Name: organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation
Uploaded: 2022-12-09T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation at JoVE.com

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni del Consiglio svedese per la ricerca, della Swedish Brain Foundation, della Swedish Stroke Foundation, della Region Skåne, della Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation e dell'iniziativa del governo svedese per le aree di ricerca strategiche (StemTherapy).

Questo protocollo segue le linee guida approvate dal Comitato etico regionale, Lund, Svezia (numero di permesso etico 2021-07006-01). Il tessuto neocorticale sano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva per l'epilessia del lobo temporale. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.
NOTA: Tutti i tessuti ottenuti sono stati lavorati indipendentemente dalle loro dimensioni. Tuttavia, i tessuti di dimensioni inferiori a 1-1,5 mm3 saranno tecnicame...

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slice+culture:+A+useful+tool+to+study+brain+disorders+and+potential+therapeutic+compounds.">Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+response+of+resected+human+brain+tissue+in+vitro.">Injury response of resected human brain tissue in vitro.</a> Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+loyalties+of+neuronal+markers+in+cultured+slices+of+resected+human+brain+tissue.">Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue.</a> Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).</li><li>Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+of+microglia+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury.</a> Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).</li><li>Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+technology+for+brain+and+therapeutics+research.">Organoid technology for brain and therapeutics research.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurological+diseases+with+human+brain+organoids.">Modeling neurological diseases with human brain organoids.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).</li><li>Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+in+stem+cell+therapy+for+stroke:+Filling+the+gap.">Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).</li></ol>

Ottenere fette hACtx di qualità sufficientemente elevata è il passaggio più critico in questo protocollo. Il tessuto corticale è ottenuto da pazienti epilettici sottoposti a chirurgia resettiva24. La qualità del tessuto resecato, così come il tempo di esposizione del tessuto tra la resezione e la coltura, è fondamentale; Più velocemente il tessuto viene trasferito dalla sala operatoria al laboratorio e tagliato, più ottimale sarà la coltura organotipica. Idealmente, il ...

I disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer o l'ictus ischemico, sono un gruppo di malattie che condividono la caratteristica comune del malfunzionamento o della morte neuronale. Sono eterogenei in termini di area cerebrale e popolazione neuronale interessata. Sfortunatamente, i trattamenti per queste malattie sono scarsi o di efficacia limitata a causa della mancanza di modelli animali che imitano ciò che accade nel cervello umano 1,2. La terapia con cellule staminali è una delle strategie più promettenti per la rigenerazione cerebrale3. La generazione di progenitori neuronali da cellule staminali provenienti da diverse fonti è stata notevolmente sviluppata negli ultimi anni 4,5. Recenti pubblicazioni hanno dimostrato che cellule staminali pluripotenti (iPS) derivate da cellule staminali neuroepiteliali autorinnovanti (lt-NES) derivate da cellule staminali neuroepiteliali autorinnovanti umane, seguendo un protocollo di differenziazione corticale e dopo trapianto intracorticale in un modello di ratto con ictus ischemico che colpisce la corteccia somatosensoriale, generano neuroni corticali maturi. Inoltre, i neuroni derivati dall'innesto hanno ricevuto connessioni sinaptiche afferenti ed efferenti dai neuroni ospiti, mostrando la loro integrazione nella rete neuronale del ratto 6,7. Gli assoni derivati dall'innesto erano mielinizzati e trovati in diverse aree del cervello del ratto, tra cui l'area peri-infartuale, il corpo calloso e la corteccia somatosensoriale controlaterale. Ancora più importante, il trapianto derivato da cellule iPS ha invertito i deficit motori negli animali colpiti da ictus7.
Anche se i modelli animali aiutano a studiare la sopravvivenza del trapianto, l'integrazione neuronale e l'effetto delle cellule innestate sulle funzioni motorie e cognitive, inquesto sistema mancano informazioni sull'interazione tra cellule umane (graft-host) 8,9. Per questo motivo, viene descritto un metodo combinato di coltura organotipica del cervello umano a lungo termine con il trapianto ex vivo di progenitori neuronali derivati da cellule iPS umane. Le colture organotipiche del cervello umano ottenute da resezioni neurochirurgiche sono modelli 3D fisiologicamente rilevanti del cervello che consentono ai ricercatori di aumentare la loro comprensione dei circuiti del sistema nervoso centrale umano e del modo più accurato di testare i trattamenti per i disturbi cerebrali umani. Tuttavia, non sono state fatte abbastanza ricerche in questo contesto e, nella maggior parte dei casi, sono state utilizzate colture organotipiche del cervello ippocampale umano10,11. La corteccia cerebrale è affetta da diverse malattie neurodegenerative, come l'ictus ischemico12 o il morbo di Alzheimer13, quindi è importante avere un sistema 3D corticale umano che ci permetta di espandere le nostre conoscenze e di testare e convalidare diverse strategie terapeutiche. Diversi studi negli ultimi anni hanno utilizzato colture di tessuto corticale umano adulto (hACtx) per modellare le malattie del cervello umano 14,15,16,17,18,19; Tuttavia, sono disponibili informazioni limitate nel contesto della terapia con cellule staminali. Due studi hanno già dimostrato la fattibilità del sistema qui descritto. Nel 2018, le cellule staminali embrionali umane programmate con diversi fattori di trascrizione e trapiantate nel tessuto hACtx hanno dimostrato di dare origine a neuroni corticali maturi che potrebbero integrarsi nelle reti corticali umane adulte20. Nel 2020, il trapianto di cellule lt-NES nel sistema organotipico umano ha rivelato la loro capacità di differenziarsi in neuroni corticali maturi e stratificati specifici con le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni funzionali. I neuroni innestati hanno stabilito contatti sinaptici sia afferenti che efferenti con i neuroni corticali umani nelle fette di cervello adulto, come confermato dal tracciamento monosinaptico retrogrado del virus della rabbia, dalle registrazioni di patch-clamp a cellule intere e dalla microscopia immunoelettronica21.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Cutting and electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controller&#160;</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>TC0511354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julaba FL 300</td>
			<td>9661012.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Patch-Clamp amplifier</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>EPC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-Triphosphate disodium salt</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>371701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>Patchmaster 2x91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B25135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive: Acryl super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2062278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RINSING SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alvetex scaffold 6 well insert</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP004-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys without Phenol Red</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>#05791</td>
			<td>Referenced as neuronal medium in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter units 250 mL or 500 mL</td>
			<td>Corning Sigma</td>
			<td>CLS431096/97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Referenced as L-glutamine in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENERATION OF lt-NES cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Free Recombinant EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Suplemment (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine, V. calcifornicum</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td># 239803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+) Glucose solution (45%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100 x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Merk</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Wnt-3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>MilliQ filter system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR CELL CULTURE&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS354277-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Centrifugen</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td>5% CO2, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoForma Steri-Cult CO2</td>
			<td>HEPA Class100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>14601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips 0.1-1000 &#160;&#181;L</td>
			<td>Biotix VWR</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL</td>
			<td>Costar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks Nunc</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-545-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>016-600-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D27802</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AIF1 (C-terminal)&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AHP2024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MBP&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>808402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SC123&#160;</td>
			<td>Stem Cells Inc</td>
			<td>AB-123-U-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>S30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>150127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium phospate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TMEM119&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab185333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>327371000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN Black edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation

Le malattie neurodegenerative sono comuni ed eterogenee in termini di sintomi e affettività cellulare, rendendo il loro studio complicato a causa della mancanza di modelli animali adeguati che imitano completamente le malattie umane e della scarsa disponibilità di tessuto cerebrale umano post-mortem. La coltura del tessuto nervoso umano adulto offre la possibilità di studiare diversi aspetti dei disturbi neurologici. I meccanismi molecolari, cellulari e biochimici potrebbero essere facilmente affrontati in questo sistema, così come testare e convalidare farmaci o trattamenti diversi, come le terapie cellulari. Questo metodo combina colture organotipiche a lungo termine della corteccia umana adulta, ottenute da pazienti epilettici sottoposti a chirurgia resettiva, e trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo consentirà lo studio della sopravvivenza cellulare, della differenziazione neuronale, della formazione di input e output sinaptici e delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule derivate dall'uomo dopo il trapianto in tessuto corticale umano adulto intatto. Questo approccio è un passo importante prima dello sviluppo di una piattaforma 3D di modellazione delle malattie umane che avvicinerà la ricerca di base alla traduzione clinica delle terapie basate su cellule staminali per pazienti con diversi disturbi neurologici e consentirà lo sviluppo di nuovi strumenti per la ricostruzione dei circuiti neurali danneggiati.

Seguendo il protocollo descritto, è stato raccolto ed elaborato il tessuto hACtx di un paziente con epilessia del lobo temporale, come spiegato sopra. Alcune fette sono state fissate dopo 24 ore in coltura per studiare il punto di partenza del tessuto ospite. L'analisi di diverse popolazioni di cellule neurali come neuroni (che esprimono NeuN e Map2, Figura 1A), oligodendrociti (Olig2 e MBP, Figura 1B) e astrociti (GFAP umano-specifico, chiamato anche STEM123, Figura 1C) ha <strong class="x...

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Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Questo protocollo descrive colture organotipiche a lungo termine di corteccia umana adulta combinate con trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, che presentano una nuova metodologia per testare ulteriormente terapie basate su cellule staminali per malattie neurodegenerative umane.

Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Le colture organotipiche della corteccia adulta umana sono finora l'unico sistema per testare le terapie con cellule staminali per la corteccia danneggiata che consente di studiare l'interazione tra cellule umane innestate e cellule ospiti umane. Una terapia testata in modelli animali di solito fallisce quando tradotta in contesti clinici a causa delle differenze tra cellule di roditori e cellule umane. Qui, possiamo studiare le cellule innestate, la sopravvivenza, la differenziazione e la funzionalità in un ambiente da uomo a uomo.Questa metodologia ci aiuterà a capire come funziona il circuito neurale nel cervello umano e stimolerà anche la traduzione di queste conoscenze in contesti clinici per migliorare il recupero funzionale dopo il danno cerebrale. A dimostrare la procedura saranno Raquel Martinez-Curiel, dottoranda, e Costanza Aretio-Medina, studentessa di master, entrambe del mio laboratorio. Per iniziare, posizionare gli inserti di coltura in una piastra a sei pozzetti usando una pinza nel laboratorio di coltura cellulare sotto un cappuccio ventilato.Aggiungere cinque millilitri del mezzo corticale adulto umano sul fondo dell'inserto fino a quando non entra in contatto con la membrana. Evitare la formazione di bolle e aggiungere due millilitri del mezzo sulla parte superiore dell'inserto. Prima di trasferire le fette di tessuto negli inserti, equilibrarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno due ore.Raccogliere il tessuto dal paziente in sala operatoria in un contenitore di soluzione di taglio congelata, bollata e schiacciata. Trasferire immediatamente il contenitore chiuso sul ghiaccio nell'area di taglio del laboratorio. Ispezionare il tessuto e, considerando l'orientamento dello strato corticale, individuare la superficie migliore per incollarlo allo stadio di taglio del vibratomo.Se necessario, tagliare la superficie irregolare con il bisturi per posizionare il tessuto sul palco per un orientamento ottimale delle fette. Quindi, incollare il tessuto sul palco con adesivo velinato. Metterlo nella camera di affettatura e riempirlo immediatamente con una soluzione di taglio fredda e a bolle.Continuare la gorgogliatura durante tutta la procedura di taglio. Ora taglia fette coronali o sagittali a seconda dell'orientamento tessuto-lama come descritto nel manoscritto. Posizionare le fette nella camera di raccolta con soluzione di taglio gorgogliante a temperatura ambiente.Una volta che tutto il tessuto è stato tagliato, trasferire le fette in una capsula di Petri sterile con soluzione di risciacquo a temperatura ambiente per rimuovere il saccarosio in eccesso dalle fette e trasportarle al laboratorio di coltura cellulare. Quindi, posizionare le fette di tessuto singolarmente sopra gli inserti bagnati e sommersi. Dopo 24 ore, cambiare il terreno per rimuovere eventuali residui di saccarosio o altre sostanze residue dalla procedura di taglio.Dopo due settimane, utilizzare il mezzo corticale adulto umano senza gentamicina. Rimuovere il supporto dal pallone di coltura cellulare. Il settimo giorno di differenziazione, staccare le cellule GFP-lt-NES innescate corticalmente aggiungendo 500 microlitri di tripsina e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere un volume uguale dell'inibitore della tripsina seguito da cinque millilitri di mezzo DDM. Risospendere le cellule, trasferire delicatamente la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 300 G.Nel frattempo, trasferire la piastra contenente il tessuto umano dall'incubatore al cappuccio e rimuovere due millilitri di supporto dalla parte superiore dell'inserto. Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in una matrice di membrana basale fredda, pura, e trasferire la pensione in un tubo più piccolo.Raccogliere la sospensione cellulare in un capillare di vetro freddo collegato a una tettarella di gomma per l'aspirazione. Iniettare la sospensione cellulare come piccole gocce pugnalando la fetta di tessuto semi-secco in vari siti. Lasciare solidificare il gel a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, trasferire la piastra dall'incubatore al cappuccio e aggiungere con attenzione due millilitri di mezzo corticale adulto umano nella parte superiore dell'inserto per immergere completamente il tessuto. Il tessuto corticale adulto umano acuto ha mostrato la presenza di neuroni, oligodendrociti e astrociti che mostrano una conservazione ottimale del tessuto. Il tessuto ha mostrato l'espressione dei marcatori neuronali NeuN e Map2 dopo due settimane di coltura cellulare.La registrazione dell'intero patch clamp cellulare ha mostrato che i neuroni avevano un potenziale di membrana a riposo e una resistenza all'input di membrana, paragonabile ai neuroni di preparazioni acute. Le cellule erano leggermente meno attive rispetto al tessuto fresco, sebbene la maggior parte delle cellule fosse in grado di attivare almeno uno se non più potenziali d'azione. Il tessuto corticale acuto ha mostrato l'espressione dei marcatori microgliali Iba1 e Tmem119.Dopo due settimane in coltura, la microglia è diventata meno ramificata e ha acquisito una morfologia più attivata rispetto al tessuto acuto. Quattro settimane dopo il trapianto ex vivo, le cellule GFP-lt-NES innestate hanno mostrato neuriti estesi con arborizzazioni estese e complesse in tutta la coltura organotipica. Quasi nessuna cellula innestata è sopravvissuta in tessuto mal conservato.Detriti ed etichettatura non specifica degli anticorpi sulle cellule morte sono stati ampiamente osservati in tutta la fetta umana. In caso di trapianto riuscito, le cellule sono diventate funzionalmente attive e i neuroni maturi hanno mostrato potenziali d'azione ripetitivi e spesso spontanei. Il sodio verso l'interno veloce, le correnti di potassio lente verso l'esterno e un certo livello di attività sinaptica indicano l'integrazione funzionale dell'innesto con il tessuto ospite quattro settimane dopo l'innesto.Più velocemente il tessuto umano viene elaborato una volta uscito dalla sala operatoria, maggiore è la vitalità del sistema e il successo della procedura sperimentale.

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