Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Le laboratoire de SS et le laboratoire de RKS sont financés par des subventions de DBT et de SERB, en Inde. APM est récipiendaire de la bourse de l’ICMR du gouvernement de l’Inde. Le Programme du diplôme est récipiendaire d’une bourse du CSIR du gouvernement de l’Inde. L’ONU est récipiendaire de la bourse DST-Inspire du gouvernement de l’Inde. La figure 2 a été générée à l’aide de Biorender (https://biorender.com).

La présente étude a été menée avec l’approbation préalable et en suivant les directives du Comité institutionnel d’éthique animale de l’Institut des sciences de la vie de Bhubaneswar. Tous les travaux d’entretien et d’élevage des poissons-zèbres ont été effectués dans une installation piscicole ambiante à 28,5 °C, et les embryons ont été maintenus dans un incubateur à demande biologique en oxygène (DBO) à une température de 28,5 °C. Ici, la souche AB du poisson-zèbre a été utilisée, e...

Les poissons-zèbres sont utilisés comme modèles précieux dans de nombreuses études, y compris plusieurs types de recherche sur le cancer. Ce modèle fournit une plate-forme utile pour le dépistage de drogues à grande échelle67,68. Comme toute autre méthode d’évaluation de la toxicité, l’évaluation quantitative des changements biologiques majeurs lors d’une radiothérapie et/ou d’un traitement médicamenteux est la partie la plus cruciale de ce...

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle animal bien connu qui a été largement utilisé dans la recherche au cours des 3 dernières décennies. C’est un petit poisson d’eau douce facile à élever et à élever dans des conditions de laboratoire. Le poisson-zèbre a été largement utilisé pour diverses études développementales et toxicologiques 1,2,3,4,5,6,7,8. Le poisson-zèbre a une fécondité élevée et une génération embryonnaire courte ; Les embryons sont adaptés au suivi de différents stades de développement, sont visuellement transparents et se prêtent à diverses manipulations génétiques et à des plates-formes de criblage à haut débit 9,10,11,12,13,14. En outre, le poisson-zèbre fournit une imagerie in toto et en direct pour laquelle son processus de développement et les différentes déformations en présence de diverses substances ou facteurs toxiques peuvent être facilement étudiés à l’aide de la microscopie stéréoscopique ou fluorescente 7,15,16.
La radiothérapie est l’un des principaux modes thérapeutiques utilisés dans le traitement du cancer 17,18,19,20,21,22,23,24. Cependant, la radiothérapie du cancer nécessite des radioprotecteurs potentiels pour empêcher les cellules saines normales de mourir tout en tuant les cellules malignes ou pour protéger la santé humaine pendant le traitement impliquant des radiations à haute énergie 25,26,27,28,29. À l’inverse, de puissants radiosensibilisants sont également à l’étude pour augmenter l’efficacité des radiations à tuer les cellules malignes, en particulier dans les thérapies ciblées et de précision30,31,32,33. Par conséquent, pour valider des radioprotecteurs et des sensibilisateurs puissants, un modèle adapté au criblage de médicaments à semi-haut débit et présentant des effets mesurables des rayonnements est fortement sollicité. Plusieurs modèles disponibles sont utilisés dans les études sur les rayonnements et impliqués dans les expériences de dépistage de drogues. Cependant, les vertébrés supérieurs et même le modèle in vivo le plus couramment utilisé, les souris, ne conviennent pas au criblage de médicaments à grande échelle, car il est long, coûteux et difficile de concevoir de telles expériences de dépistage avec ces modèles. De même, les modèles de culture cellulaire sont idéaux pour les variétés d’expériences de criblage de médicaments à haut débit34,35. Cependant, les expériences impliquant la culture cellulaire ne sont pas toujours pragmatiques, hautement reproductibles ou fiables, car les cellules en culture peuvent modifier considérablement leur comportement en fonction des conditions de croissance et de la cinétique. De plus, les variétés de types de cellules présentent une sensibilisation différentielle aux rayonnements. Notamment, les systèmes de culture cellulaire 2D et 3D ne représentent pas le scénario de l’organisme entier et, par conséquent, les résultats obtenus peuvent ne pas récapituler le niveau réel de radiotoxicité36,37. À cet égard, le poisson-zèbre offre plusieurs avantages dans le dépistage de nouveaux radiosensibilisateurs et radioprotecteurs. La facilité de manipulation, la grande taille de la couvée, la courte durée de vie, le développement embryonnaire rapide, la transparence de l’embryon et la petite taille du corps font du poisson-zèbre un modèle approprié pour le dépistage de drogues à grande échelle. En raison des avantages ci-dessus, les expériences peuvent être facilement répétées en peu de temps et l’effet peut être facilement observé sous un microscope à dissection dans des plaques multi-puits. Par conséquent, le poisson-zèbre gagne en popularité dans la recherche sur le dépistage des drogues impliquant des études sur les radiations38,39.
Le potentiel du poisson-zèbre en tant que modèle authentique pour le criblage des modificateurs de rayonnement a été démontré dans diverses études 40,41,42,43,44,45. L’effet radioprotecteur des modificateurs radio potentiels, tels que la nanoparticule DF1, l’amifostine (WR-2721), les protéines de réparation de l’ADN KU80 et ATM, et les cellules souches hématopoïétiques transplantées, ainsi que les effets des radiosensibilisateurs, tels que le flavopiridol et l’AG1478, dans le modèle du poisson-zèbre ont été rapportés 19,41,42,43,44,45,46 . En utilisant le même système, l’effet radioprotecteur de DF-1 (nanoparticule de fullerène) a été évalué à la fois au niveau systémique et au niveau d’un organe spécifique, et l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour le criblage de radioprotecteurs a également été explorée plus en détail47. Récemment, le miel de Kelulut a été signalé comme radioprotecteur dans les embryons de poisson-zèbre et s’est avéré augmenter la survie des embryons et prévenir les dommages spécifiques aux organes, les dommages à l’ADN cellulaire et l’apoptose48.
De même, les effets radioprotecteurs des polymères générés par la réaction de Hantzsch ont été vérifiés sur des embryons de poisson-zèbre dans le cadre d’un criblage à haut débit, et la protection a été principalement conférée par la protection des cellules contre les dommages à l’ADN49. Dans l’une des études précédentes, la statine lipophile fluvastatine a été trouvée comme radiosensibilisant potentiel en utilisant le modèle du poisson-zèbre avec cette approche50. De même, les nanoparticules d’or sont considérées comme un radiosensibilisateur idéal et ont été utilisées dans de nombreuses études51,52.
Le développement embryonnaire chez le poisson-zèbre implique un clivage dans les 3 premières heures au cours desquelles un zygote unicellulaire se divise pour former 2 cellules, 4 cellules, 8 cellules, 16 cellules, 32 cellules et 64 cellules qui sont facilement identifiées avec un stéréomicroscope. Ensuite, il atteint le stade blastula avec 128 cellules (2,25 h après la fécondation, hpf), où les cellules doublent toutes les 15 minutes et passent par les étapes suivantes : 256 cellules (2,5 hpf), 512 cellules (2,75 hpf) et atteignent 1 000+ cellules en seulement 3 h (Figure 1). À 4 h, l’œuf atteint le stade sphérique, suivi de la formation d’un dôme dans la masse embryonnaire 7,53,54. La gastrulation chez le poisson-zèbre commence à partir de 5,25 hpf54, où elle atteint le stade de bouclier. Le bouclier indique clairement le mouvement de convergence rapide des cellules d’un côté de l’anneau germinatif (Figure 1) et constitue une phase proéminente et distincte de la gastrulation des embryons qui peut être facilement identifiée53,54. Bien que l’exposition aux rayonnements des embryons puisse se faire à n’importe quel stade de leur développement, l’exposition aux rayonnements pendant la gastrulation pourrait avoir des changements morphologiques plus distincts, ce qui faciliterait une meilleure lecture des toxicités induites par les rayonnements55 ; De même, l’administration de médicaments aux embryons peut être commencée dès 2 HPF54.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Le poisson-zèbre est largement utilisé dans plusieurs types de recherche car il est l’un des modèles de vertébrés faciles à entretenir et présente plusieurs caractéristiques d’un système de modèle unique et pratique. Comme les cellules hautement prolifératives sont plus sensibles aux dommages à l’ADN induits par les radiations, les embryons de poisson-zèbre sont un modèle in vivo de première ligne dans la recherche sur les rayonnements. De plus, ce modèle projette l’effet des rayonnements et de différents médicaments dans un court laps de temps, ainsi que les événements biologiques majeurs et les réponses associées. Plusieurs études sur le cancer ont utilisé le poisson-zèbre, et ce protocole est basé sur l’utilisation de modificateurs de rayonnement dans le contexte de la radiothérapie et du cancer. Cette méthode peut être facilement utilisée pour valider les effets de différents médicaments sur les embryons irradiés et témoins (non irradiés), identifiant ainsi les médicaments comme des médicaments radiosensibilisants ou protecteurs. Bien que cette méthodologie soit utilisée dans la plupart des expériences de dépistage de drogues, les détails de l’expérience et l’évaluation de la toxicité avec le contexte de l’exposition aux rayons X sont limités ou seulement brièvement abordés, ce qui la rend difficile à réaliser. Ce protocole aborde cette question et traite de la procédure et de l’évaluation de la toxicité avec une illustration détaillée. La procédure décrit une approche simple pour l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour les études de radiation et le dépistage de médicaments à base de rayonnement avec beaucoup de fiabilité et de reproductibilité.

La présentation générale du protocole est illustrée à la figure 2. L’effet du rayonnement et la caractérisation en fonction de la dose ont été évalués à l’aide des analyses suivantes.
Évaluation des toxicités induites par les rayons X À l’aide d’un stéréomicroscope, les anomalies suivantes ont été évaluées et caractérisées après le traitement médicamenteux et/ou la radiothérapie. Conformément ...

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Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Le poisson-zèbre a récemment été exploité comme modèle pour valider les modificateurs potentiels de rayonnement. Le présent protocole décrit les étapes détaillées de l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour des expériences de dépistage basées sur les rayonnements et certaines approches observationnelles pour évaluer l’effet de différents traitements et rayonnements.

Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Ce protocole décrit les étapes détaillées de l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour des expériences de dépistage basées sur les rayonnements et certaines approches observationnelles pour évaluer le traitement de différents médicaments et rayonnements. Cela aidera les lecteurs à établir un criblage de médicaments à semi-haut débit impliquant une exposition aux rayons X à l’aide d’embryons de poisson-zèbre, ce qui guidera l’évaluation de la radiotoxicité et de l’efficacité des différents médicaments utilisés. Cette procédure peut être utilisée pour dépister et valider ou évaluer différents médicaments en tant que radiosensibilisants ou protecteurs potentiels, qui peuvent être explorés ou utilisés dans le domaine de la radiothérapie ou de la radiobiologie du cancer.Pour commencer, surveillez les embryons en croissance au microscope à dissection. Identifiez le stade approprié et retirez tous les embryons morts ou en mauvaise santé. Assurez-vous que la stadification de l’embryon est adéquate grâce à la radiothérapie et que des doses de médicament seront administrées à un stade particulier de la gastrulation.Avant de commencer l’expérience, répartissez soigneusement les embryons sains dans les plaques expérimentales à l’aide d’une pipette Pasteur. Pour chaque groupe expérimental, prélever 15 à 20 embryons. Lors de la mise en place d’une expérience sur les rayonnements, inclure un groupe témoin non irradié et un groupe témoin uniquement des rayonnements.Distribuez les embryons dans une plaque de puits si les écrans anti-rayonnement peuvent couvrir et protéger les puits supplémentaires des rayonnements pendant que les autres puits sont exposés à une dose de rayonnement particulière. Sinon, utilisez des plaques ou des disques individuels pour voir les embryons par dose de rayonnement. Allumez l’irradiateur à rayons X et lancez l’initialisation et le préchauffage de la machine.Placez la plaque expérimentale sous l’irradiateur à l’intérieur de la machine au centre, en veillant à ce que la plaque se trouve directement sous la source de rayons X. Et puis réglez la dose et commencez la radiographie. Une fois l’irradiation terminée, retirez les plaques, arrêtez le programme de la machine, éteignez la machine et vérifiez les plaques au microscope immédiatement après la radiothérapie.Retirez les embryons morts et enregistrez leur nombre après les avoir évalués au microscope à dissection. Remettez les plaques dans l’incubateur à 28,5 degrés Celsius. Recueillir des données à des intervalles de temps prédéterminés après l’administration du rayonnement.Consignez toutes les observations possibles telles que la survie, l’efficacité de l’éclosion, le stade de développement, le nombre de battements cardiaques, la courbure du corps et de la queue, l’œdème péricardique et l’extension du sac vitellin, la microcéphalie, le développement de la vessie natatoire, la motilité ou l’activité générale, et cetera. Pour capturer des images, choisissez des embryons représentatifs sur une lame propre. Vérifiez les embryons au microscope, orientez-les dans une direction particulière.La courbe de survie pour les embryons irradiés six heures après la fécondation a montré que dans le groupe témoin et les embryons exposés à 2 gris et 5 gris, il n’y avait pas de mort significative chez les embryons. Le nombre de battements cardiaques par minute a suggéré que la fréquence cardiaque diminuait énormément avec l’augmentation des doses de rayons X. Dans le groupe témoin, à tous les intervalles de 24 heures, on a constaté une augmentation de la fréquence cardiaque.Une déformation cardiovasculaire sévère est suspectée chez les embryons exposés à des radiations de 15 et 20 gris alors que le rythme cardiaque a énormément chuté. Différents défauts phénotypiques et de développement sont représentés et évalués pour les embryons exposés à des doses variables de rayonnement à différents moments. Des observations morphologiques de la flexion de la colonne vertébrale ou de la queue, des malformations de la tête et de la microcéphalie, des défauts de développement, un œdème péricardique, des déformations du sac vitellin, des déformations de la vessie natatoire et des modifications de la structure de l’œil ont également été effectuées.

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