Name: zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

SS'nin laboratuvarı ve RKS'nin laboratuvarı, Hindistan'daki DBT ve SERB'den gelen hibelerle finanse edilmektedir. APM, Hindistan Hükümeti ICMR bursunun bir alıcısıdır. DP, Hindistan Hükümeti CSIR bursunun bir alıcısıdır. BM, Hindistan Hükümeti DST-Inspire bursunun bir alıcısıdır. Şekil 2 , Biorender (https://biorender.com) kullanılarak oluşturulmuştur.

Bu çalışma, Bhubaneswar'daki Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Kurumsal Hayvan Etik Komitesi'nin yönergelerinden önceden onay alınarak ve bu yönergeler izlenerek yürütülmüştür. Tüm zebra balığı bakımı ve üremesi 28.5 °C'de bir ortam balık kültürü tesisinde gerçekleştirildi ve embriyolar 28.5 °C'lik bir sıcaklıkta biyolojik oksijen ihtiyacı (BOİ) inkübatöründe tutuldu. Burada zebra balığı AB suşu kullanılmış ve evreleme Kimmel ve ark.54'e göre yapılmıştır...

Zebra balığı, çeşitli kanser araştırmaları da dahil olmak üzere birçok çalışmada değerli modeller olarak kullanılmaktadır. Bu model, büyük ölçekli uyuşturucu taraması için yararlı bir platform sağlar67,68. Diğer tüm toksisite değerlendirme yöntemleri gibi, radyasyon ve/veya ilaç tedavisi ile ilgili önemli biyolojik değişikliklerin nicel olarak değerlendirilmesi bu protokolün en önemli parçasıdır. Bu tür çalışmalarda, tok...

Zebra balığı (Danio rerio), son 3 yılda araştırmalarda yaygın olarak kullanılan iyi bilinen bir hayvan modelidir. Laboratuvar koşullarında yetiştirilmesi ve üremesi kolay olan küçük bir tatlı su balığıdır. Zebra balığı, çeşitli gelişimsel ve toksikolojik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebra balığı yüksek doğurganlığa ve kısa embriyonik üretime sahiptir; Embriyolar farklı gelişim aşamalarını izlemek için uygundur, görsel olarak şeffaftır ve genetik manipülasyon çeşitlerine ve yüksek verimli tarama platformlarınauygundur 9,10,11,12,13,14. Ayrıca, zebra balığı, gelişim sürecinin ve çeşitli toksik maddelerin veya faktörlerin varlığında farklı deformitelerin stereo veya floresan mikroskopi 7,15,16 kullanılarak kolayca incelenebildiği toto ve canlı görüntüleme sağlar.
Radyoterapi, kanser tedavisinde kullanılan başlıca terapötik modlardan biridir 17,18,19,20,21,22,23,24. Bununla birlikte, kanser radyoterapisi, kötü huylu hücreleri öldürürken normal sağlıklı hücrelerin ölmesini önlemek veya yüksek enerjili radyasyonlar içeren tedavi sırasında insan sağlığını korumak için potansiyel radyoprotektörler gerektirir 25,26,27,28,29. Tersine, özellikle hedefli ve hassas tedavilerde kötü huylu hücreleri öldürmek için radyasyonun etkinliğini artırmak için güçlü radyosensitizörler de araştırılmaktadır30,31,32,33. Bu nedenle, güçlü radyoprotektörleri ve hassaslaştırıcıları doğrulamak için, yarı yüksek verimli ilaç taraması için uygun ve ölçülebilir radyasyon etkileri sergileyen bir model şiddetle talep edilmektedir. Radyasyon çalışmalarında mevcut birkaç model kullanılır ve ilaç tarama deneylerinde yer alır. Bununla birlikte, daha yüksek omurgalılar ve hatta en yaygın olarak kullanılan in vivo model olan fareler, büyük ölçekli ilaç taraması için uygun değildir, çünkü bu modellerle bu tür tarama deneylerini tasarlamak zaman alıcı, maliyetli ve zordur. Benzer şekilde, hücre kültürü modelleri, yüksek verimli ilaç tarama deneylerinin çeşitleri için idealdir34,35. Bununla birlikte, hücre kültürünü içeren deneyler her zaman pragmatik, yüksek oranda tekrarlanabilir veya güvenilir değildir, çünkü kültürdeki hücreler büyüme koşullarına ve kinetiğine göre davranışlarını önemli ölçüde değiştirebilir. Ayrıca, hücre tiplerinin çeşitleri diferansiyel radyasyon duyarlılığı gösterir. Özellikle, 2D ve 3D hücre kültürü sistemleri tüm organizma senaryosunu temsil etmez ve bu nedenle elde edilen sonuçlar gerçek radyotoksisiteseviyesini özetlemeyebilir 36,37. Bu bağlamda, zebra balığı yeni radyosensitizörler ve radyoprotektörler için taramada çeşitli avantajlar sağlar. Kullanım kolaylığı, büyük kavrama boyutu, kısa ömür, hızlı embriyonik gelişim, embriyo şeffaflığı ve küçük vücut boyutu, zebra balığını büyük ölçekli ilaç taraması için uygun bir model haline getirir. Yukarıdaki avantajlardan dolayı, deneyler kısa sürede kolayca tekrarlanabilir ve etki, çok kuyulu plakalarda diseksiyon mikroskobu altında kolayca gözlemlenebilir. Bu nedenle, zebra balığı, radyasyon çalışmalarını içeren ilaç tarama araştırmalarında popülerlik kazanmaktadır38,39.
Zebra balığının iyi niyetli bir model olarak radyasyon değiştiricileri tarama potansiyeli çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir40,41,42,43,44,45. Zebra balığı modelinde nanopartikül DF1, amifostin (WR-2721), DNA onarım proteinleri KU80 ve ATM gibi potansiyel radyo değiştiricilerin ve nakledilen hematopoietik kök hücrelerin radyoprotektif etkisi ve flavopiridol ve AG1478 gibi radyoduyarlılaştırıcıların etkileri bildirilmiştir 19,41,42,43,44,45,46 . Aynı sistem kullanılarak, DF-1'in (fulleren nanopartikül) radyoprotektif etkisi hem sistemik hem de organa özgü seviyelerde değerlendirildi ve ayrıca zebra balığı embriyolarının radyoprotektör taraması için kullanımı daha da araştırıldı47. Son zamanlarda, Kelulut balının zebra balığı embriyolarında bir radyoprotektör olduğu bildirildi ve embriyo sağkalımını arttırdığı ve organa özgü hasarı, hücresel DNA hasarını ve apoptozu önlediği bulundu48.
Benzer şekilde, Hantzsch reaksiyonu yoluyla üretilen polimerlerin radyoprotektif etkileri, yüksek verimli bir taramada zebra balığı embriyoları üzerinde kontrol edildi ve koruma esas olarak hücrelerin DNA hasarındankorunmasıyla sağlandı 49. Önceki çalışmalardan birinde, lipofilik statin fluvastatin, bu yaklaşımla zebra balığı modeli kullanılarak potansiyel bir radyosensitizör olarak bulundu50. Benzer şekilde, altın nanopartiküller ideal bir radyosensitizör olarak kabul edilir ve birçok çalışmada kullanılmıştır51,52.
Zebra balıklarındaki embriyonik gelişim, tek hücreli bir zigotun stereomikroskopla kolayca tanımlanabilen 2 hücre, 4 hücre, 8 hücre, 16 hücre, 32 hücre ve 64 hücre oluşturmak üzere bölündüğü ilk 3 saatte bölünmeyi içerir. Daha sonra, hücrelerin her 15 dakikada bir ikiye katlandığı ve aşağıdaki aşamalardan geçtiği 128 hücre (döllenme sonrası 2.25 saat, hpf) ile blastula aşamasına ulaşır: 256 hücre (2.5 hpf), 512 hücre (2.75 hpf) ve sadece 3 saatte 1.000+ hücreye ulaşır (Şekil 1). 4 saatte, yumurta küre aşamasına ulaşır, ardındanembriyonik kütle 7,53,54'te bir kubbe şekli oluşur. Zebra balığında gastrulasyon, kalkan aşamasına ulaştığı 5.25 hpf54'ten başlar. Kalkan, hücrelerin germ halkasının bir tarafına hızlı yakınsama hareketini açıkça gösterir (Şekil 1) ve kolayca tanımlanabilen gastrülasyon embriyolarının belirgin ve belirgin bir aşamasıdır53,54. Embriyolara radyasyona maruz kalma, gelişimlerinin herhangi bir aşamasında yapılabilse de, gastrulasyon sırasında radyasyona maruz kalma, radyasyonun neden olduğu toksisitelerin daha iyi okunmasını kolaylaştıran daha belirgin morfolojik değişikliklere sahip olabilir55; Benzer şekilde, embriyolara ilaç uygulaması 2 HPF54 gibi erken bir tarihte başlatılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3335</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.O.D Incubator</td>
			<td>Oswald</td>
			<td>JRIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10101-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTE</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petriplates</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>3165A75</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphpadPrism</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kline concavity slides</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GW092-1PK</td>
			<td>Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>66720-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>380020</td>
			<td>Paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PW1212-1X500NO</td>
			<td>Polyethylene plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTI</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTD</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td>ZB10BTL</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellet</td>
			<td>SRL</td>
			<td>1949181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Leica M205FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model/PN MDG35/10 450 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad 225 Precision X-Ray</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td>X-RAD 225XL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish larvae as a model to evaluate potential radiosensitizers or protectors

Zebra balıkları, bakımı kolay omurgalı modellerinden biri oldukları ve benzersiz ve kullanışlı bir model sisteminin çeşitli özelliklerini sergiledikleri için çeşitli araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek oranda proliferatif hücreler radyasyona bağlı DNA hasarına karşı daha duyarlı olduklarından, zebra balığı embriyoları radyasyon araştırmalarında in vivo modelde ön saflarda yer almaktadır. Ayrıca bu model, radyasyon ve farklı ilaçların etkisini, büyük biyolojik olaylar ve ilişkili tepkilerle birlikte kısa sürede yansıtmaktadır. Birkaç kanser çalışması zebra balığı kullanmıştır ve bu protokol, radyoterapi ve kanser bağlamında radyasyon değiştiricilerin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntem, farklı ilaçların ışınlanmış ve kontrol (ışınlanmamış) embriyolar üzerindeki etkilerini doğrulamak için kolayca kullanılabilir, böylece ilaçları radyo duyarlılaştırıcı veya koruyucu ilaçlar olarak tanımlar. Bu metodoloji çoğu ilaç tarama deneyinde kullanılmasına rağmen, deneyin ayrıntıları ve X-ışını radyasyonuna maruz kalmanın arka planı ile toksisite değerlendirmesi sınırlıdır veya sadece kısaca ele alınmaktadır, bu da gerçekleştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bu protokol bu sorunu ele alır ve prosedür ve toksisite değerlendirmesini ayrıntılı bir örnekle tartışır. Prosedür, zebra balığı embriyolarının radyasyon çalışmaları ve radyasyona dayalı ilaç taraması için çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kullanılması için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır.

Protokolün genel düzeni Şekil 2'de gösterilmiştir. Radyasyonun etkisi ve doza bağlı karakterizasyonu aşağıdaki analizlerle değerlendirildi.
X-ışını kaynaklı toksisitelerin değerlendirilmesi Bir stereomikroskop kullanılarak, ilaç tedavisi ve / veya radyasyondan sonra aşağıdaki anormallikler değerlendirildi ve karakterize edildi. OECD yönergelerine61 göre, balıklarda toksisite de...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors at JoVE.com

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebra balığı son zamanlarda potansiyel radyasyon değiştiricilerini doğrulamak için bir model olarak kullanılmıştır. Mevcut protokol, radyasyona dayalı tarama deneyleri için zebra balığı embriyolarını kullanmanın ayrıntılı adımlarını ve farklı tedavilerin ve radyasyonun etkisini değerlendirmek için bazı gözlemsel yaklaşımları açıklamaktadır.

Potansiyel Radyosensitizörleri veya Koruyucuları Değerlendirmek için Bir Model Olarak Zebra Balığı Larvaları

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının radyasyona dayalı tarama deneyleri için kullanılmasına yönelik ayrıntılı adımları ve farklı ilaçların ve radyasyonun tedavisini değerlendirmek için bazı gözlemsel yaklaşımları açıklar. Bu, okuyucuların, radyotoksisitenin ve kullanılan farklı ilaçların etkinliğinin değerlendirilmesinde rehberlik edecek, zebra balığı embriyolarını kullanarak x-ışınına maruz kalmayı içeren yarı yüksek verimli bir ilaç taraması ayarlamasına yardımcı olacaktır. Bu prosedür, kanser radyoterapisi veya radyobiyoloji alanında daha fazla araştırılabilen veya kullanılabilen potansiyel radyosensitizatörler veya koruyucular olarak farklı ilaçları taramak ve doğrulamak veya değerlendirmek için kullanılabilir.Başlamak için, büyüyen embriyoları diseksiyon mikroskobu altında izleyin. Uygun aşamayı belirleyin ve ölü veya sağlıksız embriyoları çıkarın. Yeterli embriyo evrelemesinin radyasyon olduğundan emin olun ve ilaç dozları belirli bir gastrulasyon aşamasında verilecektir.Deneye başlamadan önce deney plaklarındaki sağlıklı embriyoları Pasteur pipeti yardımıyla dikkatlice dağıtın. Her deney grubu için 15 ila 20 embriyo alın. Bir radyasyon deneyi kurarken, ışınlanmamış bir kontrol ve yalnızca radyasyon grubu ekleyin.Radyasyon kalkanları ekstra kuyucukları radyasyondan koruyabiliyorsa, diğer kuyucuklar belirli bir radyasyon dozuna maruz kalırken embriyoları bir kuyu plakasına dağıtın. Aksi takdirde, radyasyon dozu başına embriyoları görmek için ayrı plakalar veya diskler kullanın. X-ışını ışınlayıcı makinesini açın ve makinenin başlatılmasını ve ısınmasını başlatın.Deney plakasını ışınlayıcının altına, makinenin içine ortada yerleştirin ve plakanın doğrudan x-ışını kaynağının altında olduğundan emin olun. Sonra dozu ayarlayın ve röntgeni başlatın. Işınlama tamamlandıktan sonra plakaları çıkarın, makine programını kapatın, makineyi kapatın ve radyasyondan hemen sonra plakaları mikroskop altında kontrol edin.Ölü embriyoları çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında değerlendirdikten sonra sayılarını kaydedin. Plakaları 28,5 santigrat derecede inkübatöre geri koyun. Radyasyon verildikten sonra önceden belirlenmiş zaman aralıklarında veri toplayın.Sağkalım, kuluçka verimliliği, gelişim aşaması, kalp atışı sayısı, vücut ve kuyruk eğriliği, perikardiyal ödem ve yumurta sarısı kesesinin uzaması, mikrosefali, yüzme kesesi gelişimi, genel hareketlilik veya aktivite vb. gibi tüm olası gözlemleri kaydedin. Görüntüleri yakalamak için, temiz bir slaytta temsili embriyoları seçin. Embriyoları mikroskop altında kontrol edin, belirli bir yöne yönlendirin.Döllenmeden altı saat sonra ışınlanan embriyolar için hayatta kalma eğrisi, kontrol grubunda ve 2 gri ve 5 griye maruz kalan embriyolarda embriyolarda önemli bir ölüm olmadığını gösterdi. Dakikadaki kalp atışı sayısı, artan x-ışını radyasyonu dozları ile kalp atış hızının büyük ölçüde azaldığını gösterdi. Kontrol grubunda her 24 saatlik aralıklarla kalp hızının arttığı görüldü.Kalp atışı büyük ölçüde düştüğü için 15 gri ve 20 gri radyasyona maruz kalan embriyolarda ciddi kardiyovasküler deformasyondan şüpheleniliyor. Farklı zaman noktalarında farklı dozlarda radyasyona maruz kalan embriyolar için farklı fenotipik ve gelişimsel kusurlar tasvir edilir ve değerlendirilir. Omurga veya kuyruk bükülmesi, baş malformasyonu ve mikrosefali, gelişim kusurları, perikardiyal ödem, yolk kesesi deformiteleri, yüzme kesesi deformiteleri ve göz yapısındaki değişiklikler için morfolojik gözlemler de yapıldı Gösterdiğimiz protokol için sağlıklı embriyoların seçilmesi, embriyoların ışınlayıcıya uygun şekilde yerleştirilmesi ve çapraz anormalliklerin uygun şekilde değerlendirilmesi bu prosedürün anahtarıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Kolon-26 Karsinoma Tümör taşıyan Kanser Kaşeksi Araştırmaları Modeli Olarak Fare

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Kan ve Serum lekeler kanser biyolojik değerlendirmek örnek depolama için yararlı bir araç olarak kurutulmuş

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Karşılaştırmalı Ilaç değerlendirmesi için ev sahipleri olarak zebrafish larvaları kullanarak pankreas kanserinin hasta türevi heterojen xenograft modeli

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...