Name: measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice
Uploaded: 2022-07-14T15:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 12075330 e U1932165) e dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong, Cina (numero di sovvenzione 2020A1515010270).

1. Fabbricazione e assemblaggio del microdispositivo acustofluidico
<ol><li>Fabbricazione del chip microfluidico.<ol><li>Progettare un chip a canale singolo con un solo ingresso e uscita, come illustrato nella Figura 1. Per le celle di misura, mantenere la sezione trasversale rettangolare del microcanale a 740 μm di larghezza e 100 μm di profondità. Per misurare il nucleo della cella, modificare la larghezza e la profondità del microcanale rispettivamente a 250 μm e 1...

<ol>
	<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Frame, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+confers+radiosensitivity+to+prostate+stem-like+cells.">HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells.</a> British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).</li><li>Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+mapping+of+live+cells+by+multiple-particle-tracking+microrheology.">Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).</li><li>M&#246;ller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafine+particles+cause+cytoskeletal+dysfunctions+in+macrophages:+role+of+intracellular+calcium.">Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium.</a> Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+magnetic+tweezer+system+for+intraembryonic+navigation+and+measurement.">A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement.</a> IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).</li><li>Machida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+manipulation+of+intracellular+stress+fibres+using+a+hook-shaped+AFM+probe.">Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe.</a> Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).</li><li>Bufi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+immune+cells+exhibit+distinct+mechanical+properties+that+are+modified+by+inflammation.">Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li><li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration.">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li><li>Jung, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionising+radiation+induces+changes+associated+with+epithelial-mesenchymal+transdifferentiation+and+increased+cell+motility+of+A549+lung+epithelial+cells.">Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells.</a> European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).</li><li>Hartono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+measurements+of+cell+compressibility+via+acoustic+radiation.">On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation.</a> Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).</li><li>Sitters, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+force+spectroscopy.">Acoustic force spectroscopy.</a> Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).</li><li>Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-acoustic+focusing+of+cells+for+size-insensitive+acousto-mechanical+phenotyping.">Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping.</a> Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).</li><li>Cushing, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+characterization+of+microbead+and+cell+suspensions+by+speed+of+sound+measurements+of+neutrally+buoyant+samples.">Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples.</a> Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).</li><li>Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+cells+and+microspheres+sorted+by+acoustophoresis+with+in-line+resistive+pulse+sensing.">Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing.</a> Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).</li><li>Petersson, F., Aberg, L., Sw&#228;rd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flow+acoustophoresis:+microfluidic-based+mode+of+particle+and+cell+separation.">flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation.</a> Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschl&#228;ger, M., Weichhart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+gradient+centrifugation:+a+flexible+method+for+the+isolation+of+nuclei+from+primary+cells.">Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).</li><li>Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+compressibility+changes+during+epithelial-mesenchymal+transition+based+on+acoustofluidic+microdevice.">Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice.</a> Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+DNA+damage+responses+affect+cell+compressibility.">Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+single+cells:+Measurement+methods+and+applications.">Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications.</a> Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).</li><li>Yousafzai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+neighboring+cells+on+cell+stiffness+measured+by+optical+tweezers+indentation.">Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).</li><li>Wei, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+living+cell+micromechanical+properties+by+oscillatory+optical+tweezers.">A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers.</a> Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).</li><li>Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+properties+of+brain+cancer+cells+using+a+microfluidic+cell+squeezer+device.">Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device.</a> Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).</li><li>Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+recognition+of+counterions+in+ion-exchange+resins.">Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins.</a> Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).</li><li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=detection,+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells.">detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+mobilization+of+circulating+tumour+cells+during+cancer+therapy+cause+metastasis.">Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).</li></ol>

I metodi di misurazione della meccanica cellulare comunemente usati sono AFM, aspirazione di micropipette, metodi di microfluidica, tecnica a piastre parallele, pinzette ottiche, barelle ottiche e metodi acustici20. I metodi di microfluidica possono funzionare con tre approcci: micro-costrizione, flusso estensionale e flusso di taglio. Tra questi, barella ottica, pinzette ottiche, metodi acustici, flusso estensionale e approcci di flusso di taglio sono misurazioni senza contatto. A differenza dell...

Le proprietà meccaniche cellulari svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali, nella trasformazione maligna delle cellule e nella radiosensibilità 1,2. Per ottenere una comprensione approfondita del ruolo delle proprietà meccaniche delle cellule nel processo di cui sopra, la misurazione accurata della meccanica cellulare è fondamentale e la misurazione non dovrebbe causare danni alle cellule per la successiva coltura e analisi. Il processo di misurazione dovrebbe essere il più veloce possibile, altrimenti la vitalità cellulare potrebbe essere compromessa se le cellule vengono rimosse dall'ambiente di coltivazione per lungo tempo.
I metodi di misurazione della meccanica cellulare esistenti devono affrontare alcune limitazioni. Alcuni metodi, come la citometria a torsione magnetica, le pinzette magnetiche e la microreologia a tracciamento delle particelle, causano danni cellulari a causa dell'introduzione di particelle nelle cellule 3,4,5. I metodi che misurano per contatto con le cellule, come il microscopio a forza atomica (AFM), l'aspirazione con micropipette, la microcostrizione e la tecnica a piastre parallele, sono anche soggetti a danni cellulari e il rendimento è difficile da aumentare 6,7,8. Inoltre, le radiazioni ionizzanti appiattiranno le cellule e aumenteranno la loro adesione9; È quindi necessario misurare la meccanica dell'intera cellula in sospensione.
In risposta alle sfide di cui sopra, è stato sviluppato un sistema di misura della meccanica cellulare basato sul metodo acustofluidico 10,11,12,13,14. La larghezza del canale è abbinata alla mezza lunghezza d'onda acustica, creando così un nodo d'onda stazionario sulla linea mediana del microcanale. Sotto l'azione della forza della radiazione acustica, le celle o le sfere standard possono spostarsi verso il nodo di pressione acustica. Poiché le proprietà fisiche delle sfere standard (dimensioni, densità e comprimibilità) sono note, è possibile determinare la densità di energia acustica. Quindi, la comprimibilità cellulare può essere ottenuta registrando le traiettorie di movimento delle cellule nel campo acustico. È possibile ottenere misurazioni non distruttive ad alta produttività di celle in stato di sospensione. Questo documento introdurrà la progettazione del chip microfluidico, la creazione del sistema e le fasi di misurazione. La misurazione di vari tipi di cellule tumorali è stata effettuata per verificare l'accuratezza del metodo. L'ambito di applicazione di questo metodo era stato esteso alle strutture subcellulari (come il nucleo) regolando la frequenza di risonanza della ceramica piezoelettrica e la larghezza del microcanale. Inoltre, sono stati studiati i cambiamenti nella comprimibilità cellulare dopo EMT indotta da farmaci o irradiazione a raggi X con dosi diverse. I risultati dimostrano l'ampia applicabilità di questo metodo come potente strumento per studiare la correlazione tra cambiamenti biochimici e proprietà meccaniche cellulari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin(1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 glue</td>
			<td>Evo-bond</td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>lung adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0027</td>
			<td>Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Srum(FBS)</td>
			<td>AUSGENEX</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL247</td>
			<td>colorectal carcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-resistant glass</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>corning</td>
			<td>21-040-cvc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST506</td>
			<td>100mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere&#160;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>The diameter of microshpere is 6.00&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide(PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184Silicone ELASTOMER</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains prepolymers and curing agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice

La meccanica cellulare svolge un ruolo importante nelle metastasi tumorali, nella trasformazione maligna delle cellule e nella radiosensibilità. Durante questi processi, studiare le proprietà meccaniche delle cellule è spesso impegnativo. I metodi di misurazione convenzionali basati sul contatto, come la compressione o lo stiramento, sono inclini a causare danni alle cellule, influenzando l'accuratezza della misurazione e la successiva coltura cellulare. Le misurazioni in stato aderente possono anche influenzare l'accuratezza, specialmente dopo l'irradiazione poiché le radiazioni ionizzanti appiattiscono le cellule e migliorano l'adesione. Qui è stato sviluppato un sistema di misura della meccanica cellulare basato sul metodo acustofluidico. La comprimibilità della cella può essere ottenuta registrando la traiettoria di movimento della cella sotto l'azione della forza acustica, che può realizzare misure rapide e non distruttive in stato sospeso. Questo documento riporta in dettaglio i protocolli per la progettazione di chip, la preparazione dei campioni, la registrazione della traiettoria, l'estrazione e l'analisi dei parametri. La comprimibilità di diversi tipi di cellule tumorali è stata misurata sulla base di questo metodo. La misurazione della comprimibilità del nucleo è stata ottenuta anche regolando la frequenza di risonanza della ceramica piezoelettrica e la larghezza del microcanale. In combinazione con la verifica a livello molecolare degli esperimenti di immunofluorescenza, è stata confrontata la comprimibilità cellulare prima e dopo la transizione epiteliale-mesenchimale indotta da farmaci (EMT). Inoltre, è stato rivelato il cambiamento di comprimibilità cellulare dopo l'irradiazione a raggi X con dosi diverse. Il metodo di misurazione della meccanica cellulare proposto in questo articolo è universale e flessibile e ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca scientifica e nella pratica clinica.

Qui, il lavoro ha presentato un protocollo per la costruzione di un sistema di misura della comprimibilità cellulare veloce e non distruttivo basato su microdispositivo acustofluidico e ha dimostrato i suoi vantaggi per misurare cella e nucleo in diverse situazioni. La figura 1 mostra lo schema del canale microfluidico. I componenti e l'assemblaggio del microdispositivo acustofluidico sono mostrati nella Figura 2. La figura 3 mostr...

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Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Qui viene presentato un protocollo per costruire un sistema veloce e non distruttivo per misurare la comprimibilità di cellule o nuclei basato su microdispositivo acustofluidico. Sono stati studiati i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule tumorali dopo transizione epiteliale-mesenchimale o radiazioni ionizzanti, dimostrando la prospettiva applicativa di questo metodo nella ricerca scientifica e nella pratica clinica.

Misura della comprimibilità di cellula e nucleo basata su microdispositivo acustofluidico

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...

La meccanica cellulare svolge un ruolo importante nelle metastasi tumorali, nella trasformazione maligna delle cellule e nella radiosensibilità. Il metodo acustofluidico può realizzare misure rapide e non distruttive in stati sospesi. Questa tecnica può essere utilizzata per rispecchiare il cambiamento di autocomprimibilità durante la transizione epiteliale-mesenchimale e separare le cellule tumorali circolanti, mostrando le sue prospettive di applicazione nella diagnosi del cancro.Per iniziare, legare il blocco PDMS al chip perforando i fori nel blocco PDMS per le porte di ingresso e uscita con un ago cavo di un millimetro di diametro. Quindi mettere i blocchi PDMS e il chip con il retro in un pulitore al plasma per un minuto. Dopo aver allineato i fori sui blocchi PDMS con l'ingresso e l'uscita del chip, premere delicatamente i blocchi PDMS sul chip per 15 secondi, con conseguente incollaggio tra i blocchi PDMS e la superficie del chip.Per collegare il catetere in PTFE al chip, tagliare due pezzi di catetere con un diametro interno di 0,8 millimetri e una lunghezza di 10 centimetri. Piegare un ago in acciaio inossidabile con un diametro interno di 0,7 millimetri e una lunghezza di 1,5 centimetri per 90 gradi in una forma a L e collegarlo a un'estremità del catetere. Inserire gli aghi in acciaio inossidabile nei fori dei blocchi PDMS.Per l'ingresso, collegare un ago di erogazione da 19 gauge all'altra estremità del catetere come connettore per una siringa. Successivamente, iniettare acqua deionizzata per testare la tenuta del canale complessivo. Per un assemblaggio ceramico piezoelettrico, selezionare fogli di ceramica piezoelettrica pretagliati con una larghezza di cinque millimetri.Quindi saldare i fili su entrambi i lati della ceramica piezoelettrica a un'estremità. Incollare la ceramica piezoelettrica al centro del retro del chip posizionando una goccia di colla cianoacrilica sulla ceramica piezoelettrica. Lisciare la colla con lo stuzzicadenti e rimuovere la colla in eccesso.Quindi premerlo rapidamente sul chip e continuare a premere per circa un minuto. Per montare il micro dispositivo, tagliare un pezzo di PDMS come base del micro dispositivo e attaccare un lato della base ai blocchi PDMS di ingresso e uscita e l'altro lato a un vetrino trasparente usando del nastro biadesivo. Fissare l'intero microdispositivo allo stadio del microscopio per mantenere il chip su un piano focale.Per preparare le soluzioni di particelle standard di polistirene aggiungere 0,05 millilitri di soluzione di particelle di polistirene a 10 millilitri di PBS e mescolare bene. Quindi preparare le sospensioni cellulari lavando le cellule aderenti al 90% di confluenza con PBS. Aggiungere 500 microlitri di 0,25 Tripsina per uno o due minuti a temperatura ambiente.Dopo aver rimosso la tripsina, aggiungere un millilitro di mezzo completo e formare una sospensione cellulare mediante pipettaggio. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 100 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere in 0,5 a un millilitro di PBS per ottenere una sospensione cellulare.Quindi le cellule sono state contate con un emocitometro e la concentrazione era di circa 300-500.000 cellule per millilitro. Dopo aver preparato la sospensione del nucleo cellulare come dimostrato in precedenza, rimuovere il surnatante e aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione proteica citoplasmatica A per 20 microlitri di palette cellulari e mescolare bene. Quindi vortice la miscela di cui sopra a 220 G per cinque secondi e mettere in bagno ghiacciato per 10 minuti.Quindi, aggiungere 10 microlitri di reagente di estrazione della proteina citoplasmatica B alla soluzione dopo l'incubazione. Dopo il vortice, mettere in bagno ghiacciato per un minuto e vortice di nuovo a 220 G per cinque secondi. Quindi, infine centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il surnatante e risospendere la tavolozza in un millilitro di PBS. Quindi centrifugare a 1000 G a quattro gradi Celsius per quattro minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere in 100 microlitri di PBS come sospensione del nucleo cellulare.Aggiungere il blu di tripano alla sospensione del nucleo cellulare sopra e colorare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi, conta il numero di nuclei al microscopio invertito con un obiettivo 10x. Diluire la sospensione del nucleo cellulare sopra con tampone PBS ad una concentrazione da 200 a 300.000 nuclei per millilitro.Quindi filtrare la sospensione del nucleo cellulare attraverso un setaccio da 70 micrometri. Per impostare il sistema di misurazione, accendere la sorgente luminosa del microscopio e aprire il software della fotocamera. Usa l'obiettivo 4x per trovare la posizione centrale del microcanale, cioè la posizione della ceramica piezoelettrica.Dopo aver collegato i fili, saldarli rispettivamente ai terminali positivi e negativi dell'uscita del generatore di segnale della ceramica piezoelettrica. Quindi posizionare la siringa sulla pompa di microiniezione e collegarla al catetere di ingresso. Per raccogliere il fluido dal microcanale, posizionare un piccolo contenitore all'estremità del catetere di uscita.Per determinare i parametri di misurazione, aspirare la soluzione di particelle di polistirene con la siringa. Quindi iniettare la soluzione nel microcanale del chip evitando bolle d'aria e nel microcanale del chip per garantire una misurazione accurata. Impostare l'uscita del generatore di segnale su un segnale segnaletica con una frequenza di un megahertz e una tensione picco-picco di 10 volt fino a quando non si osserva che le particelle si muovono verso la linea mediana del microcanale e rimangono in movimento in avanti lungo la linea mediana dopo aver raggiunto la linea mediana.Dopo aver miscelato una cellula millilitro o una sospensione di nucleo con la soluzione di particelle standard nel rapporto di uno a uno, iniettarla nel microcanale con una siringa per misurare cellule e nuclei. Avviare la registrazione con la telecamera CCD quando le cellule o i nuclei entrano nel campo visivo e accendono il generatore di segnale. Quindi sciacquare il microcanale con acqua deionizzata, alcool al 75% e acqua deionizzata in sequenza per un uso successivo.Il movimento delle cellule e delle particelle è stato osservato sotto l'azione della forza del campo acustico verso la linea mediana del microcanale a diversi intervalli di tempo. Sono stati eseguiti i calcoli di energia, densità e comprimibilità della cella e la densità di energia acustica e la traiettoria di movimento misurata per la particella sono state ottenute dal miglior risultato di adattamento. L'elevata purezza e i nuclei intatti sono stati isolati dalle cellule e la misurazione della comprimibilità del nucleo è stata ottenuta ottenendo la traiettoria di movimento del nucleo.È stata misurata e confrontata la comprimibilità di diversi tipi di cellule tumorali e cellule dopo EMT indotta da farmaci o irradiazione a raggi X con dosi diverse. Le cellule misurate sono state raccolte e si è scoperto che non vi era alcuna differenza significativa nella proliferazione cellulare e nella vitalità rispetto al gruppo non trattato dopo 48 ore di coltura. Indica che la misurazione della comprimibilità non ha alcun effetto sulla proliferazione e sulla sopravvivenza cellulare.La cosa più importante è regolare la frequenza del segnale fino a quando non si osserva che le particelle si muovono verso la linea mediana del microcanale.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Colorazione elastica su vetrini di tessuto gastrico pT3N0M0 gastrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...