Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Het lab van SS en het lab van RKS worden gefinancierd door subsidies van DBT en SERB, India. APM is een ontvanger van de ICMR-fellowship, Government of India. DP is een ontvanger van de CSIR-fellowship, Government of India. De VN is een ontvanger van de DST-Inspire-fellowship, regering van India. Figuur 2 is gegenereerd met behulp van Biorender (https://biorender.com).

De huidige studie werd uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van en volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Al het onderhoud en de kweek van zebravissen werden uitgevoerd in een omringende viskweekfaciliteit bij 28,5 °C, en de embryo's werden bewaard in een incubator voor biologisch zuurstofverbruik (BZV) bij een temperatuur van 28,5 °C. Hier werd de zebravis AB-stam gebruikt en werd de enscenering uitgevoerd volgens Kimmel et a...

Zebravissen worden gebruikt als waardevolle modellen in veel onderzoeken, waaronder verschillende soorten kankeronderzoek. Dit model biedt een bruikbaar platform voor grootschalige drugsscreening67,68. Net als elke andere methode voor de evaluatie van de toxiciteit, is de kwantitatieve evaluatie van de belangrijkste biologische veranderingen bij bestraling en/of medicamenteuze behandeling het meest cruciale onderdeel van dit protocol. In dit soort studies mag ove...

De zebravis (Danio rerio) is een bekend diermodel dat de afgelopen 3 decennia veel is gebruikt in onderzoek. Het is een kleine zoetwatervis die gemakkelijk te kweken en te kweken is onder laboratoriumomstandigheden. De zebravis is veelvuldig gebruikt voor diverse ontwikkelings- en toxicologische studies 1,2,3,4,5,6,7,8. De zebravis heeft een hoge vruchtbaarheid en een korte embryonale generatie; De embryo's zijn geschikt voor het volgen van verschillende ontwikkelingsstadia, zijn visueel transparant en zijn vatbaar voor variëteiten van genetische manipulatie en high-throughput screeningplatforms 9,10,11,12,13,14. Bovendien biedt de zebravis in toto en live beeldvorming waarvoor zijn ontwikkelingsproces en verschillende misvormingen in aanwezigheid van verschillende toxische stoffen of factoren gemakkelijk kunnen worden bestudeerd met behulp van stereo- of fluorescentiemicroscopie 7,15,16.
Radiotherapie is een van de belangrijkste therapeutische modi die worden gebruikt bij de behandeling van kanker 17,18,19,20,21,22,23,24. Radiotherapie bij kanker vereist echter potentiële radioprotectors om normale gezonde cellen te beschermen tegen afsterven terwijl kwaadaardige cellen worden gedood of om de menselijke gezondheid te beschermen tijdens therapie met hoogenergetische stralingen 25,26,27,28,29. Omgekeerd worden ook krachtige radiosensibilisatoren onderzocht om de efficiëntie van straling te verhogen om kwaadaardige cellen te doden, vooral bij gerichte en precisietherapieën30,31,32,33. Daarom is er veel vraag naar een model dat geschikt is voor het screenen van geneesmiddelen met een semi-hoge doorvoer en het meetbaar vertonen van stralingseffecten, om krachtige radioprotectors en sensibilisatoren te valideren. Verschillende beschikbare modellen worden gebruikt in stralingsstudies en zijn betrokken bij experimenten met het screenen van geneesmiddelen. Hogere gewervelde dieren en zelfs het meest gebruikte in vivo model, muizen, zijn echter niet geschikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen, omdat het tijdrovend, kostbaar en uitdagend is om dergelijke screeningsexperimenten met deze modellen te ontwerpen. Evenzo zijn celkweekmodellen ideaal voor variëteiten van high-throughput drug screening experimenten34,35. Experimenten met celkweek zijn echter niet altijd pragmatisch, zeer reproduceerbaar of betrouwbaar, aangezien cellen in kweek hun gedrag aanzienlijk kunnen veranderen afhankelijk van de groeiomstandigheden en kinetiek. Ook vertonen variëteiten van celtypen differentiële stralingssensibilisatie. Met name 2D- en 3D-celkweeksystemen vertegenwoordigen niet het hele organismescenario, en daarom is het mogelijk dat de verkregen resultaten het werkelijke niveau van radiotoxiciteit niet samenvatten36,37. In dit opzicht biedt de zebravis verschillende voordelen bij het screenen op nieuwe radiosensibilisatoren en radioprotectors. Het gebruiksgemak, de grote koppelingsgrootte, de korte levensduur, de snelle embryonale ontwikkeling, de transparantie van het embryo en de kleine lichaamsgrootte maken de zebravis tot een geschikt model voor grootschalige screening van geneesmiddelen. Vanwege de bovenstaande voordelen kunnen experimenten gemakkelijk in korte tijd worden herhaald en kan het effect gemakkelijk worden waargenomen onder een ontleedmicroscoop in platen met meerdere putten. Vandaar dat de zebravis aan populariteit wint in onderzoek naar geneesmiddelenscreening met stralingsstudies38,39.
Het potentieel van zebravissen als bonafide model om stralingsmodificatoren te screenen is aangetoond in verschillende studies 40,41,42,43,44,45. Het radioprotectieve effect van potentiële radiomodificatoren, zoals nanodeeltje DF1, amifostine (WR-2721), DNA-reparatie-eiwitten KU80 en ATM, en getransplanteerde hematopoëtische stamcellen, en de effecten van radiosensibilisatoren, zoals flavopiridol en AG1478, in het zebravismodel zijn gerapporteerd 19,41,42,43,44,45,46 . Met behulp van hetzelfde systeem werd het radioprotectieve effect van DF-1 (fullereen nanodeeltje) zowel op systemisch als op orgaanspecifiek niveau beoordeeld, en ook het gebruik van zebravisembryo's voor screening van radioprotectoren werd verder onderzocht47. Onlangs werd de Kelulut-honing gerapporteerd als een radioprotector in zebravisembryo's en bleek de overleving van embryo's te verhogen en orgaanspecifieke schade, cellulaire DNA-schade en apoptose te voorkomen.
Evenzo werden de radioprotectieve effecten van polymeren die via de reactie van Hantzsch werden gegenereerd, gecontroleerd op zebravisembryo's in een high-throughput screening, en de bescherming werd voornamelijk verleend door cellen te beschermen tegen DNA-schade49. In een van de eerdere studies werd de lipofiele statine fluvastatine gevonden als een potentiële radiosensibilisator met behulp van het zebravismodel met deze benadering50. Evenzo worden gouden nanodeeltjes beschouwd als een ideale radiosensibilisator en zijn ze in veel onderzoeken gebruikt51,52.
De embryonale ontwikkeling bij zebravissen omvat splitsing in de eerste 3 uur waarin een eencellige zygote zich deelt om 2 cellen, 4 cellen, 8 cellen, 16 cellen, 32 cellen en 64 cellen te vormen die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd met een stereomicroscoop. Vervolgens bereikt het het blastula-stadium met 128 cellen (2,25 uur na de bevruchting, hpf), waarbij de cellen elke 15 minuten verdubbelen en de volgende fasen doorlopen: 256 cellen (2,5 hpf), 512 cellen (2,75 hpf) en het bereiken van 1.000+ cellen in slechts 3 uur (Figuur 1). Na 4 uur bereikt het ei het bolstadium, gevolgd door de vorming van een koepelvorm in de embryonale massa 7,53,54. De gastrulatie bij zebravissen begint vanaf 5,25 hpf54, waar het het schildstadium bereikt. Het schild geeft duidelijk de snelle convergentiebeweging van de cellen naar één kant van de kiemring aan (Figuur 1) en is een prominente en duidelijke fase van gastrulerende embryo's die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd53,54. Hoewel blootstelling aan straling van embryo's in elk stadium van hun ontwikkeling kan plaatsvinden, kan blootstelling aan straling tijdens gastrulatie meer duidelijke morfologische veranderingen ondergaan die een betere uitlezing van door straling geïnduceerde toxiciteiten mogelijk maken55; Evenzo kan de toediening van geneesmiddelen aan embryo's al vanaf 2 HPF54 worden gestart.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Zebravissen worden op grote schaal gebruikt in verschillende soorten onderzoek omdat ze een van de gemakkelijk te onderhouden gewervelde modellen zijn en verschillende kenmerken vertonen van een uniek en handig modelsysteem. Omdat zeer proliferatieve cellen gevoeliger zijn voor door straling geïnduceerde DNA-schade, zijn zebravisembryo's een eerstelijns in vivo model in stralingsonderzoek. Bovendien projecteert dit model het effect van straling en verschillende medicijnen binnen een korte tijd, samen met belangrijke biologische gebeurtenissen en bijbehorende reacties. Verschillende kankerstudies hebben zebravissen gebruikt en dit protocol is gebaseerd op het gebruik van stralingsmodificatoren in de context van radiotherapie en kanker. Deze methode kan gemakkelijk worden gebruikt om de effecten van verschillende geneesmiddelen op bestraalde en controlerende (niet-bestraalde) embryo's te valideren, waardoor geneesmiddelen worden geïdentificeerd als radiosensibiliserende of beschermende geneesmiddelen. Hoewel deze methodologie wordt gebruikt in de meeste experimenten met het screenen van geneesmiddelen, zijn de details van het experiment en de toxiciteitsbeoordeling met de achtergrond van blootstelling aan röntgenstraling beperkt of slechts kort behandeld, waardoor het moeilijk uit te voeren is. Dit protocol behandelt dit probleem en bespreekt de procedure en toxiciteitsevaluatie met een gedetailleerde illustratie. De procedure beschrijft een eenvoudige aanpak voor het gebruik van zebravisembryo's voor bestralingsstudies en op straling gebaseerde screening van geneesmiddelen met veel betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid.

De algemene lay-out van het protocol is weergegeven in figuur 2. Het effect van straling en de dosisafhankelijke karakterisering werd geëvalueerd met de volgende analyses.
Beoordeling van door röntgenstraling geïnduceerde toxiciteiten Met behulp van een stereomicroscoop werden de volgende afwijkingen beoordeeld en gekarakteriseerd na de medicamenteuze behandeling en/of bestraling. Volgens de OESO-richtlijnen 61 werden voor t...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

De zebravis is onlangs gebruikt als model om potentiële stralingsmodificatoren te valideren. Het huidige protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo's te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om het effect van verschillende behandelingen en bestraling te evalueren.

Zebravislarven als model om potentiële radiosensibilisatoren of beschermers te evalueren

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo's te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om de behandeling van verschillende medicijnen en straling te evalueren. Dit zal lezers helpen bij het instellen van een semi-high throughput drug screening met röntgenstraling met behulp van zebravisembryo's, die zal leiden bij de evaluatie van radiotoxiciteit en de effectiviteit van verschillende gebruikte medicijnen. Deze procedure kan worden gebruikt om verschillende geneesmiddelen te screenen en te valideren of te evalueren als potentiële radiosensibilisatoren of beschermers, die verder kunnen worden onderzocht of gebruikt op het gebied van radiotherapie of radiobiologie van kanker.Controleer om te beginnen de groeiende embryo's onder de ontleedmicroscoop. Identificeer het juiste stadium en verwijder eventuele dode of ongezonde embryo's. Zorg ervoor dat de bestraling en medicijndoses in een bepaald gastrulatiestadium worden gegeven.Voordat u met het experiment begint, verdeelt u de gezonde embryo's voorzichtig in de proefplaten met behulp van een pasteurpipet. Neem voor elke experimentele groep 15 tot 20 embryo's. Neem bij het opzetten van een stralingsexperiment een controlegroep op die niet bestraald is en een groep die alleen straling heeft.Verdeel de embryo's in een putplaat als de stralingsschilden de extra putjes kunnen bedekken en beschermen tegen straling terwijl de andere putjes worden blootgesteld aan een bepaalde stralingsdosis. Gebruik anders individuele platen of schijven om de embryo's per stralingsdosis te zien. Schakel de röntgenbestralingsmachine in en start de initialisatie en het opwarmen van de machine.Plaats de experimentele plaat onder de bestraling in de machine in het midden en zorg ervoor dat de plaat zich direct onder de röntgenbron bevindt. En stel dan de dosis in en start de röntgenfoto. Verwijder na voltooiing van de bestraling de platen, sluit het machineprogramma af, schakel de machine uit en controleer de platen onmiddellijk na bestraling onder de microscoop.Verwijder de dode embryo's en noteer hun aantal nadat u ze onder de ontleedmicroscoop hebt geëvalueerd. Plaats de platen terug in de incubator bij 28,5 graden Celsius. Verzamel gegevens met vooraf bepaalde tijdsintervallen nadat de straling is toegediend.Noteer alle mogelijke waarnemingen zoals overleving, uitkomstefficiëntie, ontwikkelingsstadium, aantal hartslagen, kromming van lichaam en staart, pericardiaal oedeem en verlenging van de dooierzak, microcefalie, ontwikkeling van de zwemblaas, algemene beweeglijkheid of activiteit, et cetera. Om foto's te maken, kiest u representatieve embryo's op een schoon objectglaasje. Controleer de embryo's onder de microscoop, oriënteer ze in een bepaalde richting.De overlevingscurve voor embryo's die zes uur na de bevruchting werden bestraald, toonde aan dat er in de controlegroep en embryo's die waren blootgesteld aan 2 grijs en 5 grijs, geen significante sterfte in embryo's was. Het aantal hartslagen per minuut suggereerde dat de hartslag enorm afnam bij verhoogde doses röntgenstraling. In de controlegroep werd met elk interval van 24 uur de hartslag zien toenemen.Ernstige cardiovasculaire vervorming wordt vermoed bij embryo's die zijn blootgesteld aan 15 grijze en 20 grijze straling omdat de hartslag enorm daalde. Verschillende fenotypische en ontwikkelingsstoornissen worden afgebeeld en geëvalueerd voor embryo's die op verschillende tijdstippen worden blootgesteld aan verschillende stralingsdoses. Morfologische waarnemingen voor het buigen van de wervelkolom of staart, misvorming van het hoofd en microcefalie, ontwikkelingsstoornissen, pericardiaal oedeem, misvormingen van de dooierzak, misvormingen van de zwemblaas en veranderingen in de oogstructuur werden ook uitgevoerd Voor het protocol dat we hebben aangetoond, zijn het kiezen van gezonde embryo's, de juiste plaatsing van de embryo's in de bestralingsprocedure en een goede evaluatie van de kruisafwijkingen de sleutel tot deze procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

De Colon-26 carcinoom Tumor-dragende Mouse als een model voor de studie van kankercachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...