Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Лаборатория SS и лаборатория RKS финансируются за счет грантов DBT и SERB, Индия. APM является стипендиатом ICMR правительства Индии. DP является стипендиатом CSIR правительства Индии. ООН является стипендиатом DST-Inspire правительства Индии. Рисунок 2 был сгенерирован с помощью Biorender (https://biorender.com).

Настоящее исследование было проведено с предварительного одобрения и в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по этике животных Института наук о жизни, Бхубанешвар. Все содержание и разведение данио-рерио проводилось в помещении для выращивания рыбы при ...

Рыбки данио-рерио используются в качестве ценных моделей во многих исследованиях, в том числе в нескольких видах исследований рака. Эта модель предоставляет полезную платформу для широкомасштабного скрининга на наркотики67,68. Как и любой другой метод оц?...

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) - это хорошо известная модель животного, которая широко использовалась в исследованиях в течение последних 3 десятилетий. Это небольшая пресноводная рыбка, которую легко разводить и разводить в лабораторных условиях. Рыбка данио-рерио широко использовалась для различных исследований развития и токсикологических исследований 1,2,3,4,5,6,7,8. Рыбка данио-рерио отличается высокой плодовитостью и коротким эмбриональным образованием; Эмбрионы пригодны для отслеживания различных стадий развития, визуально прозрачны и поддаются различным генетическим манипуляциям и высокопроизводительным скрининговым платформам 9,10,11,12,13,14. Кроме того, рыбка данио-рерио обеспечивает полную и живую визуализацию, для чего процесс ее развития и различные деформации в присутствии различных токсических веществ или факторов могут быть легко изучены с помощью стерео- или флуоресцентной микроскопии 7,15,16.
Лучевая терапия является одним из основных терапевтических режимов, используемых при лечении рака 17,18,19,20,21,22,23,24. Тем не менее, лучевая терапия рака требует потенциальных радиопротекторов для защиты нормальных здоровых клеток от гибели злокачественных клеток или для защиты здоровья человека во время терапии, включающей высокоэнергетические излучения 25,26,27,28,29. С другой стороны, также исследуются мощные радиосенсибилизаторы для повышения эффективности облучения для уничтожения злокачественных клеток, особенно в таргетной и точной терапии30,31,32,33. Таким образом, для валидации мощных радиопротекторов и сенсибилизаторов настоятельно требуется модель, подходящая для скрининга лекарственных препаратов с полувысокой пропускной способностью и измеримо демонстрирующая радиационные эффекты. Несколько доступных моделей используются в радиационных исследованиях и участвуют в экспериментах по скринингу лекарств. Тем не менее, высшие позвоночные животные и даже мыши, наиболее часто используемые in vivo, не подходят для крупномасштабного скрининга лекарств, потому что разработка таких скрининговых экспериментов с этими моделями отнимает много времени, средств и затрудняет. Аналогичным образом, модели клеточных культур идеально подходят для разновидностей высокопроизводительных экспериментов по скринингу лекарств34,35. Однако эксперименты с использованием клеточных культур не всегда прагматичны, воспроизводимы или надежны, поскольку клетки в культуре могут заметно изменять свое поведение в зависимости от условий роста и кинетики. Кроме того, разновидности типов клеток демонстрируют дифференциальную радиационную сенсибилизацию. Примечательно, что 2D и 3D системы культивирования клеток не отражают сценарий всего организма, и, таким образом, полученные результаты могут не соответствовать реальному уровню радиотоксичности36,37. В связи с этим рыбка данио-рерио имеет ряд преимуществ при скрининге на новые радиосенсибилизаторы и радиопротекторы. Простота в обращении, большой размер кладки, короткая продолжительность жизни, быстрое эмбриональное развитие, прозрачность эмбриона и небольшой размер тела делают рыбок данио-рерио подходящей моделью для крупномасштабного скрининга лекарств. Благодаря вышеперечисленным преимуществам, эксперименты можно легко повторить за короткое время, а эффект можно легко наблюдать под препарирующим микроскопом в многолуночных планшетах. Таким образом, рыбка данио-рерио набирает популярность в исследованиях по скринингу наркотиков, включающих радиационные исследования38,39.
Потенциал рыбок данио-рерио в качестве подлинной модели для скрининга модификаторов излучения был продемонстрирован в различных исследованиях 40,41,42,43,44,45. Сообщалось о радиопротекторном эффекте потенциальных радиомодификаторов, таких как наночастицы DF1, амифостин (WR-2721), белки репарации ДНК KU80 и ATM, а также трансплантированные гемопоэтические стволовые клетки, а также эффекты радиосенсибилизаторов, таких как флавопиридол и AG1478, в модели рыбок данио-рерио 19,41,42,43,44,45,46. С помощью этой же системы оценивали радиопротекторный эффект DF-1 (фуллереновой наночастицы) как на системном, так и на органоспецифическом уровнях, а также дополнительно изучали использование эмбрионов рыбок данио для скрининга радиопротекторов47. Недавно сообщалось, что мед Келулут является радиопротектором для эмбрионов рыбок данио, и было обнаружено, что он увеличивает выживаемость эмбрионов и предотвращает органоспецифическое повреждение, повреждение клеточной ДНК и апоптоз48.
Аналогичным образом, радиопротекторные эффекты полимеров, полученных в результате реакции Ханча, были проверены на эмбрионах рыбок данио в ходе высокопроизводительного скрининга, и защита была в основном обеспечена защитой клетокот повреждения ДНК. В одном из предыдущих исследований липофильный статин флувастатин был обнаружен в качестве потенциального радиосенсибилизатора с использованием модели рыбок данио-рерио с таким подходом50. Точно так же наночастицы золота считаются идеальным радиосенсибилизатором и использовались во многих исследованиях51,52.
Эмбриональное развитие рыбок данио включает в себя расщепление в первые 3 часа, в течение которых одноклеточная зигота делится на 2 клетки, 4 клетки, 8 клеток, 16 клеток, 32 клетки и 64 клетки, которые легко идентифицировать с помощью стереомикроскопа. Затем он достигает стадии бластулы со 128 клетками (2,25 ч после оплодотворения, hpf), где клетки удваиваются каждые 15 минут и проходят следующие стадии: 256 клеток (2,5 hpf), 512 клеток (2,75 hpf) и достижение 1000+ клеток всего за 3 часа (рис. 1). Через 4 ч яйцо достигает стадии сферы, после чего в зародышевой массе 7,53,54 образуется куполообразная форма. Гаструляция у рыбок данио-рерио начинается с 5,25 hpf54, где она достигает стадии щита. Щиток ясно указывает на быстрое конвергентное движение клеток в одну сторону от зародышевого кольца (рис. 1) и является заметной и отчетливой фазой гаструляции эмбрионов, которую можно легко идентифицировать53,54. Несмотря на то, что радиационное воздействие на эмбрионы может быть осуществлено на любой стадии их развития, радиационное облучение во время гаструляции может иметь более отчетливые морфологические изменения, способствующие лучшему считыванию радиационно-индуцированной токсичности55; Аналогичным образом, введение препаратов эмбрионам может быть начато уже с 2 HPF54.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Рыбки данио-рерио широко используются в нескольких видах исследований, потому что они являются одной из легко поддерживаемых моделей позвоночных и демонстрируют несколько особенностей уникальной и удобной модельной системы. Поскольку клетки с высокой пролиферативностью более восприимчивы к радиационно-индуцированным повреждениям ДНК, эмбрионы рыбок данио-рерио являются передовой моделью in vivo в радиационных исследованиях. Кроме того, эта модель прогнозирует воздействие радиации и различных лекарств в течение короткого времени, наряду с основными биологическими событиями и связанными с ними реакциями. В нескольких исследованиях рака использовались рыбки данио, и этот протокол основан на использовании модификаторов излучения в контексте лучевой терапии и рака. Этот метод может быть легко использован для проверки воздействия различных лекарств на облученные и контрольные (необлученные) эмбрионы, таким образом, идентифицируя препараты как радиосенсибилизирующие или защитные препараты. Несмотря на то, что эта методология используется в большинстве экспериментов по скринингу лекарственных средств, детали эксперимента и оценка токсичности на фоне рентгеновского излучения ограничены или рассматриваются лишь вскользь, что затрудняет его выполнение. В настоящем протоколе рассматривается этот вопрос и обсуждается процедура и оценка токсичности с подробной иллюстрацией. Процедура описывает простой подход к использованию эмбрионов рыбок данио для лучевых исследований и радиационного скрининга лекарственных препаратов с высокой надежностью и воспроизводимостью.

Общая компоновка протокола показана на рисунке 2. Влияние радиации и характеристика в зависимости от дозы оценивались с помощью следующих анализов.
Оценка токсичности, вызванной рентгеновским излучением С помощью стереомикроскопа б?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Рыбка данио-рерио недавно использовалась в качестве модели для проверки потенциальных модификаторов радиации. В настоящем протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки эффекта различных методов лечения и облучения.

Личинки данио-рерио как модель для оценки потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

В этом протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки лечения различными лекарственными препаратами и радиацией. Это поможет читателям установить полувысокопроизводительный скрининг лекарственных средств, включающий рентгеновское воздействие с использованием эмбрионов рыбок данио, что поможет оценить радиотоксичность и эффективность различных используемых препаратов. Эта процедура может быть использована для скрининга и валидации или оценки различных лекарств в качестве потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов, которые могут быть дополнительно изучены или использованы в области лучевой терапии рака или радиобиологии.Для начала понаблюдайте за растущими эмбрионами под препарирующим микроскопом. Определите правильную стадию и удалите все мертвые или нездоровые эмбрионы. Обеспечьте адекватную стадию эмбриона, если дозы облучения и лекарства будут введены на определенной стадии гаструляции.Перед началом эксперимента осторожно распределите здоровые эмбрионы по экспериментальным планшетам с помощью пипетки Пастера. Для каждой экспериментальной группы берут от 15 до 20 эмбрионов. При постановке радиационного эксперимента включите контрольную необлученную и только радиационную группу.Распределите эмбрионы в планшете лунки, если радиационные экраны могут покрыть и защитить дополнительные лунки от радиации, в то время как другие лунки подвергаются воздействию определенной дозы облучения. В противном случае используйте отдельные пластины или диски, чтобы увидеть эмбрионы за одну дозу облучения. Включите рентгеновский облучатель и запустите инициализацию и прогрев аппарата.Поместите экспериментальную пластину под облучатель внутри аппарата в центре, убедившись, что пластина находится непосредственно под источником рентгеновского излучения. А затем установить дозу и начать рентген. После завершения облучения выньте пластины, выключите программу аппарата, выключите аппарат и проверьте пластины под микроскопом сразу после облучения.Удалите мертвые эмбрионы и запишите их количество, оценив их под препарирующим микроскопом. Верните тарелки в инкубатор при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Собирайте данные через заранее определенные промежутки времени после проведения облучения.Запишите все возможные наблюдения, такие как выживаемость, эффективность вылупления, стадия развития, количество сердцебиений, искривление тела и хвоста, отек перикарда, удлинение желточного мешка, микроцефалия, развитие плавательного пузыря, общая моторика или активность и т. д. Чтобы получить изображения, выберите репрезентативные эмбрионы на чистом слайде. Проверьте эмбрионы под микроскопом, сориентируйте их в определенном направлении.Кривая выживаемости эмбрионов, облученных через шесть часов после оплодотворения, показала, что в контрольной группе и эмбрионах, подвергшихся воздействию 2 и 5 серых, не было выявлено значимой гибели эмбрионов. Количество ударов сердца в минуту показало, что частота сердечных сокращений значительно уменьшалась при увеличении доз рентгеновского излучения. В контрольной группе с каждым 24-часовым интервалом наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений.Тяжелая сердечно-сосудистая деформация подозревается у эмбрионов, подвергшихся воздействию 15 и 20 грей радиации, поскольку сердцебиение значительно упало. Для эмбрионов, подвергшихся воздействию различных доз радиации в разные моменты времени, выявляются и оцениваются различные фенотипические дефекты и дефекты развития. Также были проведены морфологические наблюдения за искривлением позвоночника или хвоста, пороками развития головы и микроцефалией, дефектами развития, отеком перикарда, деформациями желточного мешка, деформациями плавательного пузыря и изменениями в структуре глаз Для протокола, который мы продемонстрировали, выбор здоровых эмбрионов, правильное размещение эмбрионов в облучателе и правильная оценка перекрестных аномалий являются ключом к этой процедуре.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Как изучать базальной мембраны Жесткость как биофизической Trigger в раке простаты и других патологий, связанных с возрастом или метаболических заболеваний

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 РАК-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ мышь в качестве модели для изучения рака кахексия

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Всеобъемлющая процедура для оценки<em&gt; В Vivo</em&gt; Производительность Рака нанолекарства

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Сушеные крови и сыворотке пятна как полезный инструмент для хранения проб для оценки рака Биомаркеры

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Дрожжи как шасси для разработки функциональных анализов для изучения человека P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...