Name: measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice
Uploaded: 2022-07-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 12075330 ו- U1932165) והקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מענק מספר 2020A1515010270).

1. ייצור והרכבה של המיקרו-מכשיר האקוסטופלואידי
<ol><li>ייצור השבב המיקרופלואידי.<ol><li>תכנן שבב חד-ערוצי עם כניסה ושקע אחד בלבד, כפי שמוצג באיור 1. למדידת תאים, יש לשמור על החתך המלבני של המיקרו-ערוץ ברוחב של 740 מיקרומטר ובעומק של 100 מיקרומטר. למדידת גרעין התא, שנה את רוחב ...

<ol>
	<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Frame, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+confers+radiosensitivity+to+prostate+stem-like+cells.">HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells.</a> British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).</li><li>Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+mapping+of+live+cells+by+multiple-particle-tracking+microrheology.">Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).</li><li>M&#246;ller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafine+particles+cause+cytoskeletal+dysfunctions+in+macrophages:+role+of+intracellular+calcium.">Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium.</a> Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+magnetic+tweezer+system+for+intraembryonic+navigation+and+measurement.">A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement.</a> IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).</li><li>Machida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+manipulation+of+intracellular+stress+fibres+using+a+hook-shaped+AFM+probe.">Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe.</a> Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).</li><li>Bufi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+immune+cells+exhibit+distinct+mechanical+properties+that+are+modified+by+inflammation.">Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li><li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration.">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li><li>Jung, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionising+radiation+induces+changes+associated+with+epithelial-mesenchymal+transdifferentiation+and+increased+cell+motility+of+A549+lung+epithelial+cells.">Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells.</a> European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).</li><li>Hartono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+measurements+of+cell+compressibility+via+acoustic+radiation.">On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation.</a> Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).</li><li>Sitters, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+force+spectroscopy.">Acoustic force spectroscopy.</a> Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).</li><li>Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-acoustic+focusing+of+cells+for+size-insensitive+acousto-mechanical+phenotyping.">Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping.</a> Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).</li><li>Cushing, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+characterization+of+microbead+and+cell+suspensions+by+speed+of+sound+measurements+of+neutrally+buoyant+samples.">Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples.</a> Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).</li><li>Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+cells+and+microspheres+sorted+by+acoustophoresis+with+in-line+resistive+pulse+sensing.">Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing.</a> Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).</li><li>Petersson, F., Aberg, L., Sw&#228;rd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flow+acoustophoresis:+microfluidic-based+mode+of+particle+and+cell+separation.">flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation.</a> Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschl&#228;ger, M., Weichhart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+gradient+centrifugation:+a+flexible+method+for+the+isolation+of+nuclei+from+primary+cells.">Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).</li><li>Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+compressibility+changes+during+epithelial-mesenchymal+transition+based+on+acoustofluidic+microdevice.">Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice.</a> Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+DNA+damage+responses+affect+cell+compressibility.">Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+single+cells:+Measurement+methods+and+applications.">Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications.</a> Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).</li><li>Yousafzai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+neighboring+cells+on+cell+stiffness+measured+by+optical+tweezers+indentation.">Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).</li><li>Wei, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+living+cell+micromechanical+properties+by+oscillatory+optical+tweezers.">A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers.</a> Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).</li><li>Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+properties+of+brain+cancer+cells+using+a+microfluidic+cell+squeezer+device.">Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device.</a> Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).</li><li>Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+recognition+of+counterions+in+ion-exchange+resins.">Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins.</a> Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).</li><li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=detection,+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells.">detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+mobilization+of+circulating+tumour+cells+during+cancer+therapy+cause+metastasis.">Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).</li></ol>

שיטות מדידה נפוצות במכניקת התא הן AFM, שאיפת מיקרו-פיפטה, שיטות מיקרופלואידיות, טכניקת לוחות מקבילים, פינצטה אופטית, אלונקה אופטית ושיטות אקוסטיות20. שיטות מיקרופלואידיקה יכולות לעבוד עם שלוש גישות: מיקרו-כיווץ, זרימה מאריכה וזרימת גזירה. ביניהם, אלונקה אופטית, פינצטה אופטית, שי...

תכונות מכניות של תאים ממלאות תפקיד חשוב בגרורות סרטניות, טרנספורמציה ממאירה של תאים, ורגישות רדיו-רגישות 1,2. כדי לקבל הבנה מעמיקה של תפקידן של התכונות המכניות של התא בתהליך הנ"ל, מדידה מדויקת של מכניקת התאים היא קריטית, והמדידה לא אמורה לגרום נזק לתאים לצורך תרבית וניתוח עתידיים. תהליך המדידה צריך להיות מהיר ככל האפשר, אחרת הכדאיות של התאים עלולה להיות מושפעת אם תאים מוסרים מסביבת הטיפוח במשך זמן רב.
שיטות המדידה הקיימות של מכניקת התאים מתמודדות עם מגבלות מסוימות. שיטות מסוימות, כגון ציטומטריה של פיתול מגנטי, פינצטה מגנטית ומיקרורולוגיה העוקבת אחר חלקיקים, גורמות נזק לתאים עקב החדרת חלקיקים לתאים 3,4,5. שיטות המודדות על ידי מגע עם תאים, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שאיפת מיקרו-פיפטה, מיקרו-התכווצות וטכניקת לוחות מקבילים, מועדות גם הן לפגיעה בתאים וקשה להגדיל את התפוקה ב-6,7,8. בנוסף, קרינה מייננת תשטח תאים ותגביר את הידבקותם9; לכן יש צורך למדוד מכניקה של תאים שלמים בהשעיה.
בתגובה לאתגרים הנ"ל, פותחה מערכת מדידה של מכניקת התא המבוססת על שיטה אקוסטופלואידית 10,11,12,13,14. רוחב הערוץ מותאם לחצי אורך הגל האקוסטי, ובכך יוצר צומת גל עומד בקו האמצע של המיקרו-ערוץ. תחת פעולה של כוח קרינה אקוסטית, התאים או חרוזים סטנדרטיים יכולים לעבור לצומת הלחץ האקוסטי. מכיוון שהתכונות הפיזיקליות של החרוזים הסטנדרטיים (גודל, צפיפות ודחיסות) ידועות, ניתן לקבוע את צפיפות האנרגיה האקוסטית. לאחר מכן, ניתן להשיג את דחיסות התאים על ידי רישום מסלולי התנועה של תאים בשדה האקוסטי. ניתן להשיג מדידה לא הרסנית בתפוקה גבוהה של תאים במצב השעיה. מאמר זה יציג את העיצוב של השבב המיקרופלואידי, הקמת המערכת ושלבי המדידה. מדידה של סוגים שונים של תאים סרטניים בוצעה כדי לאמת את הדיוק של השיטה. היקף היישום של שיטה זו הורחב למבנים תת-תאיים (כגון גרעין) על ידי התאמת תדר התהודה של הקרמיקה הפיאזואלקטרית ורוחב המיקרו-ערוץ. בנוסף, נחקרו השינויים בדחיסות התאים לאחר EMT הנגרם על ידי תרופות או קרינת רנטגן במינונים שונים. התוצאות מדגימות את הישימות הרחבה של שיטה זו ככלי רב עוצמה לחקר הקשר בין שינויים ביוכימיים לבין תכונות מכניות של תאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin(1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 glue</td>
			<td>Evo-bond</td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>lung adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0027</td>
			<td>Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Srum(FBS)</td>
			<td>AUSGENEX</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL247</td>
			<td>colorectal carcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-resistant glass</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>corning</td>
			<td>21-040-cvc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST506</td>
			<td>100mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere&#160;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>The diameter of microshpere is 6.00&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide(PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184Silicone ELASTOMER</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains prepolymers and curing agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice

מכניקת התאים ממלאת תפקיד חשוב בגרורות סרטניות, טרנספורמציה ממאירה של תאים, ורגישות רדיו. במהלך תהליכים אלה, חקר התכונות המכניות של התאים הוא לעתים קרובות מאתגר. שיטות מדידה קונבנציונליות המבוססות על מגע כגון דחיסה או מתיחה מועדות לגרום נזק לתאים, ומשפיעות על דיוק המדידה ועל תרבית התאים שלאחר מכן. מדידות במצב דבק יכולות גם הן להשפיע על הדיוק, במיוחד לאחר הקרנה מכיוון שקרינה מייננת תשטח תאים ותגביר את ההדבקה. כאן פותחה מערכת מדידה של מכניקת התא המבוססת על שיטה אקוסטופלואידית. ניתן להשיג את דחיסות התא על ידי רישום מסלול תנועת התא תחת פעולת הכוח האקוסטי, אשר יכול לממש מדידה מהירה ולא הרסנית במצב מושעה. מאמר זה מדווח בפירוט על הפרוטוקולים לתכנון שבבים, הכנת דגימה, הקלטת מסלול, חילוץ וניתוח פרמטרים. הדחיסות של סוגים שונים של תאי גידול נמדדה על בסיס שיטה זו. מדידת הדחיסות של הגרעין הושגה גם על ידי התאמת תדר התהודה של הקרמיקה הפיאזואלקטרית ורוחב המיקרו-ערוץ. בשילוב עם אימות ברמה המולקולרית של ניסויים אימונופלואורסצנטיים, הושוו דחיסות התאים לפני ואחרי מעבר אפיתל למעבר מזנכימלי (EMT) המושרה על ידי תרופות. יתר על כן, השינוי של דחיסות התא לאחר קרינת רנטגן עם מינונים שונים נחשף. שיטת המדידה של מכניקת התא המוצעת במאמר זה היא אוניברסלית וגמישה ויש לה סיכויי יישום נרחבים במחקר מדעי ובפרקטיקה הקלינית.

כאן, העבודה הציגה פרוטוקול לבניית מערכת מדידת דחיסות תאים מהירה ולא הרסנית המבוססת על מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי והדגימה את יתרונותיה למדידת תאים וגרעין במצבים שונים. איור 1 מראה את הסכימה של הערוץ המיקרופלואידי. הרכיבים וההרכבה של המיקרו-מכשיר האקוסטופלואידי מוצגים <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice at JoVE.com

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

כאן מוצג פרוטוקול לבניית מערכת מהירה ולא הרסנית למדידת דחיסות התא או הגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי. נחקרו שינויים בתכונות המכניות של תאי הגידול לאחר מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי או קרינה מייננת, המדגימים את סיכויי היישום של שיטה זו במחקר מדעי ובפרקטיקה הקלינית.

מדידת הדחיסות של תאים וגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...

מכניקת התאים ממלאת תפקיד חשוב בגרורות סרטניות, טרנספורמציה ממאירה של תאים, ורגישות רדיו. השיטה האקוסטופלואידית יכולה לממש מדידה מהירה ולא הרסנית במצבים מושהים. טכניקה זו יכולה לשמש לשיקוף השינוי של דחיסות עצמית במהלך אפיתל למעבר מזנכימלי והפרדת תאי גידול במחזור, מראה את סיכויי היישום שלה באבחון סרטן.כדי להתחיל, קשר את בלוק PDMS לשבב על ידי ניקוב חורים בבלוק PDMS עבור יציאות כניסה ויציאה עם מחט חלולה בקוטר מילימטר אחד. ואז לשים את בלוקים PDMS שבב עם הישבן למעלה במנקה פלזמה במשך דקה אחת. לאחר יישור החורים בגושי PDMS עם כניסת השבב ושקעו, לחץ בעדינות על בלוקי PDMS לשבב למשך 15 שניות, וכתוצאה מכך תתרחש הצמדה בין בלוקי PDMS לבין פני השטח של השבב.כדי לחבר את קטטר PTFE לשבב, חותכים שתי חתיכות קטטר בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר ובאורך של 10 סנטימטר. כופפו מחט נירוסטה בקוטר פנימי של 0.7 מילימטר ובאורך של 1.5 ס"מ על 90 מעלות לצורת L וחברו אותה לקצה אחד של הקטטר. הכנס את מחטי הנירוסטה לחורים של בלוקי PDMS.עבור הכניסה, חבר מחט חלוקה של 19 מד לקצה השני של הקטטר כמחבר למזרק. לאחר מכן, הזריקו מים שעברו דה-יוניזציה כדי לבדוק את ההידוק של הערוץ הכולל. עבור הרכבה קרמית פיאזואלקטרית, בחר יריעות קרמיקה פיאזואלקטריות חתוכות מראש ברוחב של חמישה מילימטרים.לאחר מכן לרתך חוטים משני הצדדים של קרמיקה piezoelectric בקצה אחד. הדביקו את הקרמיקה הפיאזואלקטרית לאמצע החלק האחורי של השבב על ידי הנחת טיפה של דבק ציאנואקרילט על הקרמיקה הפיאזואלקטרית. מחליקים את הדבק עם הקיסם ומסירים את עודפי הדבק.לאחר מכן לחץ במהירות על השבב והמשיך ללחוץ במשך כדקה. כדי להרכיב את התקן המיקרו, חתכו חתיכת PDMS כבסיס של התקן המיקרו והדביקו צד אחד של הבסיס לכניסה וליציאת גושי PDMS ואת הצד השני לשקופית זכוכית שקופה באמצעות סרט דו-צדדי. תקן את כל המיקרו-מכשיר לשלב המיקרוסקופ כדי לשמור את השבב במישור מוקד אחד.כדי להכין את תמיסות החלקיקים הסטנדרטיות של פוליסטירן הוסף 0.05 מיליליטר של תמיסת חלקיקי פוליסטירן ל -10 מיליליטר של PBS וערבב היטב. לאחר מכן הכינו את מתלי התאים על ידי שטיפת התאים הדבקים במפגש של 90% עם PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.25 טריפסין למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הסרת טריפסין, להוסיף מיליליטר אחד בינוני שלם וליצור השעיה התא על ידי פיפטינג. הבא צנטריפוגה מתלה התא ב 100 G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuse ב 0.5 עד מיליליטר אחד של PBS על מנת לקבל השעיה התא.אז תאים נספרו עם hemocytometer ואת הריכוז היה כ 300 עד 500, 000 תאים למיליליטר. לאחר הכנת תרחיף גרעין התא כפי שהוכח קודם לכן, הסר את הסופרנטנט והוסף 200 מיקרוליטרים של מגיב מיצוי חלבון ציטופלסמי A לכל לוח תאים של 20 מיקרוליטר וערבב היטב. ואז מערבבים את התערובת הנ"ל ב 220 גרם במשך חמש שניות ומניחים על אמבט קרח במשך 10 דקות.לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של מיצוי חלבון cytoplasmic מגיב B לפתרון לאחר הדגירה. לאחר המערבולת, מניחים על אמבט קרח למשך דקה אחת ומערבבים שוב ב-220 גרם למשך חמש שניות. ואז, לבסוף צנטריפוגה ב 1000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ו resuse את לוח הצבעים במיליליטר אחד של PBS. ואז צנטריפוגה ב 1000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות. לאחר הסרת הסופר-נטנט, יש להפסיק את השימוש ב-100 מיקרוליטרים של PBS כהשעיית גרעין התא.הוסיפו טריפן כחול לתרחיף גרעין התא הנ"ל והכתימו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן, לספור את מספר הגרעינים תחת מיקרוסקופ הפוך עם מטרה 10x. לדלל את ההשעיה של גרעין התא הנ"ל עם חיץ PBS לריכוז של 200 עד 300, 000 גרעין למיליליטר.לאחר מכן לסנן את תרחיף גרעין התא דרך מסננת של 70 מיקרומטר. כדי להגדיר את מערכת המדידה, הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ ופתח את תוכנת המצלמה. השתמש במטרה 4x כדי למצוא את המיקום האמצעי של המיקרו-ערוץ, כלומר, את המיקום של קרמיקה piezoelectric.לאחר חיבור החוטים, לרתך אותם למסופים החיוביים והשליליים של פלט מחולל האותות של הקרמיקה הפיאזואלקטרית בהתאמה. לאחר מכן מניחים את המזרק על משאבת המיקרו הזרקה ומחברים אותו לקטטר הכניסה. כדי לאסוף את הנוזל מהמיקרו-ערוץ, הניחו מיכל קטן בקצה קטטר היציאה.כדי לקבוע את פרמטרי המדידה, שאף את תמיסת חלקיקי הפוליסטירן עם המזרק. לאחר מכן הזריקו את התמיסה למיקרו-ערוץ השבב תוך הימנעות מבועות אוויר ובמיקרו-ערוץ שבב כדי להבטיח מדידה מדויקת. הגדר את הפלט של מחולל האותות לאות סימן עם תדר של מגה-הרץ אחד ומתח שיא לשיא של 10 וולט עד שנצפה כי החלקיקים נעים לעבר קו האמצע של המיקרו-ערוץ ונשארים בתנועה קדימה לאורך קו האמצע לאחר שהגיעו לקו האמצע.לאחר ערבוב תא מיליליטר אחד או תרחיף גרעין עם תמיסת החלקיקים הסטנדרטית ביחס של אחד לאחד, להזריק אותו לתוך microchannel עם מזרק כדי למדוד תאים וגרעינים. התחל להקליט עם מצלמת CCD כאשר התאים או הגרעינים נכנסים לשדה הראייה ומפעילים את מחולל האותות. לאחר מכן יש לשטוף את המיקרו-ערוץ במים שעברו דה-יוניזציה, 75% אלכוהול ומים שעברו דה-יוניזציה ברצף לשימוש מאוחר יותר.תנועת התאים והחלקיקים נצפתה תחת פעולת כוח השדה האקוסטי לעבר קו האמצע של המיקרו-ערוץ במרווחי זמן שונים. בוצע חישוב האנרגיה, הצפיפות ודחיסות התא וצפיפות האנרגיה האקוסטית ומסלול התנועה הנמדד של החלקיק התקבלו מהתוצאה המתאימה ביותר. הגרעינים בעלי הטוהר הגבוה והשלמות בודדו מתאים ומדידת דחיסות הגרעין הושגה על ידי קבלת מסלול התנועה של הגרעין.הדחיסות של סוגים שונים של תאים ותאים סרטניים לאחר EMT המושרה על ידי תרופות או קרינת רנטגן עם מינונים שונים נמדדה והושוותה. התאים שנמדדו נאספו ונמצא כי לא היה הבדל משמעותי בשגשוג התאים ובכדאיות שלהם בהשוואה לקבוצה שלא טופלה לאחר 48 שעות של תרבית. מה שמעיד על כך שלמדידת הדחיסות אין השפעה על שגשוג התאים והישרדותם.הדבר החשוב ביותר הוא לכוונן את תדר האות עד שיבחינו בכך שחלקיקים נעים לעבר קו האמצע של המיקרו-ערוץ.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

השפעות כפול של מלנומה נגזר תא גורמים על בידול Adipocytes מח עצם

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

מכתים אלסטי על פרפין-שקופיות מוטבעות של רקמת סרטן pT3N0M0 קיבה

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...