Name: organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation
Uploaded: 2022-12-09T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation at JoVE.com

이 연구는 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council), 스웨덴 뇌 재단(Swedish Brain Foundation), 스웨덴 뇌졸중 재단(Swedish Stroke Foundation), 스코네(Skåne) 지역, 토르스텐 및 엘사 세게르팔크 재단(Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation), 스웨덴 정부의 전략 연구 분야 이니셔티브(StemTherapy)의 보조금으로 지원됩니다.

이 프로토콜은 스웨덴 룬드에 있는 지역 윤리 위원회(윤리 허가 번호 2021-07006-01)에서 승인한 지침을 따릅니다. 건강한 신피질 조직은 측두엽 간질에 대한 선택적 수술을 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
참고: 얻은 모든 조직은 크기에 관계없이 처리되었습니다. 그러나 크기가 1-1.5mm3보다 작은 조직은 기술적으로 다루?...

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slice+culture:+A+useful+tool+to+study+brain+disorders+and+potential+therapeutic+compounds.">Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+response+of+resected+human+brain+tissue+in+vitro.">Injury response of resected human brain tissue in vitro.</a> Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+loyalties+of+neuronal+markers+in+cultured+slices+of+resected+human+brain+tissue.">Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue.</a> Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).</li><li>Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+of+microglia+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury.</a> Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).</li><li>Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+technology+for+brain+and+therapeutics+research.">Organoid technology for brain and therapeutics research.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurological+diseases+with+human+brain+organoids.">Modeling neurological diseases with human brain organoids.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).</li><li>Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+in+stem+cell+therapy+for+stroke:+Filling+the+gap.">Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).</li></ol>

충분히 높은 품질의 hACtx 슬라이스를 얻는 것이 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 피질 조직은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻어진다24. 절제된 조직의 품질과 절제와 배양 사이의 조직 노출 시간은 매우 중요합니다. 조직이 수술실에서 실험실로 더 빨리 옮겨지고 절단될수록 기관형 배양이 더 최적화됩니다. 이상적으로는 조직을 절단하여 수집 후 처...

파킨슨병, 알츠하이머병 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 장애는 신경 기능 장애 또는 사망의 공통된 특징을 공유하는 질병 그룹입니다. 그들은 영향을받는 뇌 영역과 신경 집단 측면에서 이질적입니다. 불행하게도, 이러한 질병에 대한 치료법은 인간의 뇌에서 일어나는 것을 모방하는 동물 모델이 없기 때문에 드물거나 효능이 제한적이다 1,2. 줄기세포 치료는 뇌 재생을 위한 가장 유망한 전략 중 하나이다3. 다른 출처의 줄기 세포에서 신경 전구 세포의 생성은 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다 4,5. 최근 간행물에 따르면 인간 유도 만능 줄기(iPS) 세포 유래 장기 자가 재생 신경상피 유사 줄기(lt-NES) 세포는 피질 분화 프로토콜에 따라 체성 감각 피질에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중이 있는 쥐 모델에서 피질 내 이식 후 성숙한 피질 뉴런을 생성합니다. 또한, 이식편 유래 뉴런은 숙주 뉴런으로부터 구 심성 및 원심성 시냅스 연결을 받아 쥐 뉴런 네트워크 6,7에 통합되었음을 보여줍니다. 이식편 유래 축삭은 수초화되어 경색 주위 영역, 뇌량 및 반대쪽 체성 감각 피질을 포함하여 쥐 뇌의 다른 영역에서 발견되었습니다. 가장 중요한 것은 iPS 세포 유래 이식이 뇌졸중 동물의 운동 장애를 역전시켰다는 것이다 7.
동물 모델이 이식 생존, 신경 통합, 이식된 세포가 운동 및 인지 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 되더라도 인간 세포(이식편-숙주) 간의 상호 작용에 대한 정보는 이 시스템에서 누락되어 있습니다 8,9. 이러한 이유로, 인간 iPS 세포 유래 뉴런 전구체의 생체 외 이식과 함께 장기 인간 뇌 기관형 배양의 조합 방법이 여기에 기재되어 있다. 신경외과적 절제술을 통해 얻은 인간 뇌 기관형 배양은 생리학적으로 관련된 뇌의 3D 모델로, 연구자들이 인간 중추 신경계 회로에 대한 이해와 인간 뇌 질환 치료법을 테스트하는 가장 정확한 방법을 높일 수 있습니다. 그러나 이러한 맥락에서 충분한 연구가 이루어지지 않았으며, 대부분의 경우 인간 해마 뇌 기관형 배양이 사용되었습니다10,11. 대뇌 피질은 허혈성 뇌졸중12 또는 알츠하이머 병13과 같은 여러 신경 퇴행성 질환의 영향을 받기 때문에 지식을 넓히고 다양한 치료 전략을 테스트하고 검증 할 수있는 인간 피질 3D 시스템을 갖는 것이 중요합니다. 지난 몇 년 동안 여러 연구에서 성인 인간 피질(hACtx) 조직의 배양을 사용하여 인간 뇌 질환을 모델링했습니다 14,15,16,17,18,19; 그러나 줄기 세포 치료의 맥락에서 제한된 정보를 사용할 수 있습니다. 두 가지 연구가 이미 여기에 설명 된 시스템의 타당성을 입증했습니다. 2018년, 다양한 전사 인자로 프로그래밍되고 hACtx 조직에 이식된 인간 배아 줄기 세포는 성인 인간 피질 네트워크에 통합될 수 있는 성숙한 피질 뉴런을 생성하는 것으로 나타났습니다20. 2020년에 lt-NES 세포를 인간 기관형 시스템에 이식한 결과 기능적 뉴런의 전기생리학적 특성을 가진 성숙한 층별 피질 뉴런으로 분화할 수 있는 능력이 밝혀졌습니다. 이식된 뉴런은 성인 뇌 절편에서 인간 피질 뉴런과 구심성 및 원심성 시냅스 접촉을 모두 확립했으며, 이는 광견병 바이러스 역행 단시냅스 추적, 전체 세포 패치 클램프 기록 및 면역 전자 현미경에 의해 확증되었습니다21.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Cutting and electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controller&#160;</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>TC0511354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julaba FL 300</td>
			<td>9661012.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Patch-Clamp amplifier</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>EPC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-Triphosphate disodium salt</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>371701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>Patchmaster 2x91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B25135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive: Acryl super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2062278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RINSING SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alvetex scaffold 6 well insert</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP004-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys without Phenol Red</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>#05791</td>
			<td>Referenced as neuronal medium in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter units 250 mL or 500 mL</td>
			<td>Corning Sigma</td>
			<td>CLS431096/97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Referenced as L-glutamine in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENERATION OF lt-NES cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Free Recombinant EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Suplemment (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine, V. calcifornicum</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td># 239803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+) Glucose solution (45%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100 x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Merk</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Wnt-3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>MilliQ filter system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR CELL CULTURE&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS354277-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Centrifugen</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td>5% CO2, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoForma Steri-Cult CO2</td>
			<td>HEPA Class100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>14601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips 0.1-1000 &#160;&#181;L</td>
			<td>Biotix VWR</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL</td>
			<td>Costar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks Nunc</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-545-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>016-600-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D27802</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AIF1 (C-terminal)&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AHP2024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MBP&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>808402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SC123&#160;</td>
			<td>Stem Cells Inc</td>
			<td>AB-123-U-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>S30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>150127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium phospate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TMEM119&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab185333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>327371000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN Black edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation

신경퇴행성 장애는 증상과 세포 영향 측면에서 흔하고 이질적이어서 인간 질병을 완전히 모방하는 적절한 동물 모델이 부족하고 사후 인간 뇌 조직의 가용성이 낮기 때문에 연구가 복잡합니다. 성인 인간 신경 조직 배양은 신경 장애의 다양한 측면을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 분자, 세포 및 생화학적 메커니즘은 이 시스템에서 쉽게 해결할 수 있을 뿐만 아니라 약물 또는 세포 기반 요법과 같은 다양한 치료법을 테스트하고 검증할 수 있습니다. 이 방법은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻은 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양과 유도만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 이식을 결합합니다. 이 방법을 사용하면 세포 생존, 신경 분화, 시냅스 입력 및 출력 형성, 손상되지 않은 성인 인간 피질 조직에 이식한 후 인간 유래 세포의 전기생리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 다양한 신경 질환 환자를 위한 줄기 세포 기반 치료법의 임상 번역에 더 가까운 기초 연구를 제공하고 손상된 신경 회로를 재구성하기 위한 새로운 도구의 개발을 가능하게 하는 3D 인간 질병 모델링 플랫폼을 개발하기 전에 중요한 단계입니다.

기술된 프로토콜에 따라, 측두엽 간질이 있는 환자로부터의 hACtx 조직을 상기 설명된 바와 같이 수집 및 처리하였다. 몇 개의 슬라이스를 숙주 조직의 시작점을 연구하기 위해 배양 24시간 후에 고정시켰다. 뉴런(NeuN 및 Map2 발현, 그림 1A), 희소돌기아교세포(Olig2 및 MBP, 그림 1B) 및 성상교세포(인간 특이적 GFAP, STEM123이라고도 함, 그림 1C)와 같은 다양한 신경 세포 집단을 분석<st...

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Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

인간 성인 피질의 기관형 배양은 지금까지 인간 이식 된 세포와 인간 숙주 세포 사이의 상호 작용을 연구 할 수있는 손상된 피질에 대한 줄기 세포 치료법을 테스트하는 유일한 시스템입니다. 동물 모델에서 테스트된 치료법은 일반적으로 설치류와 인간 세포의 차이로 인해 임상 환경으로 번역될 때 실패합니다. 여기에서 우리는 인간 대 인간 환경에서 이식된 세포, 생존, 분화 및 기능을 연구할 수 있습니다.이 방법론은 인간의 뇌에서 신경 회로가 어떻게 작동하는지 이해하는 데 도움이 될 것이며, 또한 뇌 손상 후 기능 회복을 개선하기 위해 이 지식을 임상 환경으로 번역하는 것을 자극할 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 인 Raquel Martinez-Curiel과 석사 과정 학생 인 Costanza Aretio-Medina가 내 연구실에서 나온 것입니다. 시작하려면 통풍이 잘되는 후드 아래 세포 배양 실험실에서 집게를 사용하여 6웰 플레이트에 배양 삽입물을 놓습니다.멤브레인과 접촉 할 때까지 삽입물 바닥에 5 밀리리터의 인간 성인 피질 배지를 추가합니다. 기포 형성을 피하고 인서트 위에 2 밀리리터의 매체를 추가하십시오. 조직 조각을 삽입물에 옮기기 전에 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터에서 최소 2 시간 동안 평형을 이룹니다.수술실에 있는 환자의 조직을 냉동, 거품 및 분쇄된 절단 용액 용기에 수집합니다. 얼음 위에 놓인 밀폐된 용기를 즉시 실험실의 절단 영역으로 옮깁니다. 조직을 검사하고 피질층의 방향을 고려하여 비브라톰의 절단 단계에 접착할 최적의 표면을 찾습니다.필요한 경우 메스로 고르지 않은 표면을 잘라 최적의 슬라이스 방향을 위해 스테이지에 티슈를 놓습니다. 그런 다음 조직 접착제로 조직을 무대에 붙입니다. 슬라이싱 챔버에 넣고 즉시 차갑고 거품이 있는 절단 용액으로 채웁니다.전체 절단 절차 동안 버블링을 계속합니다. 이제 원고에 설명 된대로 조직에서 블레이드까지의 방향에 따라 관상 또는 시상 조각을 자릅니다. 실온에서 버블링 절단 용액이 있는 수집 챔버에 슬라이스를 놓습니다.모든 조직이 절단되면 슬라이스를 실온에서 헹굼 용액과 함께 멸균 페트리 접시에 옮겨 슬라이스에서 과도한 자당을 제거하고 세포 배양 실험실로 운반합니다. 다음으로, 조직 슬라이스를 습식 및 수중 인서트 위에 개별적으로 놓습니다. 24시간 후, 배지를 교체하여 절단 절차에서 남아 있는 자당 또는 기타 잔류 물질을 제거합니다.2주 후, 겐타마이신이 없는 인간 성인 피질 배지를 사용한다. 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거합니다. 분화 7일째에 500마이크로리터의 트립신을 첨가하여 피질로 프라이밍된 GFP-lt-NES 세포를 분리하고 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.다음으로, 동일한 부피의 트립신 억제제를 첨가 한 다음 5 밀리리터의 DDM 배지를 첨가하십시오. 세포를 다시 현탁하고, 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 부드럽게 옮기고, 300 G에서 5 분 동안 원심 분리하고, 인큐베이터에서 후드로 인체 조직이 들어있는 플레이트를 옮기고, 인서트 상단에서 2 밀리리터의 배지를 제거한다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고 차갑고 순수한 기저막 매트릭스에서 세포를 다시 현탁하고 연금을 더 작은 튜브로 옮깁니다.흡입을 위해 고무 젖꼭지에 연결된 차가운 유리 모세관에 세포 현탁액을 수집합니다. 다양한 부위에 반건조 조직 조각을 찔러 세포 현탁액을 작은 방울로 주입합니다. 젤이 섭씨 37도에서 30분 동안 굳도록 합니다.그런 다음 인큐베이터에서 후드로 플레이트를 다시 옮기고 인서트 상단에 2 밀리리터의 인간 성인 피질 배지를 조심스럽게 추가하여 조직을 완전히 잠급니다. 급성 인간 성인 피질 조직은 뉴런, 희소돌기아교세포 및 성상교세포의 존재를 나타내어 조직의 최적 보존을 나타냈다. 조직은 세포 배양 2주 후에 뉴런 마커인 NeuN 및 Map2의 발현을 나타내었다.전체 세포 패치 클램프 기록은 뉴런이 급성 제제의 뉴런에 필적하는 휴지 막 전위와 막 입력 저항을 유지했음을 보여주었습니다. 세포는 신선한 조직보다 약간 덜 활동적이었지만 대부분의 세포는 다중 활동 전위는 아니더라도 적어도 하나를 발사할 수 있었습니다. 급성 피질 조직은 소교세포 마커인 Iba1 및 Tmem119의 발현을 나타내었다.배양 2주 후, 미세아교세포는 급성 조직보다 덜 파쇄되고 더 활성화된 형태를 획득했습니다. 생체 외 이식 4주 후, 이식된 GFP-lt-NES 세포는 전체 기관형 배양에 걸쳐 광범위하고 복잡한 수목화와 함께 확장된 신경돌기를 나타냈습니다. 이식 된 세포는 잘 보존되지 않은 조직에서 거의 생존하지 못했습니다.죽은 세포에 대한 항체의 파편 및 비특이적 표지는 인간 조각 전체에서 광범위하게 관찰되었습니다. 성공적인 이식의 경우, 세포는 기능적으로 활성화되었고 성숙한 뉴런은 반복적이고 종종 자발적인 활동 전위를 보였다. 빠른 내부 나트륨, 느린 외부 칼륨 전류 및 특정 수준의 시냅스 활성은 이식 후 4주 후에 이식편과 숙주 조직의 기능적 통합을 나타냅니다.수술실에서 나온 인체 조직이 더 빨리 처리될수록 시스템의 생존력과 실험 절차의 성공률이 높아집니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

연구

신경과학

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

마우스 후뇌<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...