stabilt kranialfönster skapas, helst under en lång period.
Tidigare har flera tekniker för att tillverka kranialfönster utvecklats för att möjliggöra bredfälts- och tvåfotonavbildning i samma mus30,31. Trapetsformade täckglasfönster (kristallskalle), som är gjutna i form av den kortikala ytan för att ersätta det borttagna benet, tillåter optisk åtkomst över hela cortex32. Alternativt kan polymerbaserade kranialfönster tillverkas med polyetentereftalat (PET)33 eller polyetenoxidbelagda amorfa fluorpolymerer nanoark34. Varje metod har visat sig upprätthålla ett stabilt fönster i mer än 1 månad. Att producera dessa fönster är dock inte lätt, och de material och utrustning som används är ofta dyra.
Den aktuella studien beskriver en ny metod för att göra ett stort kranialfönster med PVDC-filmen (plastmatfolie) (figur 1). Med hjälp av detta fönster kan in vivo bredfälts- och tvåfotonavbildningsexperiment utföras i samma möss. Det har också visats att GECIs kan uttryckas i neuroner över ett brett område av cortex hos möss genom att bilda ett tunt lager film som innehåller AAV-partiklar på omslaget.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde phosphate buffer solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>High speed recording software: HSR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Vibrio Technologies</td>
			<td>scanImage</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (artificial cerebrospinal fluid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF aspiration needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives for biological use</td>
			<td>Daiichi Sankyo</td>
			<td>Aron Alpha-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Shinano seisakusho</td>
			<td>SN-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>pentobarbital</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary ear bar</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EB-5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>MiCAM02-HR</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl polysiloxane</td>
			<td>GC</td>
			<td>Exaclear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>ORCA-spark</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>18 x 18 NO.1</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ddialysis cassette</td>
			<td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>Super-Bond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Nakanishi</td>
			<td>VOLVERE Vmax</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital scale</td>
			<td>Dretec</td>
			<td>KS-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td>
			<td>0.1 &#181;m</td>
			<td>Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 11252-20</td>
			<td>thin-tipped, for removal of dura mater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KFI</td>
			<td>K-7, No.J 18-8</td>
			<td>for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin for hemostasis</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Spongostan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Iwaki seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Reckitt Japan</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixing device</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plate</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software (for calcium imaging data analysis)</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Hayashi-repic</td>
			<td>LA-HDF108AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td>LEX2-LZ4-B</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol solution (15% with saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Brain vision</td>
			<td></td>
			<td>For wide-field calcium imaging of GCaMP6f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>For wide-field calcium imaging of XCaMP-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MOM</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>DTK-1000N</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing tip</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (30 G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylens spoids</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4656-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene chloride (PVDC) film</td>
			<td>Asahi Kasei</td>
			<td>Asahi Wrap (or Saran Wrap)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Isodine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python libralies</td>
			<td></td>
			<td>NumPy</td>
			<td>package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Matplotlib</td>
			<td>library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pandas</td>
			<td>data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dispensers</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silkworm cocoon</td>
			<td>Satoyama Craft News</td>
			<td></td>
			<td>https://sato-yama.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant</td>
			<td>NACALAI TESQUE</td>
			<td>TritonX</td>
			<td>Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>No. 91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for mannitol injection</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdermal anesthetic</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The mice were obtained by the following method. 
			AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) 
			Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes 
			Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) 
			Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. 
			A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable ultrafast lasers</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight X3</td>
			<td>For two-photon calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof film</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>BFR5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Male and femalek, &#62;4 weeks old</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo wide-field and two-photon calcium imaging from a mouse using a large cranial window

Bredfältkalciumavbildning från musens neocortex gör att man kan observera cortexomfattande neural aktivitet relaterad till olika hjärnfunktioner. Å andra sidan kan tvåfotonavbildning lösa aktiviteten hos lokala neurala kretsar på encellsnivå. Det är viktigt att göra ett stort kranialfönster för att utföra analys i flera skalor med båda bildteknikerna i samma mus. För att uppnå detta måste man ta bort en stor del av skallen och täcka den exponerade kortikala ytan med transparenta material. Tidigare har glasskallar och polymerbaserade kranialfönster utvecklats för detta ändamål, men dessa material är inte lätt att tillverka. Detta protokoll beskriver en enkel metod för att göra ett stort kranialfönster bestående av kommersiellt tillgänglig polyvinylidenklorid (PVDC) omslagsfilm, en transparent silikonplugg och ett täckglas. För avbildning av dorsalytan på en hel halvklot var fönsterstorleken cirka 6 x 3 mm2. Svåra hjärnvibrationer observerades inte trots ett så stort fönster. Det är viktigt att hjärnytans tillstånd inte försämrades i mer än en månad. Wide-field imaging av en mus som uttrycker en genetiskt kodad kalciumindikator (GECI), GCaMP6f, speciellt i astrocyter, avslöjade synkroniserade svar på några millimeter. Tvåfotonavbildning av samma mus visade framträdande kalciumsvar hos enskilda astrocyter under flera sekunder. Vidare applicerades ett tunt lager av ett adenoassocierat virus på PVDC-filmen och uttryckte framgångsrikt GECI i kortikala neuroner över kranialfönstret. Denna teknik är pålitlig och kostnadseffektiv för att göra ett stort kranialfönster och underlättar undersökningen av neural- och glialdynamiken och deras interaktioner under beteende på makroskopiska och mikroskopiska nivåer.

Utvärdering av ett stort kranialfönster tillverkat med PVDC-omslagsmetoderna Omedelbart efter operationen kan framgång eller misslyckande kontrolleras med en överblick av tillståndet hos den kortikala ytan, såsom blödning och färgförändring på grund av skada eller ischemi. En lång tid efter operationen kan den kortikala ytan täckas med ett ogenomskinligt vitt membran på grund av infektion, eller blod kan täcka fönstret på grund av blödning (Figur 2G). I dessa fall kan cortex inte vara i hälsosamt skick, och avbildning kanske inte är möjlig. Dessa kan orsakas av delvis avskurna omslag eller otillräcklig fixering av omslaget av limet. Om infektionen observeras upprepade gånger kan det vara effektivt att applicera antibiotika, till exempel gentamicinsulfat (10 μl, 50 mg / ml), över hjärnytan vid fönsterplacering. Regenerering av hjärnhinnor eller ben ses också när det vertikala gapet mellan den kortikala ytan och omslaget är stort. För att förhindra detta är det viktigt att applicera omslaget så tätt som möjligt på hjärnytan under fönsterförberedelserna. Detta kan uppnås genom att placera plastfolie på hjärnytan och suga ut så mycket ACSF som möjligt. I avsaknad av ACSF kan det göras genom att helt enkelt placera plastfolien på hjärnytan. Hjärnan och blodkärlen är fast beslutna att vara oskadade av det faktum att hjärnans färg inte är missfärgad och blodkärlen inte är avskurna.
Fönstrets livslängd beror till stor del på operationens kvalitet. När tillståndet är bra finns det inga tecken på infektion, blödning eller regenerering mer än 1 månad efter operationen (figur 2F och figur 3B). Hos 8 av 10 möss kunde fönstret hållas klart upp till 10 veckor eller längre. Fönster i två av mössen kunde inte underhållas ordentligt på grund av infektion eller blödning. Även om det stora fönstret kan vara utsatt för mekanisk stress eller påverkan, observerades inte trasiga eller spruckna fönster.
För att utvärdera bildkvaliteten hos det nya kranialfönstret med omslaget, silikonet och glaset jämfördes punktspridningsfunktionen under det nya fönstret med den under det konventionella glasfönstret genom att avbilda 0,1 μm fluorescerande pärlor i agar (se kompletterande fil 1). Resultaten visade ingen skillnad i full bredd vid halv maximum (FWHM) för båda förhållandena. [X-axel (μm): endast glas, 1,99 ± 0,07, omslag, 1,76 ± 0,13, Y-axel (μm): endast glas, 2,11 ± 0,27, omslag, 1,90 ± 0,15, Z-axel (μm): endast glas, 25,29 ± 0,71, omslag, 26,64 ± 1,02, N = 7 pärlor, p > 0,05, Mann-Whitney U-testet, tilläggsfigur 2A,B]. Därför försämrade de nya elementen som tillsattes (omslag och silikon) inte bildkvaliteten.
Vibrationsartefakter orsakade av andning, hjärtslag och kroppsrörelse finns i vidfälts- och tvåfotonavbildning. För att bestämma hur mycket det nya kranialfönstret vibrerar valdes en liten fluorescerande partikel från in vivo-bilddata med två foton och undersökte hur mycket dess bild rörde sig under 60 s. Det visade sig att standardavvikelsen för centroiden för den fluorescerande partikeln var cirka 0,3 μm, vilket är jämförbart med det under ett konventionellt glasfönster (kompletterande figur 2C). Detta indikerar att eftersom hjärnan hölls nere av en transparent silikonplugg och täckglas, var vibrationerna jämförbara med de som observerades i konventionella mindre fönster, och offline-bildregistrering var tillräcklig för att eliminera vibrationsartefakter.
Vid kalciumavbildning med brett fält kunde den kortikala aktiviteten observeras föröka sig över cortex inducerad av sensorisk stimulering (figur 3A-D, K-N). Tvåfotonavbildning möjliggjorde observation av encelliga fluorescensbilder som är specifika för neuroner och gliaceller (figur 3E,O). Fluorescensförändringar inducerade av sensorisk stimulering kunde observeras i enskilda celler (figur 3E-J, O-T).
Uttryck av genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) i ett brett område av hjärnbarken med PVDC-omslag och AAV PVDC-omslaget för fönstret kan appliceras för att uttrycka funktionella proteiner i ett brett område av cortex. Detta uppnås med hjälp av AAV och fibroin, ett komponentprotein av silkesmaskkokonger som har använts i stor utsträckning som biomaterial37. En tidigare studie visade att fibroin kunde blandas med AAV och bilda filmer implanterade i hjärnan för att uttrycka funktionella proteiner som fotoaktiverbara opsiner eller GECIs36. I den aktuella studien blandades och torkades AAV som uttrycker GECI och fibroin på omslaget, och AAV-belagd wrap användes för kranialfönstret. Detta resulterade i uttrycket av GECI över det breda området av cortex 2-4 veckor efter operationen (Figur 3K-M). Eftersom fönstret var stort kan olika kortikala områden med samma mus avbildas (figur 3M-T).
För att bekräfta uttryckseffektiviteten för denna metod räknades antalet celler som uttrycker GECI i den fasta hjärnan (kompletterande figur 2D). Det visade sig att den nuvarande strategin med användning av omslaget med fibroin-AAV resulterade i uttrycket av GECI med en effektivitet på cirka 20% i både ytliga och djupare lager (L2/3: 20,78%, XCaMP-R-uttryckande cell: 32 celler, DAPI: 154 platser, L5: 20,08%, XCaMP-R-uttryckande cell: 51 celler, DAPI: 254 platser). Således uttryckte denna metod GECIs i celler inte bara i ytskikt utan också i djupare lager.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig01.jpg"> Figur 1: Konceptuellt diagram över det stora kranialfönstret . (A) Vänster, schematisk ritning av det nya kranialfönstret. Det är större än det konventionella fönstret (3 mm diameter). Höger, tvärsnittsvy. Metoden för att göra ett stort kranialfönster använder matomslag, transparent silikonelastomer och täckglas, vilket möjliggör bredfälts- och tvåfotonavbildning från samma mus. (B) Förfarande för tillverkning av kranialfönster: a) Borttagning av ben. b) Avlägsnande av ACSF under omslaget. c) Fasthållande av omslaget på hjärnytan genom avlägsnande av ACSF. d) Skär bort det överflödiga omslaget. e) Applicering av transparent silikon. f) Anbringande av täckglas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig02.jpg"> Figur 2: Översikt över kranialfönsterkirurgi . (A) Material och utrustning som krävs för kranialfönstret. a) Inplastningsfilm av polyvinylidenklorid (PVDC). b) En dispenser av transparent silikonelastomer med blandningsspets. c) Täckglas. d) Genomskinlig silikon placerad mellan två delar av täckglaset. (B) Fotografi av mushuvudhud som är snittad för att exponera skallen. Musen bedövades och mushuvudet immobiliserades med öronstänger. Huvudet avhårades sedan, behandlades med lokal analgesi och huden skars. (C) Fotografi efter installation av en huvudplatta. En huvudplatta (gjord av harts från en 3D-skrivare) fästes på musens huvud med tandcement. (D) Fotografi av ett kranialfönster. Kranialfönstret skapades i cortexen på mushjärnans högra halvklot. Dura mater togs bort och omslaget limmades på plats. (E) Ett foto av fönstret av omslaget med det genomskinliga silikonet och täckglaset ovanpå. (F) Ett typiskt exempel på ett framgångsrikt fönster (höger halvklot, 7 veckor efter operationen). (G) Exempel på misslyckat fönster (båda halvklotet, 5 veckor efter operationen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig03.jpg"> Figur 3: Det stora fönstret tillåter bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildning från samma mus. (A) Kalciumavbildning utfördes i en transgen mus som uttrycker membranförankrad GECI (Lck-GCaMP6f) i astrocyter40. (B) Till vänster skapades ett stort fönster med plastfolie, transparent silikon och täckglas. Wide-field imaging utfördes genom detta fönster. Rätt, ett foto togs 79 dagar efter installationen av kranialfönstret. (C) När luftpuffstimulering applicerades på de kontralaterala morrhåren observerades fluorescensförändringar. (D) Tidsförloppet för fluorescensförändringen i den somatosensoriska cortexen (röd fyrkant i C) plottades. Röda och blå staplar indikerar luftpufftiming och "före", "under" respektive "efter" timing i (C). (E) Synfältet (FOV 1 i C) för tvåfotonkalciumavbildning. Eftersom GCaMP6f uttrycktes för att lokalisera till membranet placerades regionerna av intresse (vita rutor) manuellt för att detektera det lokala svaret i astrocytprocesser. (F) Fluorescensförändringarna i de färgade rutorna i (E) plottas. (G) Fluorescensförändringarna i alla kvadrater av (E) plottas. Horisontella och vertikala axlar anger tid respektive cellnummer. (H-J) Data för FOV 2 (i synbarken) i (C) visas. Synfält 2 avbildades efter avbildningen i synfält 1. (K) Röd GECI, XCaMP-R, uttrycktes i nervceller med fibroin-AAV-metoden i vildmusen. (L) Fotografi fångat två veckor efter operationen där fönstret skapades med hjälp av fibroinfilmen. (M) Bredfältskalciumavbildning utfördes på denna mus. (N) Den fluorescensförändring som framkallades av morrhårsstimulering plottades från den mest framträdande platsen (somatosensorisk cortex, röd kvadrat i (M)). Röda och blå linjer indikerar luftpufftiming och "före" respektive "under" timing i (M). (O) Synfält (somatosensorisk cortex, FOV 1 tum (M)) av tvåfotonkalciumavbildning vid 300 μm djup. ROI placerades manuellt på neuronal somata. (P) Fluorescensförändringarna i de färgade rutorna i (O) plottas. (Q) Fluorescensförändringarna i alla kvadrater av (O) plottas i färg. (R-T) Data för FOV 2 i (M) som ligger i parietal cortex visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: Tips för skalpeller. Spetsen på den nya skalpellen (topp) jämfört med skalpellen som används för att skära skallen med en trubbig spets (botten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: Validering av det nya kranialfönstret och fibroin-AAV-uttrycksmetoden. (A) Fluorescensintensitetsprofil för 0,1 μm fluorescerande pärlor i agar. Den övre raden visar data från ett tillstånd där endast täckglas placerades över fluorescerande pärlor blandade i agar, och den nedre raden visar data från ett tillstånd där omslag, transparent silikon och täckglas placerades. De grå spåren visar den gaussiska passformen till fluorescensintensitetsprofilen för varje pärla, och de röda spåren visar deras medelvärden (n = 7). B) Sammanfattning av uppgifterna i punkt A. Varje diagram visar hela bredden vid halv maximum (FWHM) för punktspridningsfunktionen på XYZ-axeln. Det grå diagrammet visar data för varje pärla och det röda visar deras medelvärde och standardfel. (C) Från 2 000 bilder (60 s-inspelning) av in vivo-bilddata valdes en liten fluorescerande partikel och undersökte hur mycket bilden rörde sig under 60-talet. Den fluorescerande bilden i mitten representerar genomsnittet av 2 000 bildrutor. Bilderna projicerades genom medelvärde i X- och Y-axelns riktningar. Histogrammen visar fördelningen av centroiden i varje ram. Centroidens standardavvikelser var X: 0,36 och Y: 0,315 μm. (D) Exempel på GECI-uttryck med fibroin-AAV-metoden. Vänster: En bit hjärnbark tillämpade fibroin-AAV-uttrycksmetoden. Rött och blått indikerar fluorescens från XCaMP-R respektive DAPI; XCaMP-R uttrycktes inte bara i lager 2/3-celler utan också i lager 5-celler. Mitten och höger. Förstorade vyer av lagren 2/3 respektive 5 i den vänstra figuren (cyanrutor). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 1: (A) Omslagets uttryckseffektivitet med fibroin-AAV-filmmetoden och (B) Utvärdering av punktspridningsfunktionen under tvåfotonavbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20File%201_FINAL.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window at JoVE.com

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Detta protokoll beskriver att göra ett stort (6 x 3 mm2) kranialfönster med matfolie, transparent silikon och täckglas. Detta kranialfönster tillåter in vivo bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildningsexperiment i samma mus.

In vivo Bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildning från en mus med ett stort kranialfönster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Detta protokoll visar en skapelse av ett stort kranialfönster för att mäta vidfälts- och encellsbokningsaktiviteter i samma mus. Med vår metod kan stort och stabilt kranialfönster tillverkas med matförpackning till låg kostnad. Denna metod är effektiv för att studera neurala och gliala aktiviteter under beteende på makroskopiska och mikroskopiska nivåer.Det rekommenderas att börja med ett litet kranialfönster. Sedan om det lyckas, öka storleken på fönstret. Börja med att ta bort den extra cementen över skallen med en tandborr.Markera området som ska skäras med en penna. Skär i benet med en skalpell med en trubbig spets för att säkerställa att spetsen inte tränger in i skallen. Skrapa benet upprepade gånger med en skalpell för att fördjupa spåret tills benet i området som ska trimmas rör sig vid lätt beröring.Ta bort det snittade benet med finpincett. Var försiktig så att du inte trycker in benfliken i hjärnan vilket kan skada hjärnan. För att ta bort dura mater, skär dura med en dragen glaspipett med en avsmalnande spets på cirka 10 mikrometer.Använd en U-formad nål för att expandera detta snitt över hela fönstret. Under ett stereomikroskop inställt på 60 till 100x zoom, ta bort den avskurna dura mater med ultrafin pincett. Vid blödning, Skölj med aCSF eller använd en gelatinsvamp för att stoppa blödningen.Sterilisera sedan en stor bit PVDC-omslag genom autoklavering och med 70% etanol. Under ett stereomikroskop, använd pincett och en skalpell för att klippa ut en omslag av önskad storlek. Placera omslaget på hjärnytan medan du lämnar aCSF på ytan.Sug ut aCSF från kanten av omslaget, så att omslaget fastnar ordentligt på hjärnytan. Trimma omslaget med en skalpell och pincett så att det finns ungefär en millimeters marginal mellan kanten på kranialfönstret och omslaget. När omslaget är på plats, limma kanten av omslaget på skallen med ett biologiskt lim.Låt limet torka i cirka 30 minuter. Använd en dispenser med en blandningsspets och applicera en transparent silikonelastomerare ovanpå omslaget. Placera täckglaset med tjockleken 0,12 till 0,17 millimeter ovanpå.Försegla täckglasets omkrets med vattentät film, superlim eller tandcement. Blanda först fibroin- och AAV-lösningar i ett förhållande ett till fyra i ett litet provrör. Släpp en alikvot av lösningen på plastfolien för kranialfönstret och torka den i minst tre timmar.Fäst sedan omslaget på hjärnytan som visas i föregående avsnitt. Kontrollera mössens och fönstrens tillstånd regelbundet, två till fyra veckor. Vid denna tidpunkt kommer de genetiskt kodade kalciumindikatorerna att uttryckas tillräckligt efter att ha skapat det AAV-behandlade fönstret.Med hjälp av detta protokoll kan kranialfönster bibehållas hos åtta av 10 möss i upp till 10 veckor. Ett brett fönster skapas med plastfolie, transparent silikon och täckglas i en transgen mus som uttrycker membranförankrad genetiskt kodad kalciumindikator i astrocyter. Bredfältskalciumavbildning utfördes genom detta fönster och fluorescensförändringar observerades när luftpuffstimulering applicerades på de kontralaterala morrhåren.Tidsförloppet för fluorescensförändringen i den somatosensoriska cortexen visade kortikal aktivitet. Tvåfotonavbildning möjliggjorde observation av encelliga fluorescensbilder som är specifika för gliaceller. Fluorescensförändringar inducerade av sensorisk stimulering observerades i enskilda celler från olika kortikala regioner.Wrap kodad med AAV som uttrycker genetiskt kodad kalciumindikator, och fibroin användes för att göra kranialfönstret. Bredfältskalciumavbildning visade kortikal aktivitet som förökade sig över cortex inducerad av sensorisk stimulering två till fyra veckor efter operationen. Eftersom fönstret var stort avbildades olika kortikala områden hos samma mus och fluorescensförändringar inducerade av sensorisk stimulering sågs i enskilda celler.Det är viktigt att undvika skador på hjärnan när man gör kranialfönster. Man kan utföra beteendeuppgifter på möss med ett stort kranialfönster. Detta gör det möjligt att undersöka förhållandet mellan neural aktivitet och musbeteende.Denna metod kan tillämpas på en mängd olika neurovetenskapliga studier. Det kan till exempel användas för att observera kortikal aktivitet under beslutsfattande uppgifter, motorkörning och i massmodeller av hjärnskada och sjukdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

En tunn-skalle Fönster Teknik för kronisk två-photon In vivo Imaging av murina mikroglia i modeller av Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Dendritutskotten i mus Cortex Använda en förtunnad-skalle Förberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Ett stort Lateral Kraniotomi Förfarande för Mesoskalig Wide-field optisk avbildning av hjärnans aktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation av neuronala invånare använder en två-photon Laser och sin bedömning med kalcium Imaging och beteendemässiga inspelning i zebrafiskar larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillär tvåfotoner in vivo-avbildning av musens näthinna

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation av ett kranialfönster för upprepad in vivo-avbildning hos vakna möss

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...