Name: measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice
Uploaded: 2022-07-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice at JoVE.com

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen 12075330 und U1932165) und der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Förderkennzeichen 2020A1515010270) unterstützt.

1. Herstellung und Montage des akustofluidischen Mikrogeräts
<ol><li>Herstellung des mikrofluidischen Chips.<ol><li>Entwerfen Sie einen Einkanalchip mit nur einem Ein- und Auslass, wie in Abbildung 1 dargestellt. Für Messzellen ist der rechteckige Querschnitt des Mikrokanals bei 740 μm Breite und 100 μm Tiefe zu halten. Um den Zellkern zu messen, ändern Sie die Breite und Tiefe des Mikrokanals auf 250 μm bzw. 100 μm.</li>
		<li>Bereiten Sie den Mikrokanal auf Silizi...

<ol>
	<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Frame, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+confers+radiosensitivity+to+prostate+stem-like+cells.">HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells.</a> British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).</li><li>Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+mapping+of+live+cells+by+multiple-particle-tracking+microrheology.">Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).</li><li>M&#246;ller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafine+particles+cause+cytoskeletal+dysfunctions+in+macrophages:+role+of+intracellular+calcium.">Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium.</a> Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+magnetic+tweezer+system+for+intraembryonic+navigation+and+measurement.">A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement.</a> IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).</li><li>Machida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+manipulation+of+intracellular+stress+fibres+using+a+hook-shaped+AFM+probe.">Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe.</a> Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).</li><li>Bufi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+immune+cells+exhibit+distinct+mechanical+properties+that+are+modified+by+inflammation.">Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li><li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration.">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li><li>Jung, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionising+radiation+induces+changes+associated+with+epithelial-mesenchymal+transdifferentiation+and+increased+cell+motility+of+A549+lung+epithelial+cells.">Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells.</a> European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).</li><li>Hartono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+measurements+of+cell+compressibility+via+acoustic+radiation.">On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation.</a> Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).</li><li>Sitters, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+force+spectroscopy.">Acoustic force spectroscopy.</a> Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).</li><li>Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-acoustic+focusing+of+cells+for+size-insensitive+acousto-mechanical+phenotyping.">Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping.</a> Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).</li><li>Cushing, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+characterization+of+microbead+and+cell+suspensions+by+speed+of+sound+measurements+of+neutrally+buoyant+samples.">Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples.</a> Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).</li><li>Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+cells+and+microspheres+sorted+by+acoustophoresis+with+in-line+resistive+pulse+sensing.">Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing.</a> Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).</li><li>Petersson, F., Aberg, L., Sw&#228;rd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flow+acoustophoresis:+microfluidic-based+mode+of+particle+and+cell+separation.">flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation.</a> Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschl&#228;ger, M., Weichhart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+gradient+centrifugation:+a+flexible+method+for+the+isolation+of+nuclei+from+primary+cells.">Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).</li><li>Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+compressibility+changes+during+epithelial-mesenchymal+transition+based+on+acoustofluidic+microdevice.">Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice.</a> Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+DNA+damage+responses+affect+cell+compressibility.">Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+single+cells:+Measurement+methods+and+applications.">Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications.</a> Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).</li><li>Yousafzai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+neighboring+cells+on+cell+stiffness+measured+by+optical+tweezers+indentation.">Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).</li><li>Wei, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+living+cell+micromechanical+properties+by+oscillatory+optical+tweezers.">A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers.</a> Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).</li><li>Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+properties+of+brain+cancer+cells+using+a+microfluidic+cell+squeezer+device.">Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device.</a> Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).</li><li>Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+recognition+of+counterions+in+ion-exchange+resins.">Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins.</a> Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).</li><li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=detection,+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells.">detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+mobilization+of+circulating+tumour+cells+during+cancer+therapy+cause+metastasis.">Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).</li></ol>

Häufig verwendete zellmechanische Messmethoden sind AFM, Mikropipettenaspiration, mikrofluidische Methoden, Parallelplattentechnik, optische Pinzette, optische Trage und akustische Methoden20. Mikrofluidik-Methoden können mit drei Ansätzen arbeiten: Mikroverengung, Dehnströmung und Scherströmung. Unter ihnen sind optische Stretcher, optische Pinzetten, akustische Methoden, Dehnströmung und Scherströmungsansätze berührungslose Messungen. Im Gegensatz zu Kontaktmessungen können berührungs...

Zellmechanische Eigenschaften spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit 1,2. Um ein tiefes Verständnis der Rolle der zellmechanischen Eigenschaften in dem oben genannten Prozess zu erlangen, ist eine genaue Messung der Zellmechanik von entscheidender Bedeutung, und die Messung sollte keine Schäden an den Zellen für die anschließende Kultur und Analyse verursachen. Der Messprozess sollte so schnell wie möglich sein, da sonst die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt werden kann, wenn Zellen für längere Zeit aus der Kultivierungsumgebung entfernt werden.
Bestehende zellmechanische Messmethoden stoßen auf einige Einschränkungen. Einige Methoden, wie die magnetische Drehzytometrie, die Magnetpinzette und die Partikelverfolgungsmikrorheologie, verursachen Zellschäden durch die Einführung von Partikeln in Zellen 3,4,5. Methoden, die durch Kontakt mit Zellen messen, wie Rasterkraftmikroskop (AFM), Mikropipettenaspiration, Mikrokonstriktion und Parallelplattentechnik, sind ebenfalls anfällig für Zellschäden und der Durchsatz ist schwer zu erhöhen 6,7,8. Darüber hinaus wird ionisierende Strahlung Zellen abflachen und ihre Adhäsion erhöhen9; Es ist daher notwendig, die Ganzzellmechanik in Suspension zu messen.
Als Antwort auf die oben genannten Herausforderungen wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf der akustofluidischen Methode 10,11,12,13,14 basiert. Die Kanalbreite ist auf die akustische Halbwellenlänge abgestimmt, wodurch ein stehender Wellenknoten an der Mittellinie des Mikrokanals entsteht. Unter Einwirkung der akustischen Strahlungskraft können sich die Zellen oder Standardperlen zum akustischen Druckknoten bewegen. Da die physikalischen Eigenschaften der Standardkügelchen (Größe, Dichte und Kompressibilität) bekannt sind, kann die akustische Energiedichte bestimmt werden. Dann kann die Zellkompressibilität durch Aufzeichnung der Bewegungsbahnen von Zellen im akustischen Feld erhalten werden. Eine zerstörungsfreie Hochdurchsatzmessung von Zellen im Suspensionszustand kann erreicht werden. In diesem Beitrag werden das Design des mikrofluidischen Chips, der Aufbau des Systems und die Messschritte vorgestellt. Es wurden verschiedene Arten von Tumorzellen gemessen, um die Genauigkeit der Methode zu überprüfen. Der Anwendungsbereich dieser Methode wurde durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals auf subzelluläre Strukturen (z.B. Kern) erweitert. Darüber hinaus wurden die Veränderungen der Zellkompressibilität nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen untersucht. Die Ergebnisse zeigen die breite Anwendbarkeit dieser Methode als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Korrelation zwischen biochemischen Veränderungen und zellulären mechanischen Eigenschaften.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin(1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 glue</td>
			<td>Evo-bond</td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>lung adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0027</td>
			<td>Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Srum(FBS)</td>
			<td>AUSGENEX</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL247</td>
			<td>colorectal carcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-resistant glass</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>corning</td>
			<td>21-040-cvc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST506</td>
			<td>100mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere&#160;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>The diameter of microshpere is 6.00&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide(PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184Silicone ELASTOMER</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains prepolymers and curing agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice

Die Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit. Während dieser Prozesse ist die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Zellen oft eine Herausforderung. Konventionelle Messmethoden, die auf Kontakt basieren, wie Kompression oder Dehnung, neigen dazu, Zellschäden zu verursachen, was die Messgenauigkeit und die anschließende Zellkultur beeinträchtigt. Messungen im adhärenten Zustand können auch die Genauigkeit beeinträchtigen, insbesondere nach der Bestrahlung, da ionisierende Strahlung Zellen abflacht und die Adhäsion verbessert. Hier wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf einer akustofluidischen Methode basiert. Die Zellkompressibilität kann durch Aufzeichnung der Zellbewegungsbahn unter Einwirkung der akustischen Kraft erreicht werden, wodurch eine schnelle und zerstörungsfreie Messung im suspendierten Zustand realisiert werden kann. In diesem Artikel werden die Protokolle für Chipdesign, Probenvorbereitung, Trajektorienaufzeichnung, Parameterextraktion und -analyse ausführlich beschrieben. Anhand dieser Methode wurde die Kompressibilität verschiedener Tumorzelltypen gemessen. Die Messung der Kompressibilität des Kerns wurde ebenfalls durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals erreicht. In Kombination mit der molekularen Verifikation von Immunfluoreszenzexperimenten wurde die Zellkompressibilität vor und nach dem medikamenteninduzierten epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) verglichen. Weiterhin wurde die Veränderung der Zellkompressibilität nach Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen aufgedeckt. Die in dieser Arbeit vorgeschlagene zellmechanische Messmethode ist universell und flexibel und hat breite Anwendungsperspektiven in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis.

Hier stellte die Arbeit ein Protokoll für den Aufbau eines schnellen und zerstörungsfreien Zellkompressibilitätsmesssystems auf Basis eines akustofluidischen Mikrogeräts vor und demonstrierte dessen Vorteile für die Messung von Zelle und Kern unter verschiedenen Situationen. Abbildung 1 zeigt das Schema des mikrofluidischen Kanals. Die Komponenten und der Aufbau des akustofluidischen Mikrogeräts sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildu...

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Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um ein schnelles und zerstörungsfreies System zur Messung der Zell- oder Kernkompressibilität basierend auf akustofluidischen Mikrogeräten aufzubauen. Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen nach epithelial-mesenchymalem Übergang oder ionisierender Strahlung wurden untersucht, was die Anwendungsperspektive dieser Methode in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis aufzeigt.

Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...

Die Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit. Die akustofluidische Methode kann eine schnelle und zerstörungsfreie Messung in suspendierten Zuständen realisieren. Diese Technik kann verwendet werden, um die Veränderung der Selbstkompressibilität während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs zu spiegeln und zirkulierende Tumorzellen zu trennen, was ihre Anwendungsaussichten in der Krebsdiagnose zeigt.Binden Sie zunächst den PDMS-Block an den Chip, indem Sie mit einer Hohlnadel mit einem Durchmesser von einem Millimeter Löcher in den PDMS-Block für Ein- und Auslassöffnungen stanzen. Dann legen Sie die PDMS-Blöcke und Chip mit der Rückseite nach oben für eine Minute in einen Plasmareiniger. Nachdem Sie die Löcher an den PDMS-Blöcken mit dem Chipeinlass und -auslass ausgerichtet haben, drücken Sie die PDMS-Blöcke 15 Sekunden lang vorsichtig auf den Chip, wodurch eine Verbindung zwischen den PDMS-Blöcken und der Oberfläche des Chips auftritt.Um den PTFE-Katheter mit dem Chip zu verbinden, schneiden Sie zwei Katheter mit einem Innendurchmesser von 0,8 Millimetern und einer Länge von 10 Zentimetern. Biegen Sie eine Edelstahlnadel mit einem Innendurchmesser von 0,7 Millimetern und einer Länge von 1,5 Zentimetern um 90 Grad in eine L-Form und verbinden Sie sie mit einem Ende des Katheters. Führen Sie die Edelstahlnadeln in die Löcher der PDMS-Blöcke ein.Schließen Sie für den Einlass eine 19-Gauge-Dosiernadel als Anschluss für eine Spritze an das andere Ende des Katheters an. Anschließend injizieren Sie entionisiertes Wasser, um die Dichtheit des gesamten Kanals zu testen. Wählen Sie für eine piezoelektrische Keramikbaugruppe vorgeschnittene piezoelektrische Keramikplatten mit einer Breite von fünf Millimetern.Dann schweißen Sie Drähte auf beiden Seiten der piezoelektrischen Keramik an einem Ende. Kleben Sie die piezoelektrische Keramik auf die Mitte der Rückseite des Chips, indem Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf die piezoelektrische Keramik geben. Glätten Sie den Kleber mit dem Zahnstocher und entfernen Sie den überschüssigen Kleber.Drücken Sie dann schnell auf den Chip und drücken Sie etwa eine Minute lang weiter. Um das Mikrogerät zu montieren, schneiden Sie ein Stück PDMS als Basis des Mikrogeräts ab und kleben Sie eine Seite der Basis an die PDMS-Blöcke für den Ein- und Auslass und die andere Seite an einen transparenten Glasobjektträger mit doppelseitigem Klebeband. Befestigen Sie das gesamte Mikrogerät am Mikroskoptisch, um den Chip in einer Fokusebene zu halten.Zur Herstellung der Polystyrol-Standardpartikellösungen werden 0,05 Milliliter Polystyrol-Partikellösung zu 10 Milliliter PBS gegeben und gut gemischt. Dann bereiten Sie die Zellsuspensionen vor, indem Sie die adhärenten Zellen bei 90% Konfluenz mit PBS waschen. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,25 Trypsin für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur hinzu.Nach dem Entfernen des Trypsins einen Milliliter komplettes Medium hinzufügen und durch Pipettieren eine Zellsuspension bilden. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie 0,5 bis einen Milliliter PBS, um eine Zellsuspension zu erhalten.Dann wurden die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und die Konzentration betrug etwa 300 bis 500.000 Zellen pro Milliliter. Nach einer Herstellung der Zellkernsuspension, wie zuvor gezeigt, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter zytoplasmatisches Proteinextraktionsreagenz A pro 20 Mikroliter Zellpalette hinzu und mischen Sie gut. Dann die obige Mischung bei 220 G für fünf Sekunden vortex und für 10 Minuten auf Eisbad legen.Als nächstes fügen Sie der Lösung nach der Inkubation 10 Mikroliter zytoplasmatisches Proteinextraktionsreagenz B hinzu. Nach dem Wirbeln für eine Minute auf das Eisbad legen und fünf Sekunden lang erneut bei 220 G wirbeln. Dann schließlich bei 1000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Palette in einem Milliliter PBS. Dann bei 1000 g bei vier Grad Celsius für vier Minuten zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands in 100 Mikroliter PBS als Zellkernsuspension resuspendieren.Fügen Sie Trypanblau zu der obigen Zellkernsuspension hinzu und färben Sie sie bei Raumtemperatur für vier Minuten. Als nächstes zählen Sie die Anzahl der Kerne unter dem inversen Mikroskop mit einem 10x-Objektiv. Die obige Zellkernsuspension wird mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 200 bis 300.000 Kern pro Milliliter verdünnt.Anschließend filtrieren Sie die Zellkernsuspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb. Um das Messsystem einzurichten, schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops ein und öffnen Sie die Kamerasoftware. Verwenden Sie das 4x-Objektiv, um die mittlere Position des Mikrokanals zu finden, dh die Position der piezoelektrischen Keramik.Nach dem Anschließen der Drähte an die Plus- bzw. Minuspole des Signalgeneratorausgangs der piezoelektrischen Keramik verschweißen. Legen Sie dann die Spritze auf die Mikroinjektionspumpe und verbinden Sie sie mit dem Einlasskatheter. Um die Flüssigkeit aus dem Mikrokanal zu sammeln, platzieren Sie einen kleinen Behälter am Ende des Auslasskatheters.Zur Bestimmung der Messparameter saugen Sie die Polystyrolpartikellösung mit der Spritze ab. Injizieren Sie dann die Lösung in den Chip-Mikrokanal unter Vermeidung von Luftblasen und in den Chip-Mikrokanal, um eine genaue Messung zu gewährleisten. Stellen Sie den Ausgang des Signalgenerators auf ein Vorzeichensignal mit einer Frequenz von einem Megahertz und einer Spitze-zu-Spitze-Spannung von 10 Volt ein, bis beobachtet wird, dass sich die Partikel in Richtung der Mittellinie bewegen und nach Erreichen der Mittellinie in Vorwärtsbewegung entlang der Mittellinie bleiben.Nachdem Sie eine Milliliterzelle oder Kernsuspension mit der Standardpartikellösung im Verhältnis eins zu eins gemischt haben, injizieren Sie sie mit einer Spritze in den Mikrokanal, um Zellen und Kerne zu messen. Starten Sie die Aufnahme mit der CCD-Kamera, wenn die Zellen oder Kerne in das Sichtfeld eintreten und schalten Sie den Signalgenerator ein. Spülen Sie dann den Mikrokanal nacheinander mit entionisiertem Wasser, 75% Alkohol und entionisiertem Wasser für den späteren Gebrauch.Die Bewegung der Zellen und Partikel wurde unter der Wirkung der akustischen Feldkraft in Richtung der Mittellinie des Mikrokanals in verschiedenen Zeitintervallen beobachtet. Die Berechnung von Energie, Dichte und Zellkompressibilität wurde durchgeführt und die akustische Energiedichte und die gemessene Bewegungsbahn für das Partikel wurden aus dem besten Anpassungsergebnis erhalten. Die hochreinen und intakten Kerne wurden aus Zellen isoliert und die Messung der Kompressibilität des Kerns wurde durch die Ermittlung der Bewegungsbahn des Kerns erreicht.Die Kompressibilität verschiedener Krebszelltypen und Zellen nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen wurde gemessen und verglichen. Die gemessenen Zellen wurden gesammelt und es wurde festgestellt, dass es nach 48 Stunden Kultur keinen signifikanten Unterschied in der Zellproliferation und Lebensfähigkeit im Vergleich zur unbehandelten Gruppe gab. Dies deutet darauf hin, dass die Kompressibilitätsmessung keinen Einfluss auf die Zellproliferation und das Überleben hat.Das Wichtigste ist, die Frequenz des Signals zu verfeinern, bis beobachtet wird, dass sich Partikel in Richtung der Mittellinie des Mikrokanals bewegen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Dual Effekte von Melanom Zelle abgeleitet Faktoren auf Knochenmark Adipozyten Differenzierung

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...