Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

SSs laboratorium og RKSs laboratorium er finansiert av tilskudd fra DBT og SERB, India. APM er mottaker av ICMR-stipendet, Government of India. DP er mottaker av CSIR-fellesskapet, Government of India. FN er mottaker av DST-Inspire fellowship, Government of India. Figur 2 ble generert ved hjelp av Biorender (https://biorender.com).

Denne studien ble gjennomført med forhåndsgodkjenning fra og etter retningslinjene fra Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Alt vedlikehold og avl av sebrafisk ble utført ved et omgivende fiskekulturanlegg ved 28,5 °C, og embryoene ble opprettholdt i en biologisk oksygenbehov (BOD) inkubator ved en temperatur på 28,5 °C. Her ble sebrafiskens AB-stamme brukt, og iscenesettelsen ble utført i henhold til Kimmel et al.54. Røntgenstråling ble gitt v...

Sebrafisk brukes som verdifulle modeller i mange studier, inkludert flere typer kreftforskning. Denne modellen gir en nyttig plattform for storskala narkotikascreening67,68. Som enhver annen toksisitetsevalueringsmetode er den kvantitative evalueringen av de store biologiske endringene ved stråling og / eller medikamentell behandling den mest avgjørende delen av denne protokollen. I slike studier må overlevelse ikke være det eneste kriteriet for å observere ...

Sebrafisk (Danio rerio) er en velkjent dyremodell som har vært mye brukt i forskning de siste 3 tiårene. Det er en liten ferskvannsfisk som er lett å oppdrette og avle under laboratorieforhold. Sebrafisken har vært mye brukt i ulike utviklings- og toksikologiske studier 1,2,3,4,5,6,7,8. Sebrafisken har høy fruktbarhet og kort embryonal generasjon; Embryoene er egnet for å spore forskjellige utviklingsstadier, er visuelt gjennomsiktige og er mottagelige for varianter av genetisk manipulasjon og screeningsplattformermed høy gjennomstrømning 9,10,11,12,13,14. Dessuten gir sebrafisken in toto og levende bildebehandling for hvilken dens utviklingsprosess og forskjellige deformiteter i nærvær av forskjellige giftige stoffer eller faktorer lett kan studeres ved hjelp av stereo eller fluorescerende mikroskopi 7,15,16.
Strålebehandling er en av de viktigste terapeutiske modusene som brukes i behandling av kreft 17,18,19,20,21,22,23,24. Imidlertid krever kreftstrålebehandling potensielle radioprotektorer for å beskytte normale friske celler mot å dø mens de dreper ondartede celler eller beskytter menneskers helse under behandling som involverer høyenergistrålinger 25,26,27,28,29. Omvendt blir potente radiosensibilisatorer også undersøkt for å øke effektiviteten av stråling for å drepe ondartede celler, spesielt i målrettede og presisjonsterapier30,31,32,33. Derfor, for å validere potente radioprotektorer og sensibilisatorer, er en modell egnet for semi-high-throughput medikamentscreening og målbart utstilling av strålingseffekter svært etterspurt. Flere tilgjengelige modeller brukes i strålestudier og er involvert i narkotikascreeningsforsøk. Imidlertid er høyere vertebrater og til og med den mest brukte in vivo-modellen, mus, uegnet for storskala legemiddelscreening fordi det er tidkrevende, kostbart og utfordrende å designe slike screeningseksperimenter med disse modellene. På samme måte er cellekulturmodeller ideelle for varianter av narkotikascreeningseksperimenter med høy gjennomstrømning34,35. Imidlertid er eksperimenter som involverer cellekultur ikke alltid pragmatiske, svært reproduserbare eller pålitelige, da celler i kultur kan markert endre deres oppførsel i henhold til vekstbetingelsene og kinetikken. Også varianter av celletyper viser differensiell strålingssensibilisering. Spesielt representerer 2D- og 3D-cellekultursystemer ikke hele organismescenariet, og dermed kan de oppnådde resultatene ikke rekapitulere det faktiske nivået av radiotoksisitet36,37. I denne forbindelse gir sebrafisken flere fordeler ved screening for nye radiosensibilisatorer og radioprotektorer. Den enkle håndteringen, stor clutchstørrelse, kort levetid, rask embryonal utvikling, embryogjennomsiktighet og liten kroppsstørrelse gjør sebrafisken til en egnet modell for storskala legemiddelscreening. På grunn av de ovennevnte fordelene kan eksperimenter lett gjentas på kort tid, og effekten kan lett observeres under et dissekerende mikroskop i flerbrønnsplater. Derfor blir sebrafisken stadig mer populær i narkotikascreeningsforskning som involverer strålingsstudier38,39.
Potensialet til sebrafisk som en bonafide modell for å skjerme strålingsmodifikatorer har blitt demonstrert i ulike studier 40,41,42,43,44,45. Den radiobeskyttende effekten av potensielle radiomodifikatorer, som nanopartikkel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparasjonsproteiner KU80 og ATM, og transplanterte hematopoietiske stamceller, og effekten av radiosensibilisatorer, som flavopiridol og AG1478, i sebrafiskmodellen er rapportert 19,41,42,43,44,45,46 . Ved hjelp av det samme systemet ble den radioprotektive effekten av DF-1 (fullerene nanopartikkel) vurdert både på systemisk og organspesifikt nivå, og også bruken av sebrafiskembryoer for radioprotektorscreening ble videre utforsket47. Nylig ble Kelulut-honningen rapportert som en radiobeskytter i sebrafiskembryoer og ble funnet å øke embryooverlevelsen og forhindre organspesifikk skade, cellulær DNA-skade og apoptose48.
På samme måte ble de radioprotektive effektene av polymerer generert via Hantzschs reaksjon kontrollert på sebrafiskembryoer i en høy gjennomstrømningsscreening, og beskyttelsen ble hovedsakelig gitt ved å beskytte celler mot DNA-skade49. I en av de tidligere studiene ble det lipofile statinfluvastatinet funnet som en potensiell radiosensibilisator ved bruk av sebrafiskmodellen med denne tilnærmingen50. Tilsvarende anses gull nanopartikler å være en ideell radiosensibilisator og har blitt brukt i mange studier51,52.
Den embryonale utviklingen i sebrafisk innebærer spaltning i de første 3 timene hvor en encellet zygote deler seg for å danne 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler og 64 celler som lett identifiseres med et stereomikroskop. Deretter oppnår den blastulastadiet med 128 celler (2,25 timer etter befruktning, hpf), hvor cellene dobles hvert 15. minutt og fortsetter gjennom følgende stadier: 256 celler (2,5 hpf), 512 celler (2,75 hpf) og når 1000+ celler på bare 3 timer (figur 1). Ved 4 timer oppnår egget kuletrinnet, etterfulgt av dannelsen av en kuppelform i embryonalmassen 7,53,54. Gastruleringen i sebrafisk starter fra 5,25 hpf54, hvor den når skjoldstadiet. Skjoldet indikerer tydelig den raske konvergensbevegelsen av cellene til den ene siden av kimringen (figur 1) og er en fremtredende og distinkt fase av gastrulaterende embryoer som lett kan identifiseres53,54. Selv om strålingseksponering for embryoer kan gjøres på et hvilket som helst stadium av utviklingen, kan strålingseksponering under gastrulering ha tydeligere morfologiske endringer som muliggjør bedre avlesninger av strålingsinduserte toksisiteter55; På samme måte kan administrasjon av legemidler til embryoer startes så tidlig som 2 HPF54.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Sebrafisk er mye brukt i flere typer forskning fordi de er en av de lett vedlikeholdte virveldyrmodellene og viser flere funksjoner i et unikt og praktisk modellsystem. Siden svært proliferative celler er mer utsatt for strålingsindusert DNA-skade, er sebrafiskembryoer en frontlinje in vivo-modell i strålingsforskning. I tillegg projiserer denne modellen effekten av stråling og ulike medikamenter i løpet av kort tid, sammen med store biologiske hendelser og tilhørende responser. Flere kreftstudier har brukt sebrafisk, og denne protokollen er basert på bruk av strålemodifikatorer i sammenheng med strålebehandling og kreft. Denne metoden kan lett brukes til å validere effekten av forskjellige legemidler på bestrålte og kontrollembryoer (ikke-bestrålt), og dermed identifisere stoffer som radiosensibiliserende eller beskyttende stoffer. Selv om denne metoden brukes i de fleste narkotikascreeningseksperimenter, er detaljene i forsøket og toksisitetsvurderingen med bakgrunn av røntgenstrålingseksponering begrenset eller bare kort adressert, noe som gjør det vanskelig å utføre. Denne protokollen løser dette problemet og diskuterer prosedyren og toksisitetsevalueringen med en detaljert illustrasjon. Prosedyren beskriver en enkel tilnærming for bruk av sebrafiskembryoer til strålestudier og strålebasert legemiddelscreening med stor pålitelighet og reproduserbarhet.

Den generelle utformingen av protokollen er vist i figur 2. Effekten av stråling og karakteriseringen på en doseavhengig måte ble evaluert med følgende analyser.
Vurdering av røntgenindusert toksisitet Ved hjelp av et stereomikroskop ble følgende abnormiteter vurdert og karakterisert etter medikamentell behandling og / eller stråling. I henhold til OECDs retningslinjer 61, for toksisitetsevaluering hos fisk, ble fire sto...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Sebrafisken har nylig blitt utnyttet som en modell for å validere potensielle strålingsmodifikatorer. Denne protokollen beskriver de detaljerte trinnene for å bruke sebrafiskembryoer til strålingsbaserte screeningeksperimenter og noen observasjonsmetoder for å evaluere effekten av ulike behandlinger og stråling.

Sebrafisk larver som en modell for å evaluere potensielle radiosensibilisatorer eller beskyttere

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Denne protokollen beskriver de detaljerte trinnene for å bruke sebrafiskembryoer til strålingsbaserte screeningeksperimenter og noen observasjonsmetoder for å evaluere behandlingen av forskjellige legemidler og stråling. Dette vil hjelpe leserne til å sette en semi-høy gjennomstrømningsmedikamentscreening som involverer røntgeneksponering ved bruk av sebrafiskembryoer, som vil veilede i evalueringen av radiotoksisitet og effektiviteten av forskjellige stoffer som brukes. Denne prosedyren kan brukes til å screene og validere eller evaluere forskjellige stoffer som potensielle radiosensibilisatorer eller beskyttere, som kan utforskes videre eller brukes innen kreftstrålebehandling eller radiobiologi.For å begynne med, overvåke de voksende embryoene under dissekeringsmikroskopet. Identifiser riktig stadium og fjern eventuelle døde eller usunne embryoer. Sørg for at tilstrekkelig embryostaging er strålingen og legemiddeldoser vil bli gitt på et bestemt gastrulasjonsstadium.Før du starter forsøket, fordel forsiktig de sunne embryoene i eksperimentelle plater ved hjelp av en Pasteur-pipette. For hver eksperimentell gruppe, ta 15 til 20 embryoer. Mens du setter opp et strålingseksperiment, inkluderer du en kontroll ikke-bestrålt og en strålingsgruppe.Fordel embryoene i en brønnplate hvis stråleskjoldene kan dekke og beskytte de ekstra brønnene mot stråling mens de andre brønnene blir utsatt for en bestemt stråledose. Ellers bruk individuelle plater eller plater for å se embryoene per stråledose. Slå på røntgenbestrålermaskinen og start maskinens initialisering og oppvarming.Plasser eksperimentplaten under bestråleren inne i maskinen i midten, og sørg for at platen er rett under røntgenkilden. Og sett deretter dosen og start røntgenstrålen. Etter ferdigstillelse av bestråling, ta ut platene, slå av maskinprogrammet, slå av maskinen og kontroller platene under mikroskopet umiddelbart etter stråling.Fjern de døde embryoene, og registrer nummeret etter å ha evaluert dem under dissekeringsmikroskopet. Sett platene tilbake til inkubatoren ved 28,5 grader Celsius. Samle inn data med forhåndsbestemte tidsintervaller etter at strålingen er gitt.Registrer alle mulige observasjoner som overlevelse, klekkeeffektivitet, utviklingsstadium, antall hjerteslag, kropps- og halekrumning, perikardial ødem og forlengelse av eggeplommesekken, mikrocefali, svømmeblæreutvikling, generell motilitet eller aktivitet, et cetera. For å ta bilder, velg representative embryoer på et rent lysbilde. Sjekk embryoene under mikroskopet, orienter dem i en bestemt retning.Overlevelseskurven for embryoer bestrålt ved seks timer etter befruktning viste at i kontrollgruppen og embryoer utsatt for 2 grå og 5 grå, var det ingen signifikant død i embryoer. Hjerteslagene per minutt antydet at hjertefrekvensen sank enormt med økte doser røntgenstråling. I kontrollgruppen ved hvert 24-timers intervall ble hjertefrekvensen sett å øke.Alvorlig kardiovaskulær deformasjon mistenkes hos embryoer utsatt for 15 grå og 20 grå stråling da hjerteslaget falt enormt. Ulike fenotypiske og utviklingsmessige defekter er avbildet og evaluert for embryoer utsatt for varierende doser av stråling på forskjellige tidspunkter. Morfologiske observasjoner for ryggrad eller halebøyning, hodemisdannelse og mikrocefali, utviklingsfeil, perikardial ødem, eggeplomme sac deformiteter, svømmeblære deformiteter og endringer i øyestruktur ble også utført For protokollen som vi har demonstrert, er valg av sunne embryoer, riktig plassering av embryoene i bestråleren og riktig evaluering av kryssavvikene nøkkelen til denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hvordan studere basalmembran Stivhet som Biofysikalsk Trigger i prostatakreft og andre aldersrelaterte patologi eller metabolske sykdommer

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karsinom Tumor-bærende mus som en modell for studier av kreft kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

En omfattende prosedyre for å evaluere<em&gt; I Vivo</em&gt; Utførelse av kreft Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Tørket blod og Serum flekker som et nyttig verktøy for eksempel Storage evaluere kreft Biomarkers

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

En omfattende prosedyre å evaluere In Vitro ytelsen til den antatte Hemangioblastoma Neovascularization bruker Spheroid spirende analysen

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gjær som et chassis for å utvikle funksjonelle analyser for å studere Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...