Name: organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation
Uploaded: 2022-12-09T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ממועצת המחקר השבדית, קרן המוח השבדית, הקרן השבדית לשבץ מוחי, אזור Skåne, קרן Thorsten and Elsa Segerfalk והיוזמה הממשלתית השבדית לתחומי מחקר אסטרטגיים (StemTherapy).

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות שאושרו על ידי הוועדה האתית המחוזית, לונד, שבדיה (היתר אתי מספר 2021-07006-01). רקמה ניאוקורטיקלית בריאה התקבלה מחולים שעברו ניתוח אלקטיבי לאפילפסיה של האונה הרקתית. הסכמה מדעת התקבלה מכל החולים.
הערה: כל הרקמות שהתקבלו עובדו ללא קשר לגודלן. עם זאת, רקמו?...

<ol>
	<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+treatment+of+stroke:+Present+status+and+future+perspectives.">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).</li><li>Armstrong, M. J., Okun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+Parkinson+disease:+A+review.">Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review.</a> The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+human+neurodegenerative+disorders-How+to+make+it+work.">Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work.</a> Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).</li><li>Tornero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+inputs+from+stroke-injured+brain+to+grafted+human+stem+cell-derived+neurons+activated+by+sensory+stimuli.">Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli.</a> Brain. 140 (3), 692-706 (2017).</li><li>Palma-Tortosa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+in+grafted+human+iPS+cell-derived+cortical+neurons+integrated+in+stroke-injured+rat+brain+regulates+motor+behavior.">Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).</li><li>Robinson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+animal+models+in+research:+A+review.">The current state of animal models in research: A review.</a> International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Gonzalez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+GABAergic+neurons+functionally+integrate+into+human+neuronal+networks.">Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks.</a> Scientific Reports. 11, 22050 (2021).</li><li>Noraberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage,+neuroprotection+and+neurorepair.">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair.</a> Current Drug Targets. CNS &amp; Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).</li><li>Delavaran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+of+brain+infarcts+to+regions+of+endogenous+neurogenesis+and+involvement+of+striatum+in+ischaemic+stroke.">Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke.</a> European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).</li><li>Sabuncu, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+cortical+and+hippocampal+atrophy+in+Alzheimer+disease.">The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease.</a> Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).</li><li>Eugene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organotypic+brain+slice+preparation+from+adult+patients+with+temporal+lobe+epilepsy.">An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy.</a> The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).</li><li>Mendes, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+adult+human+brain-derived+slice+cultures+as+a+model+to+study+the+neuronal+impact+of+Alzheimer's+disease-associated+A&#946;+oligomers.">Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated A&#946; oligomers.</a> The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).</li><li>Kalmbach, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signature+morpho-electric,+transcriptomic,+and+dendritic+properties+of+human+layer+5+neocortical+pyramidal+neurons.">Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).</li><li>Barth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inclusions+and+neurofilament+light+chain+release+follow+neuronal+alpha-synuclein+lesions+in+long-term+brain+slice+cultures.">Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures.</a> Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).</li><li>Almeida, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+infection+by+oropouche+virus+in+adult+human+brain+slices+induces+an+inflammatory+and+toxic+response.">Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).</li><li>Schwarz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebrospinal+fluid+promotes+long-term+neuronal+viability+and+network+function+in+human+neocortical+organotypic+brain+slice+cultures.">Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures.</a> Scientific Reports. 7, 12249 (2017).</li><li>Miskinyte, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+functional+excitatory+cortical+neurons+integrating+into+human+neural+networks.">Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 207 (2017).</li><li>Gronning Hansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafted+human+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neurons+integrate+into+adult+human+cortical+neural+circuitry.">Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry.</a> Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).</li><li>Falk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+of+neuroepithelial-like+stem+cells+from+pluripotent+stem+cells+provides+a+versatile+system+for+in+vitro+production+of+human+neurons.">Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons.</a> PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).</li><li>Avaliani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+reveal+delayed+afferent+synaptogenesis+on+grafted+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+progenitors.">Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors.</a> Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).</li><li>Engel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+parameter:+temporal+lobe+and+localized+neocortical+resections+for+epilepsy.">Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy.</a> Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).</li><li>Qi, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slice+culture:+A+useful+tool+to+study+brain+disorders+and+potential+therapeutic+compounds.">Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+response+of+resected+human+brain+tissue+in+vitro.">Injury response of resected human brain tissue in vitro.</a> Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+loyalties+of+neuronal+markers+in+cultured+slices+of+resected+human+brain+tissue.">Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue.</a> Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).</li><li>Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+of+microglia+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury.</a> Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).</li><li>Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slices+for+epilepsy+research:+Pitfalls,+solutions+and+future+challenges.">Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).</li><li>Schwarz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+adult+human+brain+slice+cultures+as+a+model+system+to+study+human+CNS+circuitry+and+disease.">Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease.</a> Elife. 8, 48417 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+technology+for+brain+and+therapeutics+research.">Organoid technology for brain and therapeutics research.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurological+diseases+with+human+brain+organoids.">Modeling neurological diseases with human brain organoids.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).</li><li>Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+in+stem+cell+therapy+for+stroke:+Filling+the+gap.">Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).</li></ol>

השגת פרוסות hACtx באיכות גבוהה מספיק היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. רקמת קליפת המוח מתקבלת מחולים אפילפטיים שעברו ניתוח כריתה24. איכות הרקמה המנותחת, כמו גם זמן החשיפה של הרקמה בין כריתה לתרבית, היא קריטית; ככל שהרקמה מועברת מהר יותר מחדר הניתוח למעבדה ונחתכת, כך הת...

הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או שבץ איסכמי, הן קבוצה של מחלות החולקות את התכונה המשותפת של תפקוד עצבי או מוות. הם הטרוגניים במונחים של אזור המוח והאוכלוסייה העצבית מושפעת. למרבה הצער, טיפולים למחלות אלה הם נדירים או בעלי יעילות מוגבלת בשל היעדר מודלים של בעלי חיים המחקים את מה שקורה במוח האנושי 1,2. טיפול בתאי גזע הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר להתחדשות המוח3. הדור של אבות עצביים מתאי גזע ממקורות שונים התפתח מאוד בשנים האחרונות 4,5. פרסומים אחרונים הראו כי תאי גזע דמויי נוירואפיתל (lt-NES) המושרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע ארוכי טווח המתחדשים מעצמם, בעקבות פרוטוקול התמיינות קליפת המוח ולאחר השתלה תוך-קורטיקלית במודל חולדה עם שבץ איסכמי המשפיע על קליפת המוח הסומטוסנסורית, מייצרים נוירונים בוגרים בקליפת המוח. בנוסף, תאי העצב שמקורם בשתלים קיבלו קשרים סינפטיים afferent ו-efferent מהנוירונים המארחים, והראו את השתלבותם ברשת העצבית של החולדה 6,7. האקסונים שמקורם בשתלים עברו מיאלינציה ונמצאו באזורים שונים במוח החולדה, כולל אזור הפרי-אוטם, כפיס המוח וקליפת המוח הסומטוסנסורית. והכי חשוב, השתלת תאי iPS הפכה ליקויים מוטוריים בחיות שבץ7.
גם אם מודלים של בעלי חיים עוזרים לחקור הישרדות השתלות, אינטגרציה עצבית והשפעת התאים המושתלים על תפקודים מוטוריים וקוגניטיביים, מידע על אינטראקציה בין תאים אנושיים (שתל-מארח) חסר במערכת זו 8,9. מסיבה זו, מתוארת כאן שיטה משולבת של תרבית אורגנוטיפית ארוכת טווח במוח האנושי עם השתלת ex vivo של אבות עצביים אנושיים שמקורם בתאי iPS. תרביות אורגנוטיפיות של המוח האנושי המתקבלות מכריתות נוירוכירורגיות הן מודלים תלת-ממדיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של המוח, המאפשרים לחוקרים להגביר את הבנתם את המעגלים החשמליים של מערכת העצבים המרכזית האנושית ואת הדרך המדויקת ביותר לבחון טיפולים להפרעות במוח האנושי. עם זאת, לא נעשה מספיק מחקר בהקשר זה, וברוב המקרים, תרביות אורגנוטיפיות של מוח ההיפוקמפוס האנושי שימשו10,11. קליפת המוח מושפעת ממספר הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון שבץ איסכמי12 או מחלת אלצהיימר13, ולכן חשוב שתהיה לנו מערכת תלת ממדית קליפת המוח האנושית המאפשרת לנו להרחיב את הידע שלנו ולבדוק ולאמת אסטרטגיות טיפוליות שונות. מספר מחקרים בשנים האחרונות השתמשו בתרביות מרקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) כדי למדל מחלות מוח אנושיות 14,15,16,17,18,19; עם זאת, מידע מוגבל זמין בהקשר של טיפול בתאי גזע. שני מחקרים כבר הוכיחו את היתכנות המערכת המתוארת כאן. בשנת 2018, תאי גזע עובריים אנושיים שתוכנתו עם גורמי שעתוק שונים והושתלו ברקמת hACtx הוכחו כמולידים נוירונים קליפתיים בוגרים שיכולים להשתלב ברשתות קליפת המוח האנושיות הבוגרות20. בשנת 2020, השתלת תאי LT-NES במערכת האורגנוטיפית האנושית חשפה את יכולתם להתמיין לנוירונים קליפתיים בוגרים וספציפיים לשכבה עם התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירונים פונקציונליים. תאי העצב המושתלים יצרו מגעים סינפטיים משפיעים ותוססים עם תאי העצב בקליפת המוח האנושית בפרוסות המוח הבוגרות, כפי שאומתו על ידי מעקב מונוסינפטי מדרדר של נגיף הכלבת, רישומי טלאי של תאים שלמים ומיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Cutting and electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controller&#160;</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>TC0511354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julaba FL 300</td>
			<td>9661012.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Patch-Clamp amplifier</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>EPC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-Triphosphate disodium salt</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>371701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>Patchmaster 2x91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B25135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive: Acryl super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2062278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RINSING SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alvetex scaffold 6 well insert</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP004-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys without Phenol Red</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>#05791</td>
			<td>Referenced as neuronal medium in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter units 250 mL or 500 mL</td>
			<td>Corning Sigma</td>
			<td>CLS431096/97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Referenced as L-glutamine in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENERATION OF lt-NES cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Free Recombinant EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Suplemment (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine, V. calcifornicum</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td># 239803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+) Glucose solution (45%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100 x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Merk</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Wnt-3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>MilliQ filter system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR CELL CULTURE&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS354277-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Centrifugen</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td>5% CO2, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoForma Steri-Cult CO2</td>
			<td>HEPA Class100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>14601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips 0.1-1000 &#160;&#181;L</td>
			<td>Biotix VWR</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL</td>
			<td>Costar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks Nunc</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-545-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>016-600-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D27802</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AIF1 (C-terminal)&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AHP2024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MBP&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>808402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SC123&#160;</td>
			<td>Stem Cells Inc</td>
			<td>AB-123-U-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>S30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>150127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium phospate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TMEM119&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab185333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>327371000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN Black edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation

הפרעות נוירודגנרטיביות נפוצות והטרוגניות מבחינת הסימפטומים שלהן וההשפעה התאית, מה שהופך את המחקר שלהם למסובך בשל היעדר מודלים נכונים של בעלי חיים המחקים באופן מלא מחלות אנושיות והזמינות הירודה של רקמת המוח האנושית לאחר המוות. תרבית רקמת העצבים האנושית למבוגרים מציעה את האפשרות לחקור היבטים שונים של הפרעות נוירולוגיות. מנגנונים מולקולריים, תאיים וביוכימיים יכולים להיות מטופלים בקלות במערכת זו, כמו גם בדיקה ותיקוף של תרופות או טיפולים שונים, כגון טיפולים מבוססי תאים. שיטה זו משלבת תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת, המתקבלות מחולי אפילפסיה שעברו ניתוח כריתה, והשתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קליפת המוח המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע. שיטה זו תאפשר לחקור את הישרדות התא, התמיינות עצבית, היווצרות קלטים ויציאות סינפטיים, ואת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאים שמקורם בבני אדם לאחר השתלה ברקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת השלמה. גישה זו היא צעד חשוב לפני פיתוח פלטפורמה תלת-ממדית למידול מחלות אנושיות שתקרב את המחקר הבסיסי לתרגום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע לחולים עם הפרעות נוירולוגיות שונות ותאפשר פיתוח כלים חדשים לשחזור מעגלים עצביים פגועים.

בעקבות הפרוטוקול המתואר, רקמת hACtx מחולה עם אפילפסיה של האונה הרקתית נאספה ועובדה, כפי שהוסבר לעיל. כמה פרוסות נקבעו לאחר 24 שעות בתרבית כדי לחקור את נקודת ההתחלה של הרקמה המארחת. ניתוח של אוכלוסיות תאים עצביים שונות כמו תאי עצב (המבטאים NeuN ו-Map2, איור 1A), אוליגודנדרוציטים (Olig2 ו-MBP, איור 1B) ואסטרו...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation at JoVE.com

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

פרוטוקול זה מתאר תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת בשילוב עם השתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קורטיקליים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע, אשר מציגים מתודולוגיה חדשנית לבדיקה נוספת של טיפולים מבוססי תאי גזע להפרעות נוירודגנרטיביות אנושיות.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הבוגרת האנושית הן עד כה המערכת היחידה לבדיקת טיפולים בתאי גזע עבור קליפת המוח הפגומה המאפשרת לחקור את האינטראקציה בין תאים אנושיים מושתלים לתאים מארחים אנושיים. טיפול שנבחן במודלים של בעלי חיים נכשל בדרך כלל כאשר הוא מתורגם למסגרות הקליניות בשל ההבדלים בין מכרסם לתאים אנושיים. כאן, אנו יכולים לחקור תאים מושתלים, הישרדות, התמיינות ופונקציונליות בסביבה מאדם לאדם.מתודולוגיה זו תעזור לנו להבין כיצד המעגלים העצביים פועלים במוח האנושי, והיא גם תעודד את תרגום הידע הזה להגדרות הקליניות כדי לשפר את ההתאוששות התפקודית לאחר נזק מוחי. ידגימו את ההליך רחל מרטינז-קוריאל, דוקטורנטית, וקוסטנזה ארטיו-מדינה, סטודנטית לתואר שני, שתיהן מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הניחו את תוספות התרבית בצלחת בת שש בארות באמצעות מלקחיים במעבדה לתרביות תאים מתחת למכסה מנוע מאוורר.הוסף חמישה מיליליטר של המדיום קליפת המוח הבוגר האנושי בתחתית העלון עד שהוא בא במגע עם הממברנה. הימנעו מהיווצרות בועות והוסיפו שני מיליליטר של המדיום על גבי העלון. לפני העברת פרוסות הרקמה לתוספות, יש לאזן אותן באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך שעתיים לפחות.אספו את הרקמה מהמטופל בחדר הניתוח לתוך מיכל של תמיסת חיתוך קפואה, מבעבעת ומרוסקת. מעבירים מיד את המיכל הסגור על קרח לאזור החיתוך של המעבדה. בדקו את הרקמה, ובהתחשב בכיוון של שכבת קליפת המוח, אתרו את המשטח הטוב ביותר כדי להדביק אותו לשלב החיתוך של הוויברטום.במידת הצורך, חתכו את המשטח הלא אחיד עם האזמל כדי להניח את הרקמה על הבמה לכיוון פרוסה אופטימלי. לאחר מכן, הדביקו את הרקמה לשלב עם דבק רקמות. מניחים אותו בתא החיתוך וממלאים אותו מיד בתמיסת חיתוך קרה ומבעבעת.המשיכו את המבעבעים במהלך כל הליך החיתוך. כעת חתכו פרוסות קורונליות או קשתות בהתאם לכיוון הרקמה ללהב כמתואר בכתב היד. מניחים את הפרוסות בתא האיסוף עם תמיסת חיתוך מבעבעת בטמפרטורת החדר.לאחר שכל הרקמה נחתכה, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת שטיפה בטמפרטורת החדר כדי להסיר עודפי סוכרוז מהפרוסות ולהעבירן למעבדה לתרביות תאים. לאחר מכן, הניחו את פרוסות הרקמה בנפרד על גבי התוספות הרטובות והשקועות. לאחר 24 שעות, שנה את המדיום כדי להסיר את שאריות הסוכרוז או חומרים שיוריים אחרים מהליך החיתוך.לאחר שבועיים, השתמש בתווך קליפת המוח האנושית הבוגרת ללא גנטמיצין. הסר את המדיה מבקבוק תרבית התא. ביום השביעי להתמיינות, יש לנתק תאי GFP-lt-NES שעברו הכנה קורטית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר טריפסין ולדגור במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להוסיף נפח שווה של מעכב טריפסין ואחריו חמישה מיליליטר של מדיום DDM. להשהות מחדש את התאים, להעביר בעדינות את תרחיף התא לתוך צינור 15 מיליליטר, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 גרם.בינתיים, להעביר את הצלחת המכילה את הרקמה האנושית מן האינקובטור אל מכסה המנוע, ולהסיר שני מיליליטר של מדיה מראש החדר. בסוף הצנטריפוגה, מסירים את הסופרנטנט, משעים מחדש את התאים במטריצת קרום מרתף קרה, טהורה, ומעבירים את הפנסיה לצינור קטן יותר.אספו את מתלה התא לתוך נימי זכוכית קרים המחוברים לטיט גומי לשאיבה. הזריקו את תרחיף התא כטיפות זעירות על ידי דקירת פרוסת הרקמה החצי יבשה באתרים שונים. תנו לג'ל להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר מכן, להעביר את הצלחת מן האינקובטור בחזרה אל מכסה המנוע בזהירות להוסיף שני מיליליטר של מדיום קליפת המוח הבוגר האנושי לחלק העליון של הכנס כדי לטבול לחלוטין את הרקמה. רקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת החריפה הראתה נוכחות של נוירונים, אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים המציגים שימור אופטימלי של הרקמה. הרקמה הראתה ביטוי של סמנים עצביים NeuN ו- Map2 לאחר שבועיים של תרבית תאים.רישום מהדק טלאי התא כולו הראה שלתאי עצב היה פוטנציאל מתמשך של קרום מנוחה ועמידות לקלט הממברנה, בדומה לתאי עצב מתכשירים חריפים. התאים היו מעט פחות פעילים מאשר ברקמה טרייה, אם כי רוב התאים היו מסוגלים לירות לפחות פוטנציאל פעולה אחד, אם לא מרובים. רקמת קליפת המוח החריפה הראתה ביטוי של סמנים מיקרוגליאליים Iba1 ו- Tmem119.לאחר שבועיים בתרבית, תאי המיקרוגליה נעשו פחות מסועפים ורכשו מורפולוגיה פעילה יותר מאשר ברקמה חריפה. ארבעה שבועות לאחר השתלת ex vivo, תאי GFP-lt-NES שהושתלו הציגו נוירוטים מורחבים עם ארבוריזציה נרחבת ומורכבת לאורך כל התרבית האורגנוטיפית. בקושי שרדו תאים מושתלים ברקמה שהשתמרה בצורה גרועה.פסולת ותיוג לא ספציפי של נוגדנים על תאים מתים נצפו באופן נרחב בכל הפרוסה האנושית. במקרה של השתלה מוצלחת, התאים הפכו פעילים מבחינה תפקודית ותאי עצב בוגרים הראו פוטנציאלי פעולה חוזרים ונשנים ולעתים קרובות ספונטניים. נתרן מהיר פנימה, זרמי אשלגן איטיים כלפי חוץ ורמה מסוימת של פעילות סינפטית מצביעים על אינטגרציה תפקודית של השתל עם הרקמה המארחת ארבעה שבועות לאחר ההשתלה.ככל שהרקמה האנושית מעובדת מהר יותר ברגע שהיא יוצאת מחדר הניתוח, כך כדאיות המערכת גבוהה יותר והצלחת ההליך הניסיוני גבוהה יותר.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

עכבר המוח האחורי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...