Name: reconstituting and characterizing actin-microtubule composites with tunable motor-driven dynamics and mechanics
Uploaded: 2022-08-25T14:00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics at JoVE.com

Мы благодарим Майю Хендию и д-ра Джонатана Мишеля за помощь в анализе данных, а также д-ра Джанет Шеунг, д-ра Мумиту Даса и д-ра Майкла Раста за полезные обсуждения и рекомендации. Это исследование было поддержано исследовательским грантом Фонда Уильяма М. Кека и премией NSF DMREF (DMR 2119663), присуждаемой RMRA и JLR и грантами R15 Национальных институтов здравоохранения (R15GM123420, 2R15GM123420-02), присуждаемыми RMR-A и RJM.

<ol>
	<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).</li>
	<li>Koenderink, G. H., Paluch, E. K. Architecture shapes contractility in actomyosin networks. Current Opinion in Cell Biology. 50, 79-85 (2018).</li>
	<li>Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).</li>
	<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
	<li>Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 15 (5), 177-182 (2011).</li>
	<li>Xiao, Q., Hu, X., Wei, Z., Tam, K. Y. Cytoskeleton molecular motors: structures and their functions in neuron. International Journal of Biological Sciences. 12 (9), 1083-1092 (2016).</li>
	<li>Ajeti, V. et al. Wound healing coordinates actin architectures to regulate mechanical work. Nature Physics. 15 (7), 696-705 (2019).</li>
	<li>Jung, W. et al. Dynamic motions of molecular motors in the actin cytoskeleton. Cytoskeleton. 76 (11-12), 517-531 (2019).</li>
	<li>Pollard, T. D., O&#39;Shaughnessy, B. Molecular mechanism of cytokinesis. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 661-689 (2019).</li>
	<li>Huber, F., Boire, A., L&#243;pez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Current Opinion in Cell Biology. 32, 39-47 (2015).</li>
	<li>Rivero, F. et al. The role of the cortical cytoskeleton: F-actin crosslinking proteins protect against osmotic stress, ensure cell size, cell shape and motility, and contribute to phagocytosis and development. Journal of Cell Science. 109 (11), 2679-2691 (1996).</li>
	<li>Duclos, G. et al. Topological structure and dynamics of three-dimensional active nematics. Science. 367 (6482), 1120-1124 (2020).</li>
	<li>Baclayon, M. et al. Optical tweezers-based measurements of forces and dynamics at microtubule ends. Optical Tweezers. 1486, 411-435 (2017).</li>
	<li>Gurmessa, B., Fitzpatrick, R., Falzone, T. T., Robertson-Anderson, R. M. Entanglement density tunes microscale nonlinear response of entangled actin. Macromolecules. 49 (10), 3948-3955 (2016).</li>
	<li>Francis, M. L. et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).</li>
	<li>Ricketts, S. N. et al. Varying crosslinking motifs drive the mesoscale mechanics of actin-microtubule composites. Scientific Reports. 9 (1), 12831 (2019).</li>
	<li>Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).</li>
	<li>Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (51), 20820-20825 (2012).</li>
	<li>Soares e Silva, M. et al. Active multistage coarsening of actin networks driven by myosin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9408-9413 (2011).</li>
	<li>Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Roichman, Y. Dynamics in steady state in vitro acto-myosin networks. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (16), 163002 (2017).</li>
	<li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127 (2013).</li>
	<li>F&#252;rthauer, S. et al. Self-straining of actively crosslinked microtubule networks. Nature Physics. 15 (12), 1295-1300 (2019).</li>
	<li>Lemma, L. M. et al. Multiscale microtubule dynamics in active nematics. Physical Review Letters. 127 (14), 148001 (2021).</li>
	<li>Fan, Y., Wu, K.-T., Aghvami, S. A., Fraden, S., Breuer, K. S. Effects of confinement on the dynamics and correlation scales in kinesin-microtubule active fluids. Physical Review E. 104 (3), 034601 (2021).</li>
	<li>Triclin, S. et al. Self-repair protects microtubules from destruction by molecular motors. Nature Materials. 20 (6), 883-891 (2021).</li>
	<li>Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).</li>
	<li>Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical Journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).</li>
	<li>Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
	<li>Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li>
	<li>Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).</li>
	<li>Yadav, V. et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).</li>
	<li>Ennomani, H. et al. Architecture and connectivity govern actin network contractility. Current Biology. 26 (5), 616-626 (2016).</li>
	<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
	<li>Alvarado, J., Cipelletti, L., Koenderink, G. H. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).</li>
	<li>Jung, W., Murrell, M. P., Kim, T. F-actin cross-linking enhances the stability of force generation in disordered actomyosin networks. Computational Particle Mechanics. 2 (4), 317-327 (2015).</li>
	<li>Lenz, M., Thoresen, T., Gardel, M. L., Dinner, A. R. Contractile units in disordered actomyosin bundles arise from f-actin buckling. Physical Review Letters. 108 (23), 238107 (2012).</li>
	<li>Memarian, F.L. et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), e2117107118 (2021).</li>
	<li>Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).</li>
	<li>Foster, P. J., F&#252;rthauer, S., Shelley, M. J., Needleman, D. J. Active contraction of microtubule networks. eLife. 4, e10837 (2015).</li>
	<li>Thijssen, K. et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), e2106038118 (2021).</li>
	<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
	<li>Colen, J. et al. Machine learning active-nematic hydrodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (10), e2016708118 (2021).</li>
	<li>Mitchell, K. A., Tan, A. J., Arteaga, J., Hirst, L. S. Fractal generation in a two-dimensional active-nematic fluid. Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. 31 (7), 073125 (2021).</li>
	<li>Pandolfi, R. J., Edwards, L., Johnston, D., Becich, P., Hirst, L. S. Designing highly tunable semiflexible filament networks. Physical Review E. 89 (6), 062602 (2014).</li>
	<li>Tan, A. J. et al. Topological chaos in active nematics. Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).</li>
	<li>Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., N&#233;d&#233;lec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e14 (2018).</li>
	<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
	<li>Sheung, J. Y. et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).</li>
	<li>McGorty, R. PyDDM v0.2.0. Zenodo. (2022).</li>
	<li>Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv. (2021).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).</li>
	<li>McGorty, R. Image-Correlation. at &#60;https://github.com/rmcgorty/Image-Correlation&#62;. (2020).</li>
	<li>Robertson, C. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).</li>
	<li>McGorty, R. Differential Dynamic Microscopy - Python. at &#60;https://github.com/rmcgorty/Differential-Dynamic-Microscopy---Python&#62;. (2021).</li>
	<li>Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).</li>
	<li>Robertson-Anderson, R. M. Optical tweezers microrheology: from the basics to advanced techniques and applications. ACS Macro Letters. 7 (8), 968-975 (2018).</li>
	<li>Pollard, T. D. Polymerization of ADP-actin. Journal of Cell Biology. 99 (3), 769-777 (1984).</li>
	<li>Cou&#233;, M., Brenner, S. L., Spector, I., Korn, E. D. Inhibition of actin polymerization by latrunculin A. FEBS Letters. 213 (2), 316-318 (1987).</li>
	<li>Pollard, T. D. Actin and actin-binding proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (8), a018226 (2016).</li>
	<li>Kumar, N. Taxol-induced polymerization of purified tubulin. Mechanism of action. Journal of Biological Chemistry. 256 (20), 10435-10441 (1981).</li>
	<li>K&#228;s, J. et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophysical Journal. 70 (2), 609-625 (1996).</li>
	<li>Viamontes, J., Narayanan, S., Sandy, A. R., Tang, J. X. Orientational order parameter of the nematic liquid crystalline phase of F -actin. Physical Review E. 73 (6), 061901 (2006).</li>
	<li>Hitt, A. L., Cross, A. R., Williams, R. C. Microtubule solutions display nematic liquid crystalline structure. Journal of Biological Chemistry. 265 (3), 1639-1647 (1990).</li>
	<li>Andexer, J. N., Richter, M. Emerging enzymes for ATP regeneration in biocatalytic processes. ChemBioChem. 16 (3), 380-386 (2015).</li>
	<li>Farhadi, L. et al. Actin and microtubule crosslinkers tune mobility and control co-localization in a composite cytoskeletal network. Soft Matter. 16 (31), 7191-7201 (2020).</li>
	<li>Falzone, T. T., Lenz, M., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Assembly kinetics determine the architecture of &#945;-actinin crosslinked F-actin networks. Nature Communications. 3 (1), 861 (2012).</li>
	<li>Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Reconstitution of contractile actomyosin bundles. Biophysical Journal. 100 (11), 2698-2705 (2011).</li>
	<li>Sanghvi-Shah, R., Weber, G. F. Intermediate filaments at the junction of mechanotransduction, migration, and development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 81 (2017).</li>
	<li>Shen, Y. et al. Effects of vimentin intermediate filaments on the structure and dynamics of in vitro multicomponent interpenetrating cytoskeletal networks. Physical Review Letters. 127 (10), 108101 (2021).</li>
	<li>Laan, L., Roth, S., Dogterom, M. End-on microtubule-dynein interactions and pulling-based positioning of microtubule organizing centers. Cell Cycle. 11 (20), 3750-3757 (2012).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Christopher Currie1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University
to:
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Maya Hendija1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

Цитоскелет представляет собой динамическую композитную сеть взаимодействующих биополимеров, которая обеспечивает структурную и механическую поддержку клеток. Связанные молекулярные двигатели и связывающие белки реструктурируют и адаптируют цитоскелет, чтобы позволить клеткам расти, изменять форму, жесткость, двигаться и даже самовосстанавливаться, обеспечивая множество клеточных процессов, начиная от миграции и деления до механозондирования 1,2. Помимо своего значения в клеточной биофизике, цитоскелет также является квинтэссенцией активного вещества с потенциальными применениями материалов, начиная от заживления ран и доставки лекарств до фильтрации и мягкой робототехники 1,3,4,5,6,7,8,9.
Двумя ключевыми характеристиками, которые наделяют цитоскелет уникальным структурным и механическим разнообразием и многофункциональностью, являются: 1) его композитная природа, включающая множественные взаимодействующие белковые нити, такие как полугибкие актиновые нити и жесткие микротрубочки, а также связанные с ними связывающие и сшивающие белки 3,5,10; и 2) его способность непрерывно реструктурироваться, перемещаться, грубеть и выполнять работу с помощью энергоемких двигателей, таких как миозины и кинезины, толкая и вытягивая нитевидные белки 1,7,11,12,13. Хотя эта элегантная сложность позволяет цитоскелету опосредуть такие разнообразные процессы, как подвижность клеток, цитокинез и заживление ран 3,6,7,11, она препятствует способности исследователей воспроизводить сигнатурные характеристики цитоскелета in vivo в восстановленных системах in vitro.
Текущие усилия по восстановлению границ сосредоточены на композитах запутанных и сшитых актиновых нитей и микротрубочек 3,10,14,15,16,17, силообразующих актимозиновых сетях 2,8,18,19,20,21 и активных нематицах, управляемых кинезин-микротрубочками. взаимодействия 22,23,24,25,26. Было показано, что стационарные актин-микротрубочки демонстрируют эмерджентные механические свойства 15,16,27, такие как повышенная подвижность нити накаливания и повышенная жесткость по сравнению с однокомпонентными системами 27. Исследования систем актионатомизина in vitro сообщили о широком диапазоне структурных и динамических свойств, которые зависят от концентраций актина, миозина и сшивающихвеществ 28,29,30,31. Например, при достаточном сшивании сети актомиозина подвергаются крупномасштабному сокращению иогрублению 2,28,30,32,33,34,35,36, тогда как без сшивок сети демонстрируют быстрый, дестабилизирующий поток и разрыв 19,29 . Сообщалось, что восстановленные активные нематики на основе микротрубочек, которые используют кластеры кинезиновых двигателей для сшивания и вытягивания пучков микротрубочек, демонстрируют длительные турбулентные потоки, расширение, изгиб, разрыв и исцеление 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.
Совсем недавно было показано, что композиты актин-микротрубочек, приводимые в действие мини-нитями миозина II, приводят к более упорядоченному сокращению и целостности сети по сравнению с неупорядоченным потоком и разрывом сети, которые сети актомиозина без сшивок демонстрируют 17,26,48. Кроме того, сочетание прочности композита и генерации силы оптимизируется, когда актин и микротрубочки присутствуют в сопоставимых концентрациях. Ключевые возникающие особенности в этой области пространства рецептур включают повышенную механическую прочность26, скоординированное движение актина и микротрубочек26, устойчивое устойчивое сжатие и мезомасштабную реструктуризацию17.
Здесь описаны протоколы проектирования и настройки совместно запутанных и сшитых композитов микротрубочек и актиновых нитей, которые выталкиваются из равновесия мини-нитями миозина II и кинезиновыми кластерами, действующими на актиновые нити и микротрубочки соответственно (рисунок 1). Динамика, структура и механика этого класса композитов могут быть настроены относительными концентрациями нитей, двигателей и сшивателей, чтобы продемонстрировать богатое фазовое пространство адвективного и турбулентного потока, изотропного сжатия, ускорения, замедления, размешивания, жесткости, релаксации и разрыва. Основное внимание в данной работе уделяется подготовке и настройке этого класса активных цитоскелетных композитов. Однако, чтобы помочь исследователям в бенчмаркинге и характеристике описанных активных композитов, эффективные методы визуализации с использованием мультиспектральной конфокальной микроскопии также детализированы. Наконец, представлены результаты ключевых методов вычислительного анализа, которые могут быть использованы для измерения динамики, структуры и механики композитов. Исследователям рекомендуется принять эти методы, которые включают дифференциальную динамическую микроскопию (DDM), автокорреляцию пространственных изображений (SIA) и велоциметрию изображения частиц (PIV), поскольку они были оптимизированы для характеристики сложной динамики и структурного разнообразия композитов 17,26,49.
Шаги, описанные ниже, сосредоточены на подготовке композитов и их визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Протоколы, описывающие анализ данных после сбора и измерения оптического пинцета, можно найти в предыдущих работах 17,26,48,50 и предоставить по запросу. Все материалы перечислены в Таблице материалов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin 
			&#160;Abbreviation used in paper: blebbistatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td>Stock Concentration: 200 &#956;M in DMSO 
			Storage: dessicated, in DMSO, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 &#956;M in DMSO 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:20 488-tubulin:tubulin mixture 
			&#160;Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C, protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:20 R-tubulin:tubulin mixture 
			&#160;Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C, protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>actin (biotin): skeletal muscle 
			&#160;Abbreviation used in paper: biotin-actin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80&#186;C, store&#160; aliquot on ice at 4&#186;C for up to 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle 
			&#160;Abbreviation used in paper: R-actin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80&#186;C, store&#160; aliquot on ice at 4&#186;C, can be used for up to 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine triphosphate 
			&#160;Abbreviation used in paper: ATP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1048</td>
			<td>Stock Concentration: 100 mM 
			Storage: in solution (pH 7), -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488 Phalloidin 
			&#160;Abbreviation used in paper: 488-phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#956;M DMSO 
			Storage: protected from light, dessicated, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 &#956;M with DMSO 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 &#956;M in PEM (1 &#956;L in 4 &#956;L PEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488&#8211;labeled actin 
			&#160;Abbreviation used in paper: 488-actin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12373</td>
			<td>Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner 
			&#160;Abbreviation used in paper: plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bemis&#160;Parafilm M Laboratory Wrapping Film 
			&#160;Abbreviation used in paper: transparent film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 
			&#160;Abbreviation used in paper:&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1682836</td>
			<td>Stock Concentration: 100x 
			Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 &#956;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin 
			&#160;Abbreviation used in paper: biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>Stock Concentration: 1.02 mM in PEM 
			Storage: dessicated, 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized nanopure water 
			&#160;Abbreviation used in paper: DI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyldichlorosilane 
			&#160;Abbreviation used in paper: silane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D/3820/PB05</td>
			<td>Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol 
			&#160;Abbreviation used in paper: DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M in DMSO 
			Storage: dessicated, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO Anhydrous 
			&#160;Abbreviation used in paper: DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-Buffer 
			&#160;Abbreviation used in paper: F-buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 10x 
			Storage: dessicated, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Buffer 
			&#160;Abbreviation used in paper: G-buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 10x 
			Storage: dessicated, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slide 
			&#160;Abbreviation used in paper: slide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-310397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase + catalase + &#946;-mercaptoethanol 
			&#160;Abbreviation used in paper: GOC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133-250KU, C1345, 63689&#160;</td>
			<td>Stock Concentration: 100x 
			Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v&#160; &#946;-mercaptoethanol in DI H20 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% &#946;-mercaptoethanol, 43 &#956;g/mL glucose oxidase, 7 &#956;g/mL catalase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glu-GOC oxygen scavenging system 
			&#160;Abbreviation used in paper: glu-GOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 100x 
			Storage: prepare fresh each time 
			Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine triphosphate 
			&#160;Abbreviation used in paper: GTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0461</td>
			<td>Stock Concentration: 100 mM 
			Storage: 100 &#956;L aliquots at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Mix 1-minute epoxy 
			&#160;Abbreviation used in paper: epoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1366072&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesin-1 401 BIO 6x HIS 
			&#160;Abbreviation used in paper: kinesin</td>
			<td>Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 8.87 &#956;M in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin 
			&#160;Abbreviation used in paper: NA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: dessicated, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm) 
			&#160;Abbreviation used in paper: coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel&#160; 
			&#160;Abbreviation used in paper: Taxol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3456</td>
			<td>Stock Concentration: 2 mM in DMSO 
			Storage: protected from light, dessicated, -20&#186;C 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 &#956;M in DMSO (0.4 &#956;L in 3.6 &#956;L DMSO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM-100 
			&#160;Abbreviation used in paper: PEM</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock Concentration: 1x 
			Storage: room temperature (RT) 
			Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin 
			Abbreviation used in paper: phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3457</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#956;M in DMSO 
			Storage: protected from light, dessicated, -20&#186;C, adhere closely to storage/handling conditions 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 &#956;M with DMSO 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>porcine brain tubulin 
			&#160;Abbreviation used in paper: tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride 
			&#160;Abbreviation used in paper: KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>Stock Concentration: 4 M 
			Storage: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit skeletal actin 
			&#160;Abbreviation used in paper: actin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80&#186;C, store&#160; aliquot on ice at 4&#186;C, can be used for up to 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit skeletal myosin II 
			&#160;Abbreviation used in paper: myosin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (biotin): porcine brain 
			&#160;Abbreviation used in paper: biotin-tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain 
			&#160;Abbreviation used in paper: 488-tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL488M</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C, protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubulin (rhodamine): porcine brain 
			&#160;Abbreviation used in paper: R-tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL590M</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM 
			Storage: single use aliquots, -80&#186;C, avoid freeze-thaw cycles 
			Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 
			Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4&#186;C, protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 
			&#160;Abbreviation used in paper: Tween20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J20605.AP</td>
			<td>Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 
			Storage: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge grade microtubes 
			&#160;Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP&#160;</td>
			<td>Beckman Coultier</td>
			<td>343776</td>
			<td>Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8x34 mm PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light curing glue 
			&#160;Abbreviation used in paper: UV glue</td>
			<td>Pharda</td>
			<td>SKG-2869</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstituting and characterizing actin-microtubule composites with tunable motor-driven dynamics and mechanics

Композитный цитоскелет, включающий взаимодействующие сети полугибких актиновых нитей и жестких микротрубочек, реструктурируется и генерирует силы, используя моторные белки, такие как миозин II и кинезин, для управления ключевыми процессами, такими как миграция, цитокинез, адгезия и механозондирование. В то время как взаимодействия актин-микротрубочки являются ключом к универсальности и адаптивности цитоскелета, понимание их взаимодействия с активностью миозина и кинезина все еще зарождается. В этой работе описывается, как спроектировать перестраиваемые трехмерные композитные сети из совместно запутанных актиновых нитей и микротрубочек, которые подвергаются активной реструктуризации и баллистическому движению, приводимые в действие двигателями миозина II и кинезина, и настраиваются относительными концентрациями актина, микротрубочек, моторных белков и пассивных сшивающих устройств. Также подробно описаны протоколы флуоресцентной маркировки микротрубочек и актиновых нитей для наиболее эффективной визуализации композитной реструктуризации и движения с использованием многоспектральной конфокальной визуализации. Наконец, представлены результаты методов анализа данных, которые могут быть использованы для количественной характеристики неравновесной структуры, динамики и механики. Воссоздание и исследование этой перестраиваемой биомиметической платформы дает ценную информацию о том, как связанная двигательная активность, композитная механика и динамика нитей могут привести к множеству клеточных процессов от митоза до поляризации и механо-ощущения.

Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics at JoVE.com

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics (Video) | JoVE

В данной работе представлены протоколы для проектирования и характеристики перестраиваемых трехмерных композитных сетей совместно запутанных актиновых нитей и микротрубочек. Композиты подвергаются активной реструктуризации и баллистическому движению, приводимому в действие двигателями миозина II и кинезина, и настраиваются относительными концентрациями актина, микротрубочек, моторных белков и пассивных сшивающих факторов.

Восстановление и характеристика актин-микротрубочных композитов с перестраиваемой динамикой и механикой с приводом от двигателя

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Наша работа приближает усилия по восстановлению цитоскелетов к имитации клеточных условий путем разработки композитов актина и микротрубочек, приводимых в действие кинезиновыми и миозиновыми двигателями для активной настройки, реструктуризации и перемещения. Динамика и структура наших композитов могут быть точно запрограммированы путем независимого добавления, удаления и настройки различных компонентов, чтобы продемонстрировать богатую фазовую базу сжатия, инфекции, обезвреживания, огрубления и разрыва. Наш подход широко применим к проектированию, созданию и характеристике платформ активной материи, которые включают в себя несколько компонентов, генерирующих силу, которые действуют на разные подложки в одной системе.Демонстрировать процедуру будут Дейзи Ачирилоайе и Майя Хендия. Студенты-исследователи из нашей лаборатории. Для начала добавьте реагенты в стерильную черную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, используя микропипетку и стерильные наконечники пипеток, чтобы сформировать моторные кластеры Кинезина, которые связывают и оказывают силы между парами микротрубочек.Осторожно перемешайте, пипетируя раствор вверх и вниз. Затем высиживают раствор в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищают его от света. Чтобы подготовить запутанную композитную сеть актонных нитей и микротрубочек, установите тепловой блок на 37 градусов Цельсия.Добавьте реагенты в стерильную микроцентрифужную трубку размером 0,6 миллилитра. Убедитесь, что общий объем составляет 25 микролитров. Аккуратно выложите раствор вверх и вниз, чтобы смешать его и поместить на тепловой блок с температурой 37 градусов Цельсия, защищенный от света, в течение одного часа.После этого извлеките трубку из теплового блока и с помощью микропипетки аккуратно перемешайте в 0,84 микролитра 100 микромолярного фаллоидина. Инкубировать в течение пяти-10 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Чтобы подготовить активные композиты для конфокальной визуализации, добавьте реагенты в раствор и аккуратно перемешайте путем пипетирования вверх и вниз.Разделите раствор на три 10-микролитровые аликвоты и обозначьте их как K, K плюс M и отрицательный контроль. Добавьте 2,54 микролитра миозина к аликвоте K плюс M и 2,54 микролитра PEM к K и отрицательным контрольным аликвотам. Затем добавьте 2,5 микролитра кластеров Кинезина к Аликвотам K и K плюс M и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать.Затем добавьте 2,5 микролитра PEM к отрицательному контролю, используя ту же технику. Используйте микропипетку для медленного потока каждого раствора в соответствующий канал камер образца посредством капиллярного действия. Надавите вниз очень медленно и осторожно на пипетку, чтобы не вводить пузырьки воздуха в канал.Запечатайте два открытых конца каждого канала быстросохнущим эпоксидным или УФ-отверждаемым клеем. Когда клей полностью высохнет, поместите канал на микроскоп, чтобы визуализировать композит как можно ближе к исходному неактивному состоянию. Сначала изобразите канал K и каналы K plus M, а затем канал управления.Обратите внимание на время, прошедшее между добавлением кластеров Kinesin к аликвотам K и K плюс M и началом сбора данных. Чтобы приготовить актин к актину или сшивателям АА, добавьте биотин-актин, нейтравидин, биотин и ПЭМ в микроцентрифужную трубку и аккуратно перемешайте их путем пипетирования вверх и вниз. Аналогичным образом, для микротрубочек к микротрубочкам или сшивателям ММ добавьте биотин-тубулин, нейтравидин, биотин и ПЭМ в микроцентрифужную трубку и аккуратно перемешайте их путем пипетки вверх и вниз.Оберните трубку в термопластичную потолочную пленку, чтобы создать водонепроницаемое уплотнение, и поместите их во флотационный плот в ванне с контролируемой температурой, установленной на четыре градуса Цельсия в течение 90 минут. Чтобы включить сшивающие комплексы A-A в образцы для визуализации, добавьте реагенты в микроцентрифужную трубку. Убедитесь, что общий объем составляет 25 микролитров.Аналогичным образом, для сшивающих комплексов M-M добавьте реагенты, показанные на экране, в микроцентрифужную трубку. Смешайте раствор путем пипетки вверх и вниз и поместите его на тепловой блок с температурой 37 градусов Цельсия, защищенный от света, в течение одного часа. После этого извлеките трубку из теплового блока и с помощью микропипетки смешайте в 0,84 микролитра 100 микромолярного фаллоидина.Инкубируйте в течение пяти-10 минут при комнатной температуре, защищенной от света, и повторите процедуру, показанную ранее, чтобы подготовить активные композиты для конфокальной визуализации. Моноволокна актина и димеры тубулина сополимеризуются с образованием запутанных сетей актиновых нитей и микротрубочек. Миозин две мини-нити и кластеры Кинезина толкают и тянут на нити, чтобы вывести композиты из устойчивого состояния.Пассивное сшивание достигается с помощью NeutrAvidin для связывания биотинилированных актиновых нитей или микротрубочек. Миозин две мини-нити, кинезиновые кластеры или оба двигателя включены в композиты без пассивных сшивок, актин-актиновые сшивки и микротрубочки-микротрубочки сшивки. Здесь показана двухцветная конфокальная визуализация цитоскелетных композитов, управляемых миозином, с различными концентрациями миозина и молярными фракциями актина.Велоциметрия изображений частиц показывает, что активность актина миозина вызывает скоординированную сократительную динамику актина и микротрубочек в запутанных композитах. Здесь разные цвета стрелок соответствуют разным скоростям, как указано в цветовой шкале справа от векторных полей. Дифференциальная динамическая микроскопия с временным разрешением выполняется на микротрубочках и актиновых каналах временных рядов для определения характеристик времени распада по сравнению с волновым числом как для актина, так и для микротрубочек.Скорости сжатия определяются с помощью кривых времени прилегания к затуханию, усредненных по всем временам задержки за всю продолжительность каждого 45-минутного временного ряда. Дифференциальная динамическая микроскопия с временным разрешением количественно определяет, как динамика изменяется с течением времени, оценивая время распада для последовательных шестиминутных интервалов в течение 45-минутного времени активации для актина и микротрубочек. Разрешенные по времени скорости сжатия для актиновых нитей и микротрубочек определяются от припадков к соответствующим кривым времени распада.Автоматический корреляционный анализ пространственных изображений количественно определяет моторную реструктуризацию активных компонентов цитоскелета путем сравнения кривых автоматической корреляции для различных сетей в начале эксперимента по сравнению с концом. Разрешенные по времени длины корреляции, определяемые с помощью экспоненциальных припадков кривых автоматической корреляции, показывают композиты, которые не реструктурируются по сравнению с теми, которые существенно реструктурируются. Два цветных конфокальных изображения композитов актиновых микротрубочек, управляемых кинезином, показывают зависимую от формулы реструктуризацию с течением времени без реструктуризации сшивающих композитов в слабо связанные кластеры, богатые микротрубочками.Поперечное связывание актин-актин поддерживает совместную локализацию актиновых микротрубочек, в то время как сшивание микротрубочек-микротрубочек усиливает смешивание D. Дифференциальная динамическая микроскопия и автоматический корреляционный анализ пространственных изображений показывают влияние сшивки и конкурирующих двигателей микина и кинезина на изменяющуюся во времени динамику и структуру композитов. Чтобы более точно имитировать клеточные условия, исследователи могут включать промежуточные нити, другие двигатели и связывающие белки, которые контролируют длину и жесткость нитей.Метрологические измерения оптического пинцета также могут быть выполнены для характеристики композитной механики. Используя наш подход, исследователи могут точно настроить динамику и структуру композитного активного вещества, вдохновленного цитоскелетом, в беспрецедентном фазовом пространстве для эмуляции различных клеточных процессов и разработки реконфигурируемых программируемых материалов.

Research

JoVE Journal

Biology

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

AC Electrokinetic Phenomena Generated by Microelectrode Structures

AC Electrokinetic Phenomena Generated by Microelectrode Structures (Video) | JoVE

AC Электрокинетические явления Создано с помощью Микроэлектродные Структуры

The field of AC electrokinetics is rapidly growing due to its ability to perform dynamic fluid and particle manipulation on the micro- and nano-scale, ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell (Video) | JoVE

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling (Video) | JoVE

Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA (Video) | JoVE

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology (Video) | JoVE

Открывая белковых взаимодействий и Характеризуя Protein функций с помощью HaloTag технологии

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy (Video) | JoVE

Флэш-и-Фриз: Роман Техника для захвата мембраны динамика с электронной микроскопии

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion (Video) | JoVE

Использование живых изображений для ядер трек во время Myoblast дифференциация и фьюжн

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry (Video) | JoVE

Обнаружение и характеристика белка самосборки в Vivo по потоку цитометрии

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates (Video) | JoVE

Оптическая визуализация на основе фотодиода для записи динамики сети с разрешением одного нейрона у непрозрачных беспозвоночных

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis (Video) | JoVE

Инъекции куколки и взрослых для редактирования генов РНКи и CRISPR в Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...