Name: organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation
Uploaded: 2022-12-09T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation at JoVE.com

Este trabalho é apoiado por doações do Conselho Sueco de Pesquisa, da Fundação Sueca do Cérebro, da Fundação Sueca de AVC, da Região de Skåne, da Fundação Thorsten e Elsa Segerfalk e da Iniciativa do Governo Sueco para Áreas de Pesquisa Estratégicas (StemTherapy).

Este protocolo segue as diretrizes aprovadas pelo Comitê Regional de Ética, Lund, Suécia (número de permissão ética 2021-07006-01). Tecido neocortical saudável foi obtido de pacientes submetidos a cirurgia eletiva para epilepsia do lobo temporal. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.
NOTA: Todos os tecidos obtidos foram processados independentemente do seu tamanho. No entanto, tecidos menores que 1-1,5 mm3 de tamanho serão tecnicamente difíceis de manu...

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	<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+treatment+of+stroke:+Present+status+and+future+perspectives.">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).</li><li>Armstrong, M. J., Okun, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slice+culture:+A+useful+tool+to+study+brain+disorders+and+potential+therapeutic+compounds.">Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+response+of+resected+human+brain+tissue+in+vitro.">Injury response of resected human brain tissue in vitro.</a> Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).</li><li>Verwer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+loyalties+of+neuronal+markers+in+cultured+slices+of+resected+human+brain+tissue.">Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue.</a> Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).</li><li>Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+of+microglia+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury.</a> Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).</li><li>Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slices+for+epilepsy+research:+Pitfalls,+solutions+and+future+challenges.">Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).</li><li>Schwarz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+adult+human+brain+slice+cultures+as+a+model+system+to+study+human+CNS+circuitry+and+disease.">Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease.</a> Elife. 8, 48417 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+technology+for+brain+and+therapeutics+research.">Organoid technology for brain and therapeutics research.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurological+diseases+with+human+brain+organoids.">Modeling neurological diseases with human brain organoids.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).</li><li>Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+in+stem+cell+therapy+for+stroke:+Filling+the+gap.">Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).</li></ol>

Obter fatias hACtx de qualidade suficientemente alta é a etapa mais crítica neste protocolo. O tecido cortical é obtido de pacientes epilépticos submetidos à cirurgia ressectiva24. A qualidade do tecido ressecado, bem como o tempo de exposição do tecido entre a ressecção e a cultura, é fundamental; quanto mais rápido o tecido for transferido da sala de cirurgia para o laboratório e cortado, mais ideal será a cultura organotípica. Idealmente, o tecido deve ser cortad...

Distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer ou o acidente vascular cerebral isquêmico, são um grupo de doenças que compartilham a característica comum de mau funcionamento neuronal ou morte. Eles são heterogêneos em termos de área do cérebro e população neuronal afetada. Infelizmente, os tratamentos para essas doenças são escassos ou de eficácia limitada devido à falta de modelos animais que imitem o que ocorre no cérebro humano 1,2. A terapia com células-tronco é uma das estratégias mais promissoras para a regeneração cerebral3. A geração de progenitores neuronais a partir de células-tronco de diferentes fontes tem sido muito desenvolvida nos últimos anos 4,5. Publicações recentes mostraram que células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) derivadas de células neuroepiteliais auto-renovadoras a longo prazo (lt-NES), seguindo um protocolo de diferenciação cortical e após transplante intracortical em um modelo de rato com acidente vascular cerebral isquêmico afetando o córtex somatossensorial, geram neurônios corticais maduros. Além disso, os neurônios derivados do enxerto receberam conexões sinápticas aferentes e eferentes dos neurônios hospedeiros, mostrando sua integração na rede neuronal de ratos 6,7. Os axônios derivados do enxerto foram mielinizados e encontrados em diferentes áreas do cérebro de ratos, incluindo a área peri-infarto, corpo caloso e córtex somatossensorial contralateral. Mais importante ainda, o transplante derivado de células iPS reverteu déficits motores em animais com AVC7.
Mesmo que os modelos animais ajudem a estudar a sobrevivência do transplante, a integração neuronal e o efeito das células enxertadas nas funções motoras e cognitivas, faltam informações sobre a interação entre as células humanas (enxerto-hospedeiro) nesse sistema 8,9. Por esta razão, um método combinado de cultura organotípica do cérebro humano a longo prazo com o transplante ex vivo de progenitores neuronais derivados de células iPS humanas é descrito aqui. As culturas organotípicas do cérebro humano obtidas a partir de ressecções neurocirúrgicas são modelos 3D fisiologicamente relevantes do cérebro que permitem aos pesquisadores aumentar sua compreensão dos circuitos do sistema nervoso central humano e a maneira mais precisa de testar tratamentos para distúrbios cerebrais humanos. No entanto, não foram realizadas pesquisas suficientes nesse contexto e, na maioria dos casos, culturas organotípicas cerebrais do hipocampo humano têm sido utilizadas10,11. O córtex cerebral é afetado por diversos distúrbios neurodegenerativos, como o AVC isquêmico12 ou a doença de Alzheimer13, por isso é importante ter um sistema 3D cortical humano que nos permita expandir nossos conhecimentos e testar e validar diferentes estratégias terapêuticas. Vários estudos nos últimos anos têm utilizado culturas de tecido cortical humano adulto (hACtx) para modelar doenças cerebrais humanas 14,15,16,17,18,19; no entanto, informações limitadas estão disponíveis no contexto da terapia com células-tronco. Dois estudos já demonstraram a viabilidade do sistema aqui descrito. Em 2018, células-tronco embrionárias humanas programadas com diferentes fatores de transcrição e transplantadas para o tecido hACtx demonstraram dar origem a neurônios corticais maduros que poderiam se integrar em redes corticais humanas adultas20. Em 2020, o transplante de células lt-NES para o sistema organotípico humano revelou sua capacidade de se diferenciar em neurônios corticais maduros e específicos de camadas com as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios funcionais. Os neurônios enxertados estabeleceram contatos sinápticos aferentes e eferentes com os neurônios corticais humanos nas fatias cerebrais adultas, corroborado pelo rastreamento monossináptico retrógrado do vírus da raiva, registros de patch-clamp de células inteiras e microscopia imunoeletrônica21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Cutting and electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controller&#160;</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>TC0511354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julaba FL 300</td>
			<td>9661012.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Patch-Clamp amplifier</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>EPC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-Triphosphate disodium salt</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>371701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>HEKA electronic</td>
			<td>Patchmaster 2x91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B25135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive: Acryl super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2062278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RINSING SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alvetex scaffold 6 well insert</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP004-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys without Phenol Red</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>#05791</td>
			<td>Referenced as neuronal medium in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter units 250 mL or 500 mL</td>
			<td>Corning Sigma</td>
			<td>CLS431096/97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Referenced as L-glutamine in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENERATION OF lt-NES cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Free Recombinant EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Suplemment (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine, V. calcifornicum</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td># 239803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+) Glucose solution (45%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100 x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Merk</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Wnt-3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>MilliQ filter system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR CELL CULTURE&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS354277-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Centrifugen</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td>5% CO2, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoForma Steri-Cult CO2</td>
			<td>HEPA Class100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>14601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips 0.1-1000 &#160;&#181;L</td>
			<td>Biotix VWR</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL</td>
			<td>Costar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks Nunc</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-545-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>016-600-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoReserach</td>
			<td>715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D27802</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AIF1 (C-terminal)&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AHP2024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MBP&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>808402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SC123&#160;</td>
			<td>Stem Cells Inc</td>
			<td>AB-123-U-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>S30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>150127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Potassium phospate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TMEM119&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab185333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>327371000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN Black edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber teat + Glass pipette</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic cultures of adult human cortex as an ex vivo model for human stem cell transplantation and validation

Os distúrbios neurodegenerativos são comuns e heterogêneos em termos de sintomas e afetação celular, tornando seu estudo complicado devido à falta de modelos animais adequados que imitam totalmente as doenças humanas e a baixa disponibilidade de tecido cerebral humano post-mortem. A cultura de tecido nervoso humano adulto oferece a possibilidade de estudar diferentes aspectos de distúrbios neurológicos. Mecanismos moleculares, celulares e bioquímicos poderiam ser facilmente abordados neste sistema, bem como testar e validar drogas ou diferentes tratamentos, como terapias baseadas em células. Este método combina culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto, obtidas de pacientes epilépticos submetidos a cirurgia ressectiva, e transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Este método permitirá o estudo da sobrevivência celular, diferenciação neuronal, a formação de entradas e saídas sinápticas e as propriedades eletrofisiológicas de células derivadas de humanos após o transplante em tecido cortical humano adulto intacto. Essa abordagem é um passo importante antes do desenvolvimento de uma plataforma de modelagem de doenças humanas 3D que aproximará a pesquisa básica da tradução clínica de terapias baseadas em células-tronco para pacientes com diferentes distúrbios neurológicos e permitirá o desenvolvimento de novas ferramentas para a reconstrução de circuitos neurais danificados.

Seguindo o protocolo descrito, o tecido hACtx de um paciente com epilepsia do lobo temporal foi coletado e processado, conforme explicado acima. Alguns cortes foram fixados após 24 h em cultura para estudar o ponto de partida do tecido hospedeiro. A análise de diferentes populações de células neurais, como neurônios (expressando NeuN e Map2, Figura 1A), oligodendrócitos (Olig2 e MBP, Figura 1B) e astrócitos (GFAP humano-específico, também chamado STEM123, Figura 1C) mostrou preserv...

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Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Este protocolo descreve culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto combinadas com transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas, que apresentam uma nova metodologia para testar ainda mais terapias baseadas em células-tronco para distúrbios neurodegenerativos humanos.

Culturas organotípicas do córtex humano adulto como modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

As culturas organotípicas do córtex adulto humano são até agora o único sistema para testar terapias com células-tronco para o córtex danificado que permite estudar a interação entre células hospedeiras humanas enxertadas e humanas. Uma terapia testada em modelos animais geralmente falha quando traduzida para os ambientes clínicos devido às diferenças entre células de roedores e humanos. Aqui, podemos estudar células enxertadas, sobrevivência, diferenciação e funcionalidade em um ambiente de humano para humano.Essa metodologia nos ajudará a entender como o circuito neural opera no cérebro humano e também estimulará a tradução desse conhecimento nos ambientes clínicos para melhorar a recuperação funcional após danos cerebrais. Demonstrando o procedimento estarão Raquel Martinez-Curiel, aluna de doutorado, e Costanza Aretio-Medina, mestranda, ambas do meu laboratório. Para começar, coloque as inserções de cultura em uma placa de seis poços usando fórceps no laboratório de cultura celular sob um exaustor ventilado.Adicione cinco mililitros do meio cortical adulto humano na parte inferior da inserção até que ele entre em contato com a membrana. Evite a formação de bolhas e adicione dois mililitros do meio em cima da pastilha. Antes de transferir as fatias de tecido para as inserções, equilibre-as na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos duas horas.Colete o tecido do paciente na sala de cirurgia em um recipiente de solução de corte congelada, borbulhada e esmagada. Transfira o recipiente fechado no gelo imediatamente para a área de corte do laboratório. Inspecione o tecido e, considerando a orientação da camada cortical, localize a melhor superfície para colá-la ao estágio de corte do vibratome.Se necessário, corte a superfície irregular com o bisturi para colocar o tecido no palco para uma orientação ideal da fatia. Em seguida, cole o tecido no palco com adesivo de tecido. Coloque-o na câmara de corte e encha-o imediatamente com uma solução de corte fria e borbulhada.Continue o borbulhar durante todo o processo de corte. Agora corte fatias coronais ou sagitais, dependendo da orientação do tecido para a lâmina, conforme descrito no manuscrito. Coloque as fatias na câmara de recolha com solução de corte borbulhante à temperatura ambiente.Uma vez que todo o tecido tenha sido cortado, transfira as fatias para uma placa de Petri estéril com solução de enxágue à temperatura ambiente para remover o excesso de sacarose das fatias e transportá-las para o laboratório de cultura celular. Em seguida, coloque as fatias de tecido individualmente em cima das inserções molhadas e submersas. Após 24 horas, troque o meio para remover qualquer sacarose remanescente ou outras substâncias residuais do procedimento de corte.Após duas semanas, use meio cortical adulto humano sem gentamicina. Retirar o meio do balão de cultura celular. No sétimo dia de diferenciação, desprenda as células GFP-lt-NES corticalmente preparadas adicionando 500 microlitros de tripsina e incube por 5 a 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione um volume igual do inibidor de tripsina seguido por cinco mililitros de meio DDM. Ressuspenda as células, transfira suavemente a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugar por cinco minutos a 300 G.Enquanto isso, transfira a placa contendo o tecido humano da incubadora para o exaustor e remova dois mililitros de mídia do topo da inserção. No final da centrifugação, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em uma matriz de membrana basal fria e pura e transfira a pensão para um tubo menor.Recolher a suspensão celular num capilar de vidro frio ligado a uma tetina de borracha para sucção. Injete a suspensão celular como pequenas gotas, esfaqueando o corte de tecido semi-seco em vários locais. Deixe o gel solidificar a 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, transfira a placa da incubadora de volta para o exaustor e adicione cuidadosamente dois mililitros de meio cortical adulto humano ao topo da inserção para submergir completamente o tecido. O tecido cortical adulto humano agudo mostrou a presença de neurônios, oligodendrócitos e astrócitos exibindo preservação ideal do tecido. O tecido apresentou a expressão dos marcadores neuronais NeuN e Map2 após duas semanas de cultura celular.O registro do grampo do remendo de célula inteira mostrou que os neurônios tinham potencial de membrana de repouso sustentado e resistência à entrada de membrana, comparável aos neurônios de preparações agudas. As células eram ligeiramente menos ativas do que no tecido fresco, embora a maioria das células fosse capaz de disparar pelo menos um, se não múltiplos potenciais de ação. O tecido cortical agudo apresentou a expressão dos marcadores microgliais Iba1 e Tmem119.Após duas semanas em cultura, a micróglia tornou-se menos ramificada e adquiriu uma morfologia mais ativada do que no tecido agudo. Quatro semanas após o transplante ex vivo, as células GFP-lt-NES enxertadas exibiram neurites estendidos com arborizações extensas e complexas em toda a cultura organotípica. Quase nenhuma célula enxertada sobreviveu em tecido mal preservado.Detritos e marcação inespecífica de anticorpos em células mortas foram amplamente observados em toda a fatia humana. No caso de transplante bem-sucedido, as células tornaram-se funcionalmente ativas e os neurônios maduros apresentaram potenciais de ação repetitivos e muitas vezes espontâneos. Sódio rápido para dentro, correntes lentas de potássio para fora e um certo nível de atividade sináptica indicam integração funcional do enxerto com o tecido hospedeiro quatro semanas após o enxerto.Quanto mais rápido o tecido humano é processado uma vez que está fora da sala de operação, maior a viabilidade do sistema e o sucesso do procedimento experimental.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

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Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Neurociência

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

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Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

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A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

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We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

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Rato rombencéfalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para estudar Facial Migração Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

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Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

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Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...