Name: measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice
Uploaded: 2022-07-14T15:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号12075330およびU1932165)および中国広東省自然科学財団(助成金番号2020A1515010270)の支援を受けました。

1. 音響流体マイクロデバイスの作製と組立
<ol><li>マイクロ流体チップの作製。<ol><li>図1に示すように、入口と出口が 1つだけのシングルチャネルチップを設計します。細胞を測定する場合は、マイクロチャネルの長方形の断面を幅740 μm、深さ100 μmに保ちます。細胞核を測定するには、マイクロチャネルの幅と深さをそれぞれ250 μmと100 μmに変更します。</l...

<ol>
	<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Frame, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+confers+radiosensitivity+to+prostate+stem-like+cells.">HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells.</a> British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).</li><li>Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+mapping+of+live+cells+by+multiple-particle-tracking+microrheology.">Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).</li><li>M&#246;ller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafine+particles+cause+cytoskeletal+dysfunctions+in+macrophages:+role+of+intracellular+calcium.">Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium.</a> Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+magnetic+tweezer+system+for+intraembryonic+navigation+and+measurement.">A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement.</a> IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).</li><li>Machida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+manipulation+of+intracellular+stress+fibres+using+a+hook-shaped+AFM+probe.">Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe.</a> Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).</li><li>Bufi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+immune+cells+exhibit+distinct+mechanical+properties+that+are+modified+by+inflammation.">Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li><li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration.">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li><li>Jung, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionising+radiation+induces+changes+associated+with+epithelial-mesenchymal+transdifferentiation+and+increased+cell+motility+of+A549+lung+epithelial+cells.">Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells.</a> European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).</li><li>Hartono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+measurements+of+cell+compressibility+via+acoustic+radiation.">On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation.</a> Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).</li><li>Sitters, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+force+spectroscopy.">Acoustic force spectroscopy.</a> Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).</li><li>Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-acoustic+focusing+of+cells+for+size-insensitive+acousto-mechanical+phenotyping.">Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping.</a> Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).</li><li>Cushing, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+characterization+of+microbead+and+cell+suspensions+by+speed+of+sound+measurements+of+neutrally+buoyant+samples.">Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples.</a> Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).</li><li>Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+cells+and+microspheres+sorted+by+acoustophoresis+with+in-line+resistive+pulse+sensing.">Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing.</a> Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).</li><li>Petersson, F., Aberg, L., Sw&#228;rd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flow+acoustophoresis:+microfluidic-based+mode+of+particle+and+cell+separation.">flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation.</a> Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschl&#228;ger, M., Weichhart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+gradient+centrifugation:+a+flexible+method+for+the+isolation+of+nuclei+from+primary+cells.">Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).</li><li>Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+compressibility+changes+during+epithelial-mesenchymal+transition+based+on+acoustofluidic+microdevice.">Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice.</a> Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+DNA+damage+responses+affect+cell+compressibility.">Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+single+cells:+Measurement+methods+and+applications.">Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications.</a> Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).</li><li>Yousafzai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+neighboring+cells+on+cell+stiffness+measured+by+optical+tweezers+indentation.">Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).</li><li>Wei, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+living+cell+micromechanical+properties+by+oscillatory+optical+tweezers.">A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers.</a> Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).</li><li>Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+properties+of+brain+cancer+cells+using+a+microfluidic+cell+squeezer+device.">Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device.</a> Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).</li><li>Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+recognition+of+counterions+in+ion-exchange+resins.">Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins.</a> Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).</li><li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=detection,+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells.">detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+mobilization+of+circulating+tumour+cells+during+cancer+therapy+cause+metastasis.">Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).</li></ol>

一般的に使用される細胞力学測定方法は、AFM、マイクロピペット吸引、マイクロ流体法、平行平板技術、光ピンセット、光学ストレッチャー、および音響法である20。マイクロフルイディクス法は、マイクロくびれ、伸長流、せん断流の3つのアプローチで機能します。その中で、光学ストレッチャー、光ピンセット、音響法、伸長流、およびせん断流のアプローチは非接触?...

細胞の機械的特性は、腫瘍の転移、細胞の悪性形質転換、および放射線感受性において重要な役割を果たします1,2。上記のプロセスにおける細胞の機械的特性の役割を深く理解するには、細胞力学の正確な測定が重要であり、測定はその後の培養および分析のために細胞に損傷を与えてはなりません。測定プロセスは可能な限り速くなければなりません、さもなければ細胞が長期間培養環境から取り除かれるならば、細胞の生存率は影響を受けるかもしれません。
既存の細胞力学測定法にはいくつかの制限があります。磁気ツイストサイトメトリー、磁気ピンセット、粒子追跡マイクロレオロジーなどのいくつかの方法は、細胞への粒子の導入による細胞損傷を引き起こします3,4,5。原子間力顕微鏡(AFM)、マイクロピペット吸引、マイクロ狭窄、平行平板法など、細胞との接触によって測定する方法も細胞損傷を起こしやすく、スループットを向上させることは困難です6,7,8。さらに、電離放射線は細胞を平らにし、それらの接着を増加させます9;したがって、懸濁液中の全細胞力学を測定する必要があります。
以上の課題に応えて、音響流体法10,11,12,13,14に基づく細胞力学計測システムが開発された。チャネル幅は音響半波長に一致しているため、マイクロチャネルの正中線に定在波ノードが作成されます。音響放射力の作用下で、セルまたは標準ビーズは音圧ノードに移動できます。標準ビーズの物理的特性(サイズ、密度、圧縮率)がわかっているため、音響エネルギー密度を決定することができます。そして、細胞圧縮率は、音場における細胞の運動軌跡を記録することによって得ることができる。懸濁状態の細胞の非破壊ハイスループット測定を達成することができる。本稿では、マイクロ流体チップの設計、システムの構築、測定手順について紹介する。本方法の正確性を検証するために、様々な種類の腫瘍細胞の測定が行われている。この方法は、圧電セラミックスの共鳴周波数とマイクロチャネルの幅を調整することにより、細胞内構造(核など)に適用範囲を拡大していました。さらに、異なる線量での薬物誘発EMTまたはX線照射後の細胞圧縮率の変化を調べた。結果は、生化学的変化と細胞の機械的特性との相関を研究するための強力なツールとしてのこの方法の幅広い適用性を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin(1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 glue</td>
			<td>Evo-bond</td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>lung adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0027</td>
			<td>Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Srum(FBS)</td>
			<td>AUSGENEX</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL247</td>
			<td>colorectal carcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-resistant glass</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26&#160;</td>
			<td>breast Adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>corning</td>
			<td>10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>corning</td>
			<td>21-040-cvc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST506</td>
			<td>100mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere&#160;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>The diameter of microshpere is 6.00&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide(PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184Silicone ELASTOMER</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains prepolymers and curing agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the compressibility of cell and nucleus based on acoustofluidic microdevice

細胞力学は、腫瘍の転移、細胞の悪性化、および放射線感受性において重要な役割を果たします。これらのプロセスの間、細胞の機械的特性を研究することはしばしば困難です。圧縮や延伸などの接触に基づく従来の測定方法は、細胞損傷を引き起こしやすく、測定精度とその後の細胞培養に影響を与えます。接着状態での測定は、電離放射線が細胞を平らにし、接着性を高めるため、特に照射後の精度にも影響を与える可能性があります。ここでは、音響流体法に基づく細胞力学測定システムが開発されている。細胞圧縮率は、音響力の作用下での細胞運動軌跡を記録することによって得ることができ、中断状態での高速かつ非破壊測定を実現することができる。このホワイトペーパーでは、チップ設計、サンプル調製、軌道記録、パラメータ抽出、および分析のプロトコルについて詳しく説明します。異なる種類の腫瘍細胞の圧縮率をこの方法に基づいて測定した。核の圧縮率の測定は、圧電セラミックの共振周波数とマイクロチャネルの幅を調整することによっても達成されました。免疫蛍光実験の分子レベルの検証と組み合わせて、薬物誘発上皮間葉転換(EMT)前後の細胞圧縮率を比較した。さらに、異なる線量でX線照射した後の細胞圧縮率の変化を明らかにした。本稿で提案する細胞力学測定法は普遍的かつ柔軟であり、科学研究や臨床現場での応用が見込まれる。

本研究では、音響流体マイクロデバイスに基づく高速かつ非破壊的な細胞圧縮性測定システムを構築するためのプロトコルを提示し、さまざまな状況下で細胞と核を測定するためのその利点を実証しました。 図1 にマイクロ流体チャネルの概略を示す。音響流体マイクロデバイスのコンポーネントとアセンブリを 図2に示します。 ?...

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Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

ここでは、音響流体マイクロデバイスに基づいて細胞または核の圧縮率を測定するための高速で非破壊的なシステムを構築するためのプロトコルが提示されます。上皮間葉転換または電離放射線照射後の腫瘍細胞の機械的特性の変化を調べ、科学的研究および臨床診療におけるこの方法の適用の見通しを実証した。

音響流体マイクロデバイスに基づく細胞・核の圧縮率測定

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...

細胞力学は、腫瘍の転移、細胞の悪性化、および放射線感受性において重要な役割を果たします。音響流体法は、懸濁状態での高速かつ非破壊測定を実現できます。この手法は、上皮から間葉への移行における自己圧縮性の変化を反映し、循環腫瘍細胞を分離するために使用でき、癌診断への応用の見通しを示しています。まず、直径1ミリメートルの中空針で入口ポートと出口ポート用のPDMSブロックに穴を開けて、PDMSブロックをチップにバインドします。次に、PDMSブロックとチップを裏面を上にしてプラズマクリーナーに1分間入れます。PDMSブロックの穴をチップの入口と出口に合わせた後、PDMSブロックをチップに15秒間静かに押し付けると、PDMSブロックとチップの表面の間にボンディングが発生します。PTFEカテーテルをチップに接続するには、内径0.8ミリメートル、長さ10センチメートルのカテーテルを2枚切ります。内径0.7ミリ、長さ1.5センチ×90度のステンレス針をL字型に曲げ、カテーテルの一端に接続します。ステンレス鋼の針をPDMSブロックの穴に挿入します。インレットには、19ゲージのディスペンシングニードルをシリンジのコネクタとしてカテーテルのもう一方の端に接続します。その後、脱イオン水を注入して、チャネル全体の気密性をテストします。圧電セラミックアセンブリの場合は、幅5ミリメートルのプレカット圧電セラミックシートを選択します。次に、圧電セラミックの両側のワイヤを一端で溶接します。圧電セラミックの上にシアノアクリレート接着剤を一滴置き、圧電セラミックをチップの背面の中央に接着します。つまようじで接着剤を滑らかにし、余分な接着剤を取り除きます。次に、チップをすばやく押して、約1分間押し続けます。マイクロデバイスを取り付けるには、PDMSをマイクロデバイスのベースとして切り取り、ベースの片側を入口と出口のPDMSブロックに貼り付け、反対側を両面テープを使用して透明なスライドガラスに貼り付けます。マイクロデバイス全体を顕微鏡ステージに固定して、チップを1つの焦点面に保ちます。ポリスチレン標準粒子溶液を調製するには、0.05ミリリットルのポリスチレン粒子溶液を10ミリリットルのPBSに加え、よく混合します。次に、接着細胞をPBSで90%コンフルエントで洗浄することにより細胞懸濁液を調製します。500マイクロリットルの0.25トリプシンを室温で1〜2分間加えます。トリプシンを除去した後、1ミリリットルの完全培地を添加し、ピペッティングによって細胞懸濁液を形成する。次に細胞懸濁液を100Gで5分間遠心分離する。上清を除去し、細胞懸濁液を得るために0.5〜1ミリリットルのPBSに再懸濁する。次に細胞を血球計算盤で計数し、濃度はミリリットルあたり約300〜500, 000細胞でした。前に示したように細胞核懸濁液を調製した後、上清を除去し、細胞パレット20マイクロリットルあたり200マイクロリットルの細胞質タンパク質抽出試薬Aを添加し、よく混合する。次に、上記の混合物を220Gで5秒間ボルテックスし、氷浴に10分間置きます。次に、インキュベーション後に10マイクロリットルの細胞質タンパク質抽出試薬Bを溶液に加える。ボルテックス後、氷浴に1分間置き、再び220 Gで5秒間ボルテックスします。その後、最後に摂氏4度で5分間1000Gで遠心分離する。上清を取り除き、パレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、摂氏4度で1000 Gで4分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞核懸濁液として100マイクロリットルのPBSに再懸濁する。上記の細胞核懸濁液にトリパンブルーを加え、室温で4分間染色する。次に、倒立顕微鏡下で10倍の対物レンズで核の数を数えます。上記の細胞核懸濁液をPBS緩衝液でミリリットル当たり200〜300, 000核の濃度に希釈する。次に、細胞核懸濁液を70マイクロメートルのふるいを通してろ過します。測定システムを設定するには、顕微鏡の光源をオンにして、カメラソフトウェアを開きます。4倍対物レンズを使用して、マイクロチャネルの中央位置、つまり圧電セラミックの位置を見つけます。ワイヤを接続した後、圧電セラミックの信号発生器出力のプラス端子とマイナス端子にそれぞれ溶接します。次に、シリンジをマイクロインジェクションポンプに置き、インレットカテーテルに接続します。マイクロチャネルから液体を収集するには、出口カテーテルの端に小さな容器を置きます。測定パラメータを決定するには、シリンジでポリスチレン粒子溶液を吸引します。次に、気泡を避けながらチップマイクロチャネルに溶液を注入し、チップマイクロチャネルに注入して正確な測定を保証します。粒子がマイクロチャネルの正中線に向かって移動し、正中線に到達した後も正中線に沿って前進し続けることが観察されるまで、信号発生器の出力を1メガヘルツの周波数と10ボルトのピークtoピーク電圧の符号信号に設定します。1ミリリットルの細胞または核懸濁液を標準粒子溶液と1対1の比率で混合した後、注射器でマイクロチャネルに注入し、細胞および核を測定します。細胞または核が視野に入ったらCCDカメラで記録を開始し、信号発生器をオンにします。次に、マイクロチャネルを脱イオン水、75%アルコール、脱イオン水で順番にすすぎ、後で使用する。細胞および粒子の動きは、異なる時間間隔でマイクロチャネルの正中線に向かう音場力の作用下で観察された。エネルギー、密度、セル圧縮率の計算を行い、最良のフィッティング結果から粒子の音響エネルギー密度と測定された運動軌跡を求めた。細胞および核から高純度かつ無傷の核を単離し、核の運動軌跡を得ることによって核圧縮率測定を達成した。異なる線量で薬物誘発EMTまたはX線照射後の異なる種類の癌細胞および細胞の圧縮率を測定し、比較した。測定した細胞を回収したところ、培養48時間後の無処理群と比較して細胞増殖率や生存率に有意差はないことがわかった。圧縮率測定が細胞の増殖および生存に影響を及ぼさないことを示す。最も重要なことは、粒子がマイクロチャネルの正中線に向かって移動するのが観察されるまで、信号の周波数を微調整することです。

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デュアル骨髄脂肪細胞分化に及ぼす悪性黒色腫細胞由来因子

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲル マイクロチャンバー アレイを用いた (HMCA) の解析-ベース プレート

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...