Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

SS's laboratorium og RKS's laboratorium finansieres af tilskud fra DBT og SERB, Indien. APM er modtager af ICMR-stipendiet, Indiens regering. DP er modtager af CSIR-stipendiet, Indiens regering. FN er modtager af DST-Inspire-stipendiet, Indiens regering. Figur 2 blev genereret ved hjælp af Biorender (https://biorender.com).

Denne undersøgelse blev udført med forudgående godkendelse fra og efter retningslinjerne fra Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Al vedligeholdelse og opdræt af zebrafisk blev udført på et omgivende fiskekulturanlæg ved 28,5 °C, og embryonerne blev opbevaret i en biologisk iltbehovsinkubator (BOD) ved en temperatur på 28,5 °C. Her blev zebrafisken AB-stammen brugt, og iscenesættelsen blev udført ifølge Kimmel et al.54. Røntgenstråling bl...

Zebrafisk bruges som værdifulde modeller i mange undersøgelser, herunder flere typer kræftforskning. Denne model giver en nyttig platform til storstilet lægemiddelscreening67,68. Som enhver anden toksicitetsevalueringsmetode er den kvantitative evaluering af de vigtigste biologiske ændringer ved stråling og/eller lægemiddelbehandling den mest afgørende del af denne protokol. I denne type undersøgelser må overlevelse ikke være det eneste kriterium for a...

Zebrafisken (Danio rerio) er en velkendt dyremodel, der har været meget udbredt i forskningen gennem de sidste 3 årtier. Det er en lille ferskvandsfisk, der er let at opdrætte og opdrætte under laboratorieforhold. Zebrafisken er blevet flittigt anvendt til forskellige udviklingsmæssige og toksikologiske undersøgelser 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebrafisken har høj frugtbarhed og kort embryonal generation; Embryonerne er velegnede til sporing af forskellige udviklingsstadier, er visuelt gennemsigtige og kan anvendes til varianter af genetisk manipulation og screeningsplatformemed høj kapacitet 9,10,11,12,13,14. Desuden giver zebrafisken in toto og levende billeddannelse, for hvilken dens udviklingsproces og forskellige deformiteter i nærvær af forskellige giftige stoffer eller faktorer let kan studeres ved hjælp af stereo eller fluorescerende mikroskopi 7,15,16.
Strålebehandling er en af de vigtigste terapeutiske metoder, der anvendes til behandling af kræft 17,18,19,20,21,22,23,24. Imidlertid kræver kræftstrålebehandling potentielle radiobeskyttere for at beskytte normale sunde celler mod at dø, mens de dræber ondartede celler eller beskytter menneskers sundhed under behandling, der involverer højenergistråling 25,26,27,28,29. Omvendt undersøges potente radiosensibilisatorer også for at øge effektiviteten af stråling til at dræbe maligne celler, især i målrettede og præcisionsterapier30,31,32,33. For at validere potente radioprotektorer og sensibilisatorer er en model, der er egnet til semi-high-throughput lægemiddelscreening og målbart udviser strålingseffekter, derfor meget efterspurgt. Flere tilgængelige modeller anvendes i strålingsundersøgelser og involveret i lægemiddelscreeningseksperimenter. Imidlertid er højere hvirveldyr og endda den mest almindeligt anvendte in vivo-model, mus, uegnede til storskala lægemiddelscreening, fordi det er tidskrævende, dyrt og udfordrende at designe sådanne screeningseksperimenter med disse modeller. Tilsvarende er cellekulturmodeller ideelle til sorter af lægemiddelscreeningsforsøg med høj kapacitet34,35. Eksperimenter, der involverer cellekultur, er imidlertid ikke altid pragmatiske, meget reproducerbare eller pålidelige, da celler i kultur markant kan ændre deres adfærd i henhold til vækstbetingelserne og kinetikken. Også sorter af celletyper viser differentiel strålingssensibilisering. Navnlig repræsenterer 2D- og 3D-cellekultursystemer ikke hele organismescenariet, og derfor kan de opnåede resultater muligvis ikke rekapitulere det faktiske niveau af radiotoksicitet36,37. I denne henseende giver zebrafisken flere fordele ved screening for nye radiosensibilisatorer og radioprotektorer. Den lette håndtering, store koblingsstørrelse, korte levetid, hurtige embryonale udvikling, embryogennemsigtighed og lille kropsstørrelse gør zebrafisken til en velegnet model til storstilet lægemiddelscreening. På grund af ovenstående fordele kan eksperimenter let gentages på kort tid, og effekten kan let observeres under et dissekerende mikroskop i multibrøndplader. Derfor vinder zebrafisken popularitet i lægemiddelscreeningsforskning, der involverer strålingsundersøgelser38,39.
Zebrafiskens potentiale som en bonafide model til screening af strålingsmodifikatorer er blevet demonstreret i forskellige undersøgelser 40,41,42,43,44,45. Den radiobeskyttende virkning af potentielle radiomodifikatorer, såsom nanopartikel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparationsproteiner KU80 og ATM og transplanterede hæmatopoietiske stamceller og virkningerne af radiosensibilisatorer, såsom flavopiridol og AG1478, i zebrafiskmodellen er blevet rapporteret 19,41,42,43,44,45,46 . Ved hjælp af det samme system blev den radiobeskyttende virkning af DF-1 (fulleren nanopartikel) vurderet både på systemiske og organspecifikke niveauer, og også brugen af zebrafiskembryoner til screening af radiobeskyttere blev yderligere undersøgt47. For nylig blev Kelulut-honningen rapporteret som en radiobeskytter i zebrafiskembryoner og viste sig at øge embryooverlevelsen og forhindre organspecifik skade, cellulær DNA-skade og apoptose48.
På samme måde blev de radiobeskyttende virkninger af polymerer, der blev genereret via Hantzschs reaktion, kontrolleret på zebrafiskembryoner i en screening med høj kapacitet, og beskyttelsen blev hovedsageligt opnået ved at beskytte celler mod DNA-skader49. I en af de tidligere undersøgelser blev det lipofile statin fluvastatin fundet som et potentielt radiosensibilisator ved hjælp af zebrafiskmodellen med denne tilgang50. Tilsvarende anses guldnanopartikler for at være et ideelt radiosensibilisator og er blevet brugt i mange undersøgelser51,52.
Den embryonale udvikling i zebrafisk involverer spaltning i de første 3 timer, hvor en enkeltcellet zygote deler sig for at danne 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler og 64 celler, der let identificeres med et stereomikroskop. Derefter opnår den blastula-stadiet med 128 celler (2.25 timer efter befrugtning, hpf), hvor cellerne fordobles hvert 15. minut og fortsætter gennem disse følgende faser: 256 celler (2.5 hpf), 512 celler (2.75 hpf) og når 1,000+ celler på kun 3 timer (figur 1). Ved 4 timer når ægget kuglestadiet, efterfulgt af dannelsen af en kuppelform i fostermassen 7,53,54. Gastrulationen i zebrafisk starter fra 5,25 hpf54, hvor den når skjoldstadiet. Skjoldet angiver tydeligt cellernes hurtige konvergensbevægelse til den ene side af kimringen (figur 1) og er en fremtrædende og tydelig fase af gastrulaterende embryoner, der let kan identificeres53,54. Selv om strålingseksponering for embryoner kan ske på et hvilket som helst stadium af deres udvikling, kan strålingseksponering under gastrulation have mere tydelige morfologiske ændringer, der letter bedre aflæsning af strålingsinduceret toksicitet55; På samme måde kan administration af lægemidler til embryoner påbegyndes så tidligt som 2 HPF54.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Zebrafisk bruges i vid udstrækning i flere former for forskning, fordi de er en af de let vedligeholdte hvirveldyrmodeller og udviser flere funktioner i et unikt og praktisk modelsystem. Da stærkt proliferative celler er mere modtagelige for strålingsinduceret DNA-skade, er zebrafiskembryoner en frontlinje in vivo-model inden for strålingsforskning. Derudover projicerer denne model effekten af stråling og forskellige lægemidler inden for kort tid sammen med større biologiske begivenheder og tilhørende reaktioner. Flere kræftstudier har brugt zebrafisk, og denne protokol er baseret på brugen af strålingsmodifikatorer i forbindelse med strålebehandling og kræft. Denne metode kan let anvendes til at validere virkningerne af forskellige lægemidler på bestrålede og kontrollerende (ikke-bestrålede) embryoner og således identificere lægemidler som radiosensibiliserende eller beskyttende lægemidler. Selv om denne metode anvendes i de fleste lægemiddelscreeningsforsøg, er detaljerne i forsøget og toksicitetsvurderingen med baggrund for røntgenstrålingseksponering begrænsede eller kun kort behandlet, hvilket gør det vanskeligt at udføre. Denne protokol behandler dette problem og diskuterer proceduren og toksicitetsevalueringen med en detaljeret illustration. Proceduren beskriver en enkel tilgang til anvendelse af zebrafiskembryoner til strålingsundersøgelser og strålingsbaseret lægemiddelscreening med stor pålidelighed og reproducerbarhed.

Protokollens overordnede layout er vist i figur 2. Effekten af stråling og karakteriseringen på en dosisafhængig måde blev evalueret med følgende analyser.
Vurdering af røntgeninduceret toksicitet Ved hjælp af et stereomikroskop blev følgende abnormiteter vurderet og karakteriseret efter lægemiddelbehandling og / eller stråling. I henhold til OECD-retningslinjerne 61 blev fire store apikale endepunkter, herunder koagu...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafisken er for nylig blevet udnyttet som model til at validere potentielle strålingsmodifikatorer. Denne protokol beskriver de detaljerede trin til at bruge zebrafiskembryoner til strålingsbaserede screeningsforsøg og nogle observationsmetoder til evaluering af effekten af forskellige behandlinger og stråling.

Zebrafisklarver som model til evaluering af potentielle radiosensibilisatorer eller beskyttere

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Denne protokol beskriver de detaljerede trin til at bruge zebrafiskembryoner til strålingsbaserede screeningseksperimenter og nogle observationsmetoder til evaluering af behandlingen af forskellige lægemidler og stråling. Dette vil hjælpe læserne med at indstille en semi-høj gennemstrømning lægemiddelscreening, der involverer røntgeneksponering ved hjælp af zebrafiskembryoner, som vil guide i evalueringen af radiotoksicitet og effektiviteten af forskellige anvendte lægemidler. Denne procedure kan bruges til at screene og validere eller evaluere forskellige lægemidler som potentielle radiosensibilisatorer eller beskyttere, som kan udforskes yderligere eller anvendes inden for kræftstrålebehandling eller radiobiologi.Til at begynde med skal du overvåge de voksende embryoner under dissekeringsmikroskopet. Identificer det rigtige stadium og fjern eventuelle døde eller usunde embryoner. Sørg for, at tilstrækkelig embryostadieinddeling er strålingen, og lægemiddeldoser vil blive givet på et bestemt gastrulationsstadium.Før du starter eksperimentet, fordeles de sunde embryoner forsigtigt i forsøgspladerne ved hjælp af en Pasteur-pipette. For hver forsøgsgruppe skal du tage 15 til 20 embryoner. Når du opretter et strålingseksperiment, skal du inkludere en kontrol, der ikke er bestrålet, og en gruppe, der kun er stråling.Fordel embryonerne i en brøndplade, hvis strålingsskærmene kan dække og beskytte de ekstra brønde mod stråling, mens de andre brønde udsættes for en bestemt strålingsdosis. Ellers skal du bruge individuelle plader eller skiver til at se embryonerne pr. Strålingsdosis. Tænd for røntgenbestrålermaskinen, og start maskinens initialisering og opvarmning.Placer forsøgspladen under bestrålingsapparatet inde i maskinen i midten, og sørg for, at pladen er direkte under røntgenkilden. Og indstil derefter dosis og start røntgenstrålen. Efter afslutningen af bestrålingen skal du tage pladerne ud, lukke maskinprogrammet, slukke for maskinen og kontrollere pladerne under mikroskopet umiddelbart efter stråling.Fjern de døde embryoner, og registrer deres antal efter at have evalueret dem under dissekeringsmikroskopet. Sæt pladerne tilbage til inkubatoren ved 28,5 grader Celsius. Indsaml data med forudbestemte tidsintervaller, efter at strålingen er givet.Registrer alle mulige observationer såsom overlevelse, rugeeffektivitet, udviklingsstadium, hjerteslagtælling, krops- og halekrumning, perikardieødem og forlængelse af æggeblommesækken, mikrocefali, svømmeblæreudvikling, generel bevægelighed eller aktivitet osv. For at tage billeder skal du vælge repræsentative embryoner på et rent dias. Kontroller embryonerne under mikroskopet, orienter dem i en bestemt retning.Overlevelseskurven for embryoner, der blev bestrålet seks timer efter befrugtningen, viste, at der i kontrolgruppen og embryoner udsat for 2 grå og 5 grå ikke var nogen signifikant død hos embryoner. Antallet af hjerteslag pr. minut antydede, at hjertefrekvensen faldt enormt med øgede doser røntgenstråling. I kontrolgruppen ved hvert 24-timers interval blev pulsen set at stige.Alvorlig kardiovaskulær deformation mistænkes i embryoner udsat for 15 grå og 20 grå stråling, da hjerteslaget faldt enormt. Forskellige fænotypiske og udviklingsmæssige defekter er afbildet og evalueret for embryoner udsat for varierende doser af stråling på forskellige tidspunkter. Morfologiske observationer for rygsøjle- eller halebøjning, hovedmisdannelse og mikrocefali, defekter i udvikling, perikardieødem, æggeblommesækdeformiteter, svømmeblæredeformiteter og ændringer i øjenstruktur blev også udført For den protokol, vi har demonstreret, er valg af sunde embryoner, korrekt placering af embryonerne i bestrålingen og korrekt evaluering af krydsabnormiteterne nøglen til denne procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Sådan Undersøgelse Basement Membrane stivhed som en biofysisk Trigger i prostatakræft og andre aldersrelaterede patologier eller metaboliske sygdomme

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Den Colon-26 Carcinoma Tumor-bærende mus som en model for Studiet af Cancer Kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

En omfattende Procedure til at evaluere<em&gt; In vivo</em&gt; Ydelse of Cancer nanomedicin

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Tørrede blod og Serum steder som et nyttigt redskab for prøven Storage til at evaluere kræft biomarkører

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

En omfattende Procedure at evaluere In Vitro ydeevne af den formodede Hemangioblastoma Neovascularization ved hjælp af den sfæroide, spiring Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gær som et chassis til udvikling af funktionelle assays til undersøgelse af humane P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...