Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

SS labb och RKS labb finansieras av anslag från DBT och SERB, Indien. APM är mottagare av ICMR-stipendiet, Government of India. DP är mottagare av CSIR-stipendiet, Government of India. FN är mottagare av DST-Inspire-stipendiet, Government of India. Figur 2 genererades med hjälp av Biorender (https://biorender.com).

Den aktuella studien genomfördes med förhandsgodkännande från och enligt riktlinjerna från Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. All skötsel och uppfödning av zebrafiskar utfördes vid en lokal fiskodlingsanläggning vid 28,5 °C, och embryona hölls i en inkubator för biologisk syreförbrukning (BOD) vid en temperatur på 28,5 °C. Här användes zebrafiskstammen AB, och stadieindelningen utfördes enligt Kimmel et al.54. Röntgenstrålning gavs...

Zebrafiskar används som värdefulla modeller i många studier, bland annat i flera olika typer av cancerforskning. Denna modell utgör en användbar plattform för storskalig läkemedelsscreening67,68. Liksom alla andra metoder för toxicitetsutvärdering är den kvantitativa utvärderingen av de viktigaste biologiska förändringarna vid strålning och/eller läkemedelsbehandling den mest avgörande delen av detta protokoll. I den här typen av studier får öv...

Zebrafisken (Danio rerio) är en välkänd djurmodell som har använts flitigt i forskning under de senaste 3 decennierna. Det är en liten sötvattensfisk som är lätt att föda upp och föda upp under laboratorieförhållanden. Zebrafisken har använts i stor utsträckning för olika utvecklings- och toxikologiska studier 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebrafisken har hög fruktsamhet och kort embryonal generation; Embryona är lämpliga för att spåra olika utvecklingsstadier, är visuellt transparenta och är mottagliga för olika typer av genetisk manipulation och screeningplattformarmed hög kapacitet 9,10,11,12,13,14. Dessutom tillhandahåller zebrafisken in toto och levande avbildning för vilken dess utvecklingsprocess och olika missbildningar i närvaro av olika giftiga ämnen eller faktorer lätt kan studeras med hjälp av stereo- eller fluorescerande mikroskopi 7,15,16.
Strålbehandling är en av de viktigaste terapeutiska metoderna som används vid behandling av cancer 17,18,19,20,21,22,23,24. Strålbehandling av cancer kräver dock potentiella strålskydd för att skydda normala friska celler från att dö samtidigt som maligna celler dödas eller för att skydda människors hälsa under behandling med högenergistrålning 25,26,27,28,29. Omvänt undersöks också potenta radiosensibilisatorer för att öka effektiviteten av strålning för att döda maligna celler, särskilt i riktade terapier och precisionsterapier30,31,32,33. Därför, för att validera potenta strålprotektorer och sensibilisatorer, är en modell som är lämplig för läkemedelsscreening med semi-hög genomströmning och mätbart uppvisande av strålningseffekter mycket efterfrågad. Flera tillgängliga modeller används i strålningsstudier och används i drogscreeningsexperiment. Högre ryggradsdjur och till och med den vanligaste in vivo-modellen, möss, är dock olämpliga för storskalig läkemedelsscreening eftersom det är tidskrävande, kostsamt och utmanande att utforma sådana screeningexperiment med dessa modeller. På samma sätt är cellodlingsmodeller idealiska för olika typer av storskaliga läkemedelsscreeningsexperiment34,35. Experiment som involverar cellodling är dock inte alltid pragmatiska, mycket reproducerbara eller tillförlitliga eftersom celler i odling kan ändra sitt beteende markant beroende på tillväxtförhållandena och kinetiken. Olika celltyper visar också differentiell strålningssensibilisering. Noterbart är att 2D- och 3D-cellodlingssystem inte representerar hela organismscenariot, och därför kan de erhållna resultaten inte rekapitulera den faktiska nivån av radiotoxicitet36,37. I detta avseende ger zebrafisken flera fördelar vid screening för nya radiosensibiliserande ämnen och radioprotektorer. Den enkla hanteringen, den stora kullstorleken, den korta livslängden, den snabba embryonala utvecklingen, embryots transparens och den lilla kroppsstorleken gör zebrafisken till en lämplig modell för storskalig läkemedelsscreening. På grund av ovanstående fördelar kan experiment lätt upprepas på kort tid, och effekten kan enkelt observeras under ett dissekerande mikroskop i flerbrunnsplattor. Därför blir zebrafisken allt populärare inom läkemedelsscreeningsforskning som involverar strålningsstudier38,39.
Zebrafiskens potential som en riktig modell för att screena strålningsmodifierare har visats i olika studier 40,41,42,43,44,45. Den strålskyddande effekten av potentiella radiomodifierare, såsom nanopartikel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparationsproteiner KU80 och ATM, och transplanterade hematopoetiska stamceller, och effekterna av radiosensibilisatorer, såsom flavopiridol och AG1478, i zebrafiskmodellen har rapporterats 19,41,42,43,44,45,46 . Med hjälp av samma system utvärderades den strålskyddande effekten av DF-1 (fullerennanopartikel) både på systemisk och organspecifik nivå, och även användningen av zebrafiskembryon för radioprotektorisk screening undersöktes ytterligare47. Nyligen rapporterades Kelulut-honungen som en radioprotektor i zebrafiskembryon och visade sig öka embryoöverlevnaden och förhindra organspecifika skador, cellulära DNA-skador och apoptos48.
På liknande sätt kontrollerades de strålskyddande effekterna av polymerer som genererades via Hantzschs reaktion på zebrafiskembryon i en screening med hög kapacitet, och skyddet gavs huvudsakligen genom att skydda celler från DNA-skador49. I en av de tidigare studierna hittades den lipofila statinen fluvastatin som en potentiell radiosensibilisator med hjälp av zebrafiskmodellen med detta tillvägagångssätt50. På samma sätt anses guldnanopartiklar vara en idealisk radiosensibilisator och har använts i många studier51,52.
Den embryonala utvecklingen hos zebrafiskar involverar klyvning under de första 3 timmarna där en encellig zygot delar sig för att bilda 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler och 64 celler som lätt kan identifieras med ett stereomikroskop. Sedan når den blastulastadiet med 128 celler (2,25 timmar efter befruktning, hpf), där cellerna fördubblas var 15:e minut och fortsätter genom följande stadier: 256 celler (2,5 hpf), 512 celler (2,75 hpf) och når 1 000+ celler på bara 3 timmar (figur 1). Vid 4 timmar når ägget sfärstadiet, följt av bildandet av en kupolform i den embryonala massan 7,53,54. Gastrulationen hos zebrafiskar börjar från 5,25 hpf54, där den når sköldstadiet. Skölden visar tydligt cellernas snabba konvergensrörelse till ena sidan av könscellen (figur 1) och är en framträdande och distinkt fas av gastrulerande embryon som lätt kan identifieras53,54. Även om strålningsexponering för embryon kan göras i alla stadier av deras utveckling, kan strålningsexponering under gastrulation ha mer distinkta morfologiska förändringar som underlättar bättre avläsningar av strålningsinducerad toxicitet55. På samma sätt kan administrering av läkemedel till embryon påbörjas så tidigt som 2 HPF54.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Zebrafiskar används i stor utsträckning i flera typer av forskning eftersom de är en av de lättskötta ryggradsdjursmodellerna och uppvisar flera egenskaper hos ett unikt och bekvämt modellsystem. Eftersom mycket proliferativa celler är mer mottagliga för strålningsinducerade DNA-skador är zebrafiskembryon en frontlinje in vivo-modell inom strålningsforskning. Dessutom projicerar denna modell effekten av strålning och olika läkemedel inom en kort tid, tillsammans med stora biologiska händelser och tillhörande svar. Flera cancerstudier har använt zebrafiskar, och detta protokoll är baserat på användningen av strålningsmodifierare i samband med strålbehandling och cancer. Denna metod kan lätt användas för att validera effekterna av olika läkemedel på bestrålade embryon och kontrollembryon (icke-bestrålade), och på så sätt identifiera läkemedel som radiosensibiliserande eller skyddande läkemedel. Även om denna metod används i de flesta läkemedelsscreeningexperiment, är detaljerna i experimentet och toxicitetsbedömningen mot bakgrund av röntgenstrålningsexponering begränsade eller endast kortfattade, vilket gör det svårt att utföra. Detta protokoll tar upp denna fråga och diskuterar proceduren och toxicitetsutvärderingen med en detaljerad illustration. Proceduren beskriver ett enkelt tillvägagångssätt för att använda zebrafiskembryon för strålningsstudier och strålningsbaserad läkemedelsscreening med stor tillförlitlighet och reproducerbarhet.

Protokollets övergripande layout visas i figur 2. Effekten av strålning och karakteriseringen på ett dosberoende sätt utvärderades med följande analyser.
Bedömning av röntgeninducerad toxicitet Med hjälp av ett stereomikroskop bedömdes och karakteriserades följande avvikelser efter läkemedelsbehandling och/eller strålning. Enligt OECD:s riktlinjer 61 inkluderades fyra huvudsakliga apikala effektmått för toxicitet...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafisken har nyligen utnyttjats som modell för att validera potentiella strålningsmodifierare. Detta protokoll beskriver de detaljerade stegen för att använda zebrafiskembryon för strålningsbaserade screeningexperiment och några observationsmetoder för att utvärdera effekten av olika behandlingar och strålning.

Zebrafisklarver som modell för att utvärdera potentiella radiosensibiliserare eller beskyddare

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Detta protokoll beskriver de detaljerade stegen för att använda zebrafiskembryon för strålningsbaserade screeningexperiment och några observationsmetoder för att utvärdera behandlingen av olika läkemedel och strålning. Detta kommer att hjälpa läsarna att ställa in en läkemedelsscreening med halv hög genomströmning som involverar röntgenexponering med hjälp av zebrafiskembryon, vilket kommer att vägleda vid utvärdering av radiotoxicitet och effektiviteten hos olika läkemedel som används. Denna procedur kan användas för att screena och validera eller utvärdera olika läkemedel som potentiella radiosensibiliserare eller skydd, som kan undersökas ytterligare eller användas inom området cancerstrålbehandling eller radiobiologi.Till att börja med, övervaka de växande embryona under dissektionsmikroskopet. Identifiera rätt stadium och ta bort alla döda eller sjuka embryon. Se till att adekvat embryostadieindelning är strålningen och läkemedelsdoser kommer att ges vid ett visst gastrulationsstadium.Innan experimentet påbörjas ska de friska embryona försiktigt fördelas på försöksplattorna med hjälp av en Pasteurpipett. För varje experimentgrupp tar du 15 till 20 embryon. När du sätter upp ett strålningsexperiment, inkludera en kontrollgrupp som inte bestrålas och en grupp som endast bestrålar.Fördela embryona i en brunnsplatta om strålskydden kan täcka och skydda de extra brunnarna från strålning medan de andra brunnarna utsätts för en viss stråldos. Använd annars enskilda plattor eller skivor för att se embryona per stråldos. Slå på röntgenstrålaren och starta maskinens initiering och uppvärmning.Placera experimentplattan under bestrålaren inuti maskinen i mitten och se till att plattan är direkt under röntgenkällan. Ställ sedan in dosen och starta röntgen. Efter avslutad bestrålning, ta ut plattorna, stäng av maskinprogrammet, stäng av maskinen och kontrollera plattorna under mikroskopet omedelbart efter strålningen.Ta bort de döda embryona och registrera deras antal efter att ha utvärderat dem i dissekeringsmikroskopet. Lägg tillbaka plattorna i inkubatorn vid 28,5 grader Celsius. Samla in data med förutbestämda tidsintervall efter att strålningen har getts.Registrera alla möjliga observationer, t.ex. överlevnad, kläckningseffektivitet, utvecklingsstadium, antal hjärtslag, kropps- och svanskrökning, perikardiellt ödem och förlängning av gulesäcken, mikrocefali, simblåsans utveckling, allmän motilitet eller aktivitet, et cetera. För att ta bilder, välj representativa embryon på en ren bild. Kontrollera embryona under mikroskopet, orientera dem i en viss riktning.Överlevnadskurvan för embryon som bestrålades sex timmar efter befruktning visade att i kontrollgruppen och embryon som exponerades för 2 grå och 5 grå fanns det ingen signifikant död hos embryon. Antalet hjärtslag per minut tydde på att hjärtfrekvensen minskade enormt med ökade doser av röntgenstrålning. I kontrollgruppen sågs hjärtfrekvensen öka vid varje 24-timmarsintervall.Allvarlig kardiovaskulär deformation misstänks hos embryon som utsätts för 15 grå och 20 grå strålning eftersom hjärtslagen sjönk enormt. Olika fenotypiska defekter och utvecklingsdefekter avbildas och utvärderas för embryon som exponerats för olika stråldoser vid olika tidpunkter. Morfologiska observationer för böjning av ryggrad eller svans, huvudmissbildning och mikrocefali, utvecklingsdefekter, perikardiellt ödem, gulesäcksdeformiteter, deformiteter i simblåsan och förändringar i ögonstrukturen utfördes också För det protokoll som vi har visat, är valet av friska embryon, korrekt placering av embryona i bestrålningen och korrekt utvärdering av korsavvikelserna nyckeln till denna procedur.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hur att studera Basement Membrane styvhet som en Biophysical Trigger vid prostatacancer och andra åldersrelaterade sjukdomar eller metabola sjukdomar

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karcinom tumörbärande mus som en modell för studier av cancerkakexi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

En omfattande förfarande för att utvärdera<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestanda av cancer nano

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Torkat blod och Serum ställen som ett användbart verktyg att utvärdera Cancer biomarkörer lagring på prov

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Ett omfattande förfarande för att utvärdera In Vitro den förmodade hemangioblastom kärlnybildning använder den sfäroid groning Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som ett mer fysiologiskt system för cancer-associerade fibroblaster differentiering och invasion in vitro-studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...