Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

המעבדה של SS והמעבדה של RKS ממומנות על ידי מענקים של DBT ו- SERB, הודו. APM היא זוכת מלגת ICMR, ממשלת הודו. DP היא זוכת מלגת CSIR, ממשלת הודו. האו"ם זכה במלגת DST-Inspire, ממשלת הודו. איור 2 נוצר באמצעות Biorender (https://biorender.com).

המחקר הנוכחי נערך באישור מראש ובהתאם להנחיות הוועדה האתית המוסדית לבעלי חיים, המכון למדעי החיים, בובנסוואר. כל התחזוקה והרבייה של דגי הזברה נערכו במתקן לגידול דגי סביבה בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס, והעוברים נשמרו באינקובטור ביקוש חמצן ביולוגי (BOD) בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. כאן נעשה ש?...

דגי זברה משמשים כמודלים בעלי ערך במחקרים רבים, כולל סוגים שונים של חקר הסרטן. מודל זה מספק פלטפורמה שימושית לבדיקת סמים בקנה מידה גדול67,68. כמו כל שיטה אחרת להערכת רעילות, ההערכה הכמותית של השינויים הביולוגיים העיקריים בעת קרינה ו / או טיפול תרופתי היא החלק הח...

דג הזברה (Danio rerio) הוא מודל ידוע של בעלי חיים שנמצא בשימוש נרחב במחקר במהלך 3 העשורים האחרונים. זהו דג מים מתוקים קטן שקל לגדל ולגדל בתנאי מעבדה. דג הזברה נמצא בשימוש נרחב במחקרים התפתחותיים וטוקסיקולוגיים שונים 1,2,3,4,5,6,7,8. דג הזברה הוא בעל פריון גבוה ודור עוברי קצר; העוברים מתאימים למעקב אחר שלבי התפתחות שונים, הם שקופים מבחינה חזותית, והם מתאימים למגוון רחב של מניפולציות גנטיות ופלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה 9,10,11,12,13,14. מלבד זאת, דג הזברה מספק טוטו והדמיה חיה שעבורה ניתן ללמוד בקלות את תהליך התפתחותו ועיוותים שונים בנוכחות חומרים או גורמים רעילים שונים באמצעות סטריאו או מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7,15,16.
רדיותרפיה היא אחת הדרכים הטיפוליות העיקריות המשמשות לטיפול בסרטן 17,18,19,20,21,22,23,24. עם זאת, הקרנות סרטן דורשות רדיואקטיבים פוטנציאליים כדי להגן על תאים בריאים נורמליים מפני מוות תוך הריגת תאים ממאירים או לשמור על בריאות האדם במהלך טיפול הכולל קרינה באנרגיה גבוהה 25,26,27,28,29. לעומת זאת, רדיוסנסיטיזרים חזקים נחקרים גם כדי להגביר את יעילות הקרינה להרוג תאים ממאירים, במיוחד בטיפולים ממוקדים ומדויקים 30,31,32,33. לכן, כדי לאמת רדיו-מגינים ורגישים חזקים, מודל המתאים לסינון תרופות בתפוקה גבוהה למחצה ומציג השפעות קרינה באופן מדיד מתבקש מאוד. מספר מודלים זמינים משמשים במחקרי קרינה ומעורבים בניסויי סינון תרופות. עם זאת, בעלי חוליות גבוהים יותר ואפילו מודל ה-in vivo הנפוץ ביותר, עכברים, אינם מתאימים לבדיקות סקר בקנה מידה גדול מכיוון שזה גוזל זמן, יקר ומאתגר לתכנן ניסויי סינון כאלה עם מודלים אלה. באופן דומה, מודלים של תרביות תאים אידיאליים עבור סוגים שונים של ניסויי סינון תרופות בתפוקה גבוהה34,35. עם זאת, ניסויים המערבים תרביות תאים אינם תמיד פרגמטיים, ניתנים לשחזור או אמינים מכיוון שתאים בתרבית עשויים לשנות את התנהגותם באופן ניכר בהתאם לתנאי הגידול והקינטיקה שלהם. כמו כן, סוגים שונים של תאים מראים רגישות דיפרנציאלית לקרינה. יש לציין כי מערכות תרבית תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות אינן מייצגות את תרחיש האורגניזם כולו, ולכן, התוצאות המתקבלות עשויות שלא לשחזר את רמת הרדיוטוקסיות בפועל36,37. בהקשר זה, דג הזברה מספק מספר יתרונות בהקרנה עבור radiosensitizers חדשים radioprotectors. קלות הטיפול, גודל המצמד הגדול, תוחלת החיים הקצרה, ההתפתחות העוברית המהירה, שקיפות העובר וגודל הגוף הקטן הופכים את דג הזברה למודל מתאים לבדיקת תרופות בקנה מידה גדול. בשל היתרונות הנ"ל, ניתן לחזור על ניסויים בקלות תוך זמן קצר, וניתן לצפות באפקט בקלות תחת מיקרוסקופ מנתח בלוחות מרובי בארות. לפיכך, דג הזברה צובר פופולריות במחקר סינון תרופות הכולל מחקרי קרינה38,39.
הפוטנציאל של דגי זברה כמודל בונאפיד לסינון משנים של קרינה הוכח במחקרים שונים 40,41,42,43,44,45. ההשפעה הרדיו-מגינה של משנים פוטנציאליים של רדיו, כגון ננו-חלקיקים DF1, אמיפוסטין (WR-2721), חלבוני תיקון DNA KU80 ו-ATM, ותאי גזע המטופויטיים מושתלים, וההשפעות של רדיוסנסיטיזרים, כגון פלבופרידול ו-AG1478, במודל דגי הזברה דווחו 19,41,42,43,44,45,46 . באמצעות אותה מערכת, ההשפעה הרדיו-מגינה של DF-1 (ננו-חלקיק פולרן) הוערכה הן ברמה המערכתית והן ברמה הספציפית לאיברים, וגם השימוש בעוברים של דגי זברה לבדיקת רדיו-פרוטקטורים נחקר עוד יותר47. לאחרונה דווח על דבש קלולוט כמגן רדיו בעוברים של דגי זברה ונמצא כי הוא מגביר את הישרדות העובר ומונע נזק ספציפי לאיברים, נזק לדנ"א התאי ואפופטוזיס48.
באופן דומה, ההשפעות הרדיו-הגנתיות של פולימרים שנוצרו באמצעות תגובתו של האנטש נבדקו על עוברים של דגי זברה בסינון בתפוקה גבוהה, וההגנה ניתנה בעיקר על ידי הגנה על התאים מפני נזק לדנ"א49. באחד המחקרים הקודמים, סטטין פלובסטטין ליפופילי נמצא כרדיוסנסיטיזר פוטנציאלי באמצעות מודל דג הזברה בגישה זו50. באופן דומה, ננו-חלקיקי זהב נחשבים לרדיו-סנסיטיזר אידיאלי ושימשו במחקרים רבים51,52.
ההתפתחות העוברית בדגי זברה כרוכה בפיצול ב-3 השעות הראשונות שבהן זיגוטה חד-תאית מתחלקת ליצירת 2 תאים, 4 תאים, 8 תאים, 16 תאים, 32 תאים ו-64 תאים שניתן לזהות בקלות באמצעות סטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן, הוא מגיע לשלב הבלסטולה עם 128 תאים (2.25 שעות לאחר ההפריה, hpf), שבו התאים מכפילים את עצמם כל 15 דקות וממשיכים דרך השלבים הבאים: 256 תאים (2.5 hpf), 512 תאים (2.75 hpf), ומגיעים ל-1,000+ תאים תוך 3 שעות בלבד (איור 1). בשעה 4 הביצית מגיעה לשלב הכדור, ואחריו נוצרת צורת כיפה במסה העוברית 7,53,54. הגסטרולציה בדגי זברה מתחילה מ-5.25 כ"ס54, שם היא מגיעה לשלב המגן. המגן מציין בבירור את תנועת ההתכנסות המהירה של התאים לצד אחד של טבעת הנבט (איור 1), והוא שלב בולט ומובהק של עוברים מתגבשים שניתן לזהות בקלות53,54. אף על פי שחשיפה לקרינה לעוברים יכולה להיעשות בכל שלב של התפתחותם, חשיפה לקרינה במהלך גסטרולציה עשויה להיות בעלת שינויים מורפולוגיים ברורים יותר המאפשרים קריאה טובה יותר של רעילות הנגרמת על ידי קרינה55; באופן דומה, מתן תרופות לעוברים יכול להתחיל כבר 2 HPF54.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב במספר סוגים של מחקר מכיוון שהם אחד המודלים המתוחזקים בקלות של בעלי חוליות ומציגים מספר תכונות של מערכת מודל ייחודית ונוחה. מכיוון שתאים בעלי שגשוג גבוה רגישים יותר לנזק לדנ"א הנגרם על ידי קרינה, עוברים של דגי זברה הם מודל in vivo בחזית במחקר הקרינה. בנוסף, מודל זה מקרין את השפעת הקרינה ותרופות שונות תוך זמן קצר, יחד עם אירועים ביולוגיים מרכזיים ותגובות נלוות. מספר מחקרי סרטן השתמשו בדגי זברה, ופרוטוקול זה מבוסס על שימוש במשנים קרינה בהקשר של הקרנות וסרטן. שיטה זו יכולה לשמש בקלות כדי לאמת את ההשפעות של תרופות שונות על עוברים מוקרנים ובקרה (שאינם מוקרנים), ובכך לזהות תרופות כתרופות רגישות רדיו או תרופות הגנה. למרות שמתודולוגיה זו משמשת ברוב ניסויי סינון התרופות, פרטי הניסוי והערכת הרעילות על רקע החשיפה לקרינת רנטגן מוגבלים או מטופלים רק בקצרה, מה שמקשה על ביצועו. פרוטוקול זה מטפל בבעיה זו ודן בהליך ובהערכת רעילות עם המחשה מפורטת. הנוהל מתאר גישה פשוטה לשימוש בעוברים של דגי זברה למחקרי קרינה ולבדיקת תרופות מבוססות קרינה עם אמינות ויכולת שחזור רבה.

הפריסה הכוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 2. השפעת הקרינה והאפיון באופן תלוי מינון הוערכו בניתוחים הבאים.
הערכה של רעילות הנגרמת על ידי קרני רנטגן באמצעות סטריאומיקרוסקופ הוערכו ואופיינו החריגות הבאות לאחר הטיפול התרופתי ו/או הקרינה. על ?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת הטיפול בתרופות וקרינה שונות. זה יעזור לקוראים להגדיר סינון תרופות בתפוקה גבוהה למחצה הכולל חשיפה לקרני רנטגן באמצעות עוברים של דגי זברה, אשר ינחה בהערכת רעילות רדיוטוקסית ואת היעילות של תרופות שונות בשימוש. הליך זה יכול לשמש כדי לסנן ולאמת או להעריך תרופות שונות כמו radiosensitizers פוטנציאליים או מגינים, אשר ניתן לחקור עוד יותר או להשתמש בתחום של הקרנות סרטן או רדיוביולוגיה.כדי להתחיל, עקוב אחר העוברים הגדלים תחת המיקרוסקופ המנתח. זהה את השלב הנכון והסר עוברים מתים או לא בריאים. יש לוודא שההיערכות הנאותה של העובר היא הקרינה ומנות התרופה יינתנו בשלב מסוים של גסטרולציה.לפני תחילת הניסוי, בזהירות להפיץ את העוברים הבריאים בצלחות הניסוי בעזרת פיפטה פסטר. עבור כל קבוצת ניסוי, לקחת 15 עד 20 עוברים. בעת הגדרת ניסוי קרינה, כלול קבוצת בקרה שאינה מוקרנת וקבוצת קרינה בלבד.פזרו את העוברים בצלחת באר אם מגיני הקרינה יכולים לכסות ולהגן על הבארות הנוספות מפני קרינה בעוד הבארות האחרות חשופות למנת קרינה מסוימת. אחרת, השתמש בצלחות או דיסקים בודדים כדי לראות את העוברים בכל מנת קרינה. הפעל את מכונת הקרנת הרנטגן והתחל את אתחול המכשיר והתחממותו.הניחו את צלחת הניסוי מתחת למקרין בתוך המכונה במרכז, וודאו שהצלחת נמצאת ישירות מתחת למקור הרנטגן. ואז להגדיר את המינון ולהתחיל את הרנטגן. לאחר סיום ההקרנה, הוציאו את הלוחות, כבו את תוכנית המכונה, כבו את המכונה ובדקו את הצלחות תחת המיקרוסקופ מיד לאחר הקרינה.הסר את העוברים המתים, ורשום את מספרם לאחר הערכתם תחת המיקרוסקופ המנתח. מחזירים את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. לאסוף נתונים בפרקי זמן קבועים מראש לאחר מתן הקרינה.רשום את כל התצפיות האפשריות כגון הישרדות, יעילות בקיעה, שלב ההתפתחות, ספירת פעימות לב, עקמומיות הגוף והזנב, בצקת קרום הלב והרחבת שק החלמון, מיקרוצפליה, התפתחות שלפוחית השתן, תנועתיות או פעילות כללית וכו '. כדי לצלם תמונות, בחר עוברים מייצגים בשקופית נקייה. בדוק את העוברים מתחת למיקרוסקופ, לכוון אותם לכיוון מסוים.עקומת ההישרדות של עוברים שהוקרנו שש שעות לאחר ההפריה הצביעה על כך שבקבוצת הביקורת ובעוברים שנחשפו ל-2 אפורים ו-5 אפורים, לא היה מוות משמעותי בעוברים. ספירת פעימות הלב לדקה הצביעה על כך שקצב הלב ירד מאוד עם מינונים מוגברים של קרינת רנטגן. בקבוצת הביקורת, בכל מרווח של 24 שעות, קצב הלב נראה עולה.קיים חשד לעיוות קרדיווסקולרי חמור בעוברים שנחשפו לקרינה של 15 ו-20 קרינה אפורה כאשר קצב הלב ירד מאוד. פגמים פנוטיפיים והתפתחותיים שונים מתוארים ומוערכים עבור עוברים שנחשפו למינונים שונים של קרינה בנקודות זמן שונות. כמו כן בוצעו תצפיות מורפולוגיות לכיפוף עמוד השדרה או הזנב, מום ראש ומיקרוצפליה, פגמים בהתפתחות, בצקת קרום הלב, עיוותים בשק החלמון, עיוותים בשלפוחית השחייה ושינויים במבנה העין לצורך הפרוטוקול שהדגמנו, בחירת עוברים בריאים, מיקום נכון של העוברים במקרין והערכה נכונה של החריגות הצולבות הם המפתח להליך זה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

נוהל מקיף כדי להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; ביצועים של סרטן ננו-רפואה

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

יבש הדם ולנקודות סרום ככלי שימושי עבור אחסון מדגם להעריך סמנים ביולוגיים לסרטן

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...