Name: quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) subsidie DGE - 1644869 en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) van de National Institutes of Health (NIH), awardnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (aan CKCO), het National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (aan AMP), het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 naar CMT) en het Department of Defense Army/Air Force (DURIP naar CMT).

Dit protocol volgt de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Knaagdierexperimenten werden goedgekeurd en gecontroleerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Columbia University.
1. Voorbereiding van netvliesweefsel en cryosectie
<ol><li>Euthanaseer de dieren door toediening van intraperitoneale anesthesie (ketamine (ketamine (80-100 mg / kg) en xy...

<ol>
	<li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+disease.">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li><li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+therapeutic+targets+in+neurologic+disease.">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li><li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9:+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease.">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li><li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system:+implications+for+functions+in+health+and+disease.">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li><li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion.">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).</li><li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability.">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).</li><li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development.">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li><li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma.">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).</li><li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury.">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence,+incidence,+and+risk+factors.">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li><li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9.">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li><li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+in+the+balance:+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation.">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li></ol>

Caspasen zijn een meergedelige familie van proteasen die het best bestudeerd kunnen worden voor hun rol bij celdood en ontsteking; meer recent zijn echter verschillende niet-doodsfuncties ontdekt voor sommige familieleden 4,5. Veel van ons begrip van de caspase-functie is afgeleid van werk in celkweek en van inferentiële gegevens van menselijke ziekten. Hoewel het wordt gewaardeerd dat er afwijkende inductie, activering of inactivatie van caspasen bij ziekte is,...

De caspasen zijn een familie van proteasen die ontwikkelingsceldood, immuunresponsen en afwijkende celdood bij ziekte 1,2 reguleren. Hoewel het bekend is dat leden van de caspase-familie worden geïnduceerd in een verscheidenheid aan neurodegeneratieve ziekten, is het moeilijker om te begrijpen welke caspase de ziektepathologie aandrijft3. Dergelijke studies vereisen hulpmiddelen om de functie van individuele caspase-familieleden te identificeren, te karakteriseren en te valideren. Het ontleden van de relevante individuele caspasen is belangrijk, zowel vanuit een mechanistisch als een therapeutisch standpunt, omdat de literatuur meerdere studies bevat die bewijs leveren voor de verschillende rollen van caspasen 4,5. Dus als het doel is om een caspase in een ziekte te richten voor een therapeutisch voordeel, is het van cruciaal belang om specifieke targeting van het relevante familielid (en) te hebben. Traditionele technieken om caspaseniveaus in weefsel te detecteren omvatten western blotting en enzymatische en fluorometrische benaderingen 3,6. Geen van deze maatregelen maakt echter celspecifieke detectie van caspaseniveaus mogelijk en in sommige scenario's kunnen gesplitste caspasen vaak niet worden gedetecteerd door traditionele eiwitanalysemaatregelen. Het is bekend dat caspasen verschillende apoptotische en niet-apoptotische rollen kunnen spelen in hetzelfde weefsel7, daarom is een zorgvuldige karakterisering van celspecifieke caspaseniveaus nodig voor een nauwkeurig begrip van ontwikkelings- en ziekteroutes.
Deze studie toont caspase activatie en functie in een model van neurovasculaire hypoxie-ischemie - retinale ader occlusie (RVO)7,8. In een complex weefsel zoals het netvlies zijn er meerdere celtypen die kunnen worden beïnvloed door de hypoxie-ischemie geïnduceerd in RVO, waaronder gliacellen, neuronen en vasculatuur7. In het netvlies van de volwassen muis is er zeer weinig expressie van caspasen zichtbaar in gezond weefsel, zoals gemeten door immunohistochemie (IHC)7, maar dat is niet het geval tijdens ontwikkeling9 of in modellen van retinale ziekte10,11. IHC is een techniek die goed is ingeburgerd in biomedisch onderzoek en heeft validatie van ziekte en pathologische doelen, identificatie van nieuwe rollen door ruimtelijke lokalisatie en kwantificering van eiwitten mogelijk gemaakt. In gevallen waarin gesplitste caspaseproducten niet kunnen worden gedetecteerd door western blot of fluorometrische analyse, noch de specifieke cellocatie van verschillende caspasen of ondervraging van caspase-signaleringsroutes door lokalisatie, moet IHC worden gebruikt.
Om de caspase(s) functioneel relevant in RVO te bepalen, werd IHC gebruikt met gevalideerde antilichamen voor caspasen en cellulaire markers. De eerdere studies uitgevoerd in het laboratorium toonden aan dat caspase-9 snel werd geactiveerd in een model van ischemische beroerte en remming van caspase-9 met een zeer specifieke remmer beschermd tegen neuronale disfunctie en overlijden12. Omdat het netvlies deel uitmaakt van het centrale zenuwstelsel (CZS), dient het als een modelsysteem om de rol van caspase-9 bij neurovasculaire verwondingen te onderzoeken en verder te onderzoeken13. Hiertoe werd het muismodel van RVO gebruikt om de celspecifieke locatie en distributie van caspase-9 en de implicatie ervan in neurovasculair letsel te bestuderen. RVO is een veel voorkomende oorzaak van blindheid bij werkende volwassenen die het gevolg is van vaatletsel14. Het bleek dat caspase-9 op een niet-apoptotische manier tot expressie kwam in endotheelcellen, maar niet in neuronen.
Als weefsel heeft het netvlies het voordeel dat het wordt gevisualiseerd als een flatmount, die waardering van de vasculaire netwerken mogelijk maakt, of als doorsneden, die de neuronale retinale lagen benadrukken. Kwantificering van caspase-eiwitexpressie in doorsneden biedt context, met betrekking tot welke caspase potentieel kritisch is in retinale neuronale connectiviteit en visiefunctie door de lokalisatie van de caspase (s) in het netvlies te identificeren. Na identificatie en validatie wordt targeting van de caspase van belang bereikt met behulp van induceerbare celspecifieke deletie van de geïdentificeerde caspase. Voor mogelijke therapeutische onderzoeken werd de relevantie van de caspasen van belang getest met behulp van specifieke hulpmiddelen om de geactiveerde caspase te remmen. Voor caspase-9 werd een celpermeant zeer selectieve remmer 7,15, Pen1-XBIR3 gebruikt. Voor dit rapport werden 2 maanden oude, mannelijke C57BL/6J stam en tamoxifen-induceerbare endotheel caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stam met een C57BL/6J achtergrond gebruikt. Deze dieren werden blootgesteld aan het muismodel van RVO en C57BL/6J werden behandeld met de caspase-9 selectieve remmer, Pen1-XBir3. De beschreven methodologie kan worden toegepast op andere ziektemodellen in het centrale en perifere systeem 7,15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Caspase-7 488</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB-56529AF488</td>
			<td>use at 1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cl-Caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9505-S</td>
			<td>use at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Spinning Disc Microscope</td>
			<td>Biovision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI 2.3.0</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin (594, 649)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>DL-1207</td>
			<td>use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen1-XBir3</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9.1</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-a-View 4.0</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue

Van de familie van caspasen is bekend dat ze vele cellulaire routes bemiddelen voorbij celdood, waaronder celdifferentiatie, axonale pathfinding en proliferatie. Sinds de identificatie van de familie van celdoodproteasen is er gezocht naar hulpmiddelen om de functie van specifieke familieleden in ontwikkelings-, gezondheids- en ziektetoestanden te identificeren en uit te breiden. Veel van de momenteel in de handel verkrijgbare caspase-tools die veel worden gebruikt, zijn echter niet specifiek voor de beoogde caspase. In dit rapport schetsen we de aanpak die we hebben gebruikt om caspase-9 in het zenuwstelsel te identificeren, valideren en targeten met behulp van een nieuwe remmer en genetische benaderingen met immunohistochemische uitlezingen. Specifiek gebruikten we het retinale neuronale weefsel als een model om de aanwezigheid en functie van caspasen te identificeren en te valideren. Deze benadering maakt het mogelijk om celtypespecifieke apoptotische en niet-apoptotische caspase-9-functies te ondervragen en kan worden toegepast op andere complexe weefsels en caspasen van belang. Het begrijpen van de functies van caspasen kan helpen om de huidige kennis in celbiologie uit te breiden, en kan ook voordelig zijn om potentiële therapeutische doelen te identificeren vanwege hun betrokkenheid bij ziekte.

Het beschreven protocol stelt de gebruiker in staat om caspase-9-niveaus in het netvliesweefsel te analyseren en te kwantificeren. Daarnaast presenteert het tools om caspase-9 en downstream substraten verder te identificeren, valideren en specifiek te targeten. De samengevatte stappen maken kwantificeerbare analyse van caspaseniveaus en cellulaire specificiteit in fluorescerende fotomicrografieën mogelijk. Alle cijfers tonen representatieve fotomicrografieën en kwantificering van de aangegeven caspaseniveaus in het tot...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Hier wordt een gedetailleerd immunohistochemisch protocol gepresenteerd om functioneel relevante caspasen in complexe weefsels te identificeren, valideren en targeten.

Kwantificering van immunostained Caspase-9 in retinaal weefsel

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Dit protocol biedt een gedetailleerde immunohistochemische methode om functioneel relevante caspasen in complexe weefsels te identificeren, valideren en targeten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om celtypespecifieke apoptotische en niet-apoptotische caspase-9-functies te ondervragen en kan worden toegepast op andere complexe weefsels en caspasen van belang. Het begrijpen van de functies van caspasen kan helpen om de huidige kennis in celbiologie uit te breiden en kan ook voordelig zijn om potentiële therapeutische doelen te identificeren vanwege hun betrokkenheid bij ziekte.Begin met het kwantificeren van de caspase-niveaus met behulp van confocale microscopiebeelden van gekleurde retinale secties. Sleep hiervoor de afbeeldingsbestanden van 405, 470, 555 en 640 kanalen naar de console van Fiji. Klik op de tabbladen afbeelding, kleur en samenvoegkanalen om kleuren aan de bestanden toe te wijzen.Comprimeer vervolgens de Z-stapel door op de afbeeldingsstapel en het Z-project te klikken. Selecteer het projectietype als maximale intensiteit. Open de interface van het kanaal door op de afbeelding te klikken, gevolgd door het gereedschap van het kleurkanaal.Open vervolgens de helderheids- en contrastinterface. Als u de parameters per kanaal wilt selecteren, gaat u naar het tabblad van het kanaal en kiest u één kanaal. Plaats de cursor op de achtergrond en annoteer de pixelwaarde.Plaats vervolgens de cursor op de caspase-tot expressie gebrachte cel en annoteer de pixelwaarde. Als u de parameters wilt testen, gaat u naar de interface voor helderheid en contrast en klikt u op Selecteren. Sluit de minimaal weergegeven waarde of de pixelwaarde van de caspase-uitgedrukte cel aan.Sluit vervolgens de maximaal weergegeven waarde of de achtergrondpixelwaarde aan voordat u op OK klikt. Kies de willekeurige beelden van geblindeerd weefsel en herhaal de selectie van parameters per kanaal om de parameters voor alle kanalen te testen. Zodra de parameters zijn ingesteld, opent u de afbeeldingsbestanden en comprimeert u de Z-stapel.Voeg de helderheids- en contrastparameters voor het caspasekanaal en het isolectine voor het vasculaire markerkanaal toe. Gebruik het puntgereedschap en kwantificeer het aantal positieve vasculaire gebieden met behulp van colocalisatie van de vasculaire marker met caspase-expressie als de uitlezing van positieve gebieden. Gebruik vervolgens haken als de marker van positieve neuronale gebieden en kwantificeer het aantal positieve vasculaire gebieden.Annoteer de waarden in een spreadsheet per afbeelding en gemiddelde de waarden per sectie. Gemiddelde van de sectiewaarden, die de uitlezing per oog zijn. Het protocol identificeerde de cellulaire lokalisatie van de caspasen en de neuronale retinale lagen waarin de caspasen tot expressie komen.De retinale doorsnede maakte de visualisatie van retinale kernen in de retinale ganglionlaag of RGL, internucleaire laag of INL mogelijk, en de buitenste nucleaire laag of ONL wanneer gekleurd met haken. In de doorsnede leken de retinale bloedvaten losgekoppeld en gescheiden van de plexiforme lagen tussen de RGL en INL en tussen de INL en ONL. Retinale doorsneden identificeerden ook de sterk gereguleerde caspase-9, een dag na retinale ader occlusie.De caspase-9-remming was effectiever in het verminderen van neuronale caspase-7-expressie in endotheelcel knock-out muizen die de functionele relevantie van endotheel caspase-9 valideerden. De representatieve analyse toonde aan dat de remming van caspase-9-activiteit farmacologisch de caspase-7-expressie na retinale ader occlusie blokkeerde. Het succes van de techniek is afhankelijk van zorgvuldige weefselvoorbereiding en IHC- en microscopische beeldvorming om consistentie, validiteit en betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.Deze methode kan worden gecombineerd met western blotting-analyse voor semi-kwantitatieve vergelijking van caspase-signalering. De techniek bood de stappen om de werkzaamheid van een therapeutische aanpak gericht op actieve caspase-9 in RVO te onderzoeken. Deze aanpak kan ook worden toegepast op andere weefsels, waaronder de hersenen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometrische analyses van het netvlies secties

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...