Name: quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00
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इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (एनएसएफ-जीआरएफपी) अनुदान डीजीई - 1644869 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), पुरस्कार संख्या एफ 99एनएस 124180 एनआईएच एनआईएनडीएस विविधता विशेष एफ 99 (सीकेसीओ को), राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई) 5 टी 32 ईवाई013933 (एएमपी के लिए), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (आरओ 1 एनएस 1 एनएस 1 एनएस 08) द्वारा समर्थित किया गया था। आर03 एनएस099920 से सीएमटी तक, और रक्षा सेना / वायु सेना विभाग (डीयूआरआईपी से सीएमटी)।

यह प्रोटोकॉल नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) बयान का पालन करता है। कृंतक प्रयोगों को कोलंबिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पश...

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	<li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+disease.">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li><li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+therapeutic+targets+in+neurologic+disease.">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li><li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9:+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease.">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li><li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system:+implications+for+functions+in+health+and+disease.">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li><li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion.">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).</li><li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability.">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).</li><li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development.">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li><li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma.">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).</li><li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury.">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence,+incidence,+and+risk+factors.">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li><li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9.">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li><li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+in+the+balance:+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation.">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li></ol>

कैसपेस प्रोटीज का एक बहु-सदस्यीय परिवार है जो कोशिका मृत्यु और सूजन में उनकी भूमिकाओं के लिए सबसे अच्छा अध्ययन किया जाता है; हालांकि, हाल ही में कुछ परिवारके सदस्यों के लिए विभिन्न प्रकार ?...

कैसपेस प्रोटीज का एक परिवार है जो रोग 1,2 में विकासात्मक कोशिका मृत्यु, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और असामान्य कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करता है। हालांकि यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि कैसपेज़ परिवार के सदस्यों को विभिन्न प्रकार के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में प्रेरित किया जाता है, यह समझना कि कौन सा कैसपेज़ रोग विकृति चलाता है, अधिक चुनौतीपूर्ण है। इस तरह के अध्ययनों में व्यक्तिगत कैसपेस परिवार के सदस्यों के कार्य को पहचानने, चिह्नित करने और मान्य करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है। प्रासंगिक व्यक्तिगत कैसपेस को पार्स करना एक यंत्रवत और चिकित्सीय दृष्टिकोण दोनों से महत्वपूर्ण है, क्योंकि साहित्य में कैसपेज़ 4,5 की विविध भूमिकाओं के प्रमाण प्रदान करने वाले कई अध्ययन हैं। इस प्रकार, यदि लक्ष्य चिकित्सीय लाभ के लिए किसी बीमारी में कैसपेस को लक्षित करना है, तो संबंधित परिवार के सदस्य (ओं) का विशिष्ट लक्ष्यीकरण करना महत्वपूर्ण है। ऊतक में कैसपेज़ के स्तर का पता लगाने के लिए पारंपरिक तकनीकों में पश्चिमी सोख्ता और एंजाइमेटिक और फ्लोरोमेट्रिक दृष्टिकोण 3,6 शामिल हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी उपाय कैस्पेस स्तरों के सेल-विशिष्ट पता लगाने की अनुमति नहीं देता है, और कुछ परिदृश्यों में, क्लीवर कैसपेस को अक्सर पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण उपायों द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। यह ज्ञात है कि कैसपेस एक ही ऊतक7 में विभिन्न एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक भूमिका निभा सकते हैं, इसलिए विकास और रोग मार्गों की सटीक समझ के लिए सेल-विशिष्ट कैसपेज़ स्तरों के सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है।
यह अध्ययन न्यूरोवास्कुलर हाइपोक्सिया-इस्किमिया के एक मॉडल में कैसपेस सक्रियण और कार्य दिखाता है - रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) 7,8। रेटिना जैसे जटिल ऊतक में, कई सेल प्रकार होते हैं जो आरवीओ में प्रेरित हाइपोक्सिया-इस्केमिया से प्रभावित हो सकते हैं, जिसमें ग्लियल कोशिकाएं, न्यूरॉन्स और वास्कुलचर7 शामिल हैं। वयस्क माउस रेटिना में, स्वस्थ ऊतक में कैस्पेस की बहुत कम अभिव्यक्ति होती है, जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) 7 द्वारा मापा जाता है, लेकिन विकास9 के दौरान या रेटिना रोग10,11 के मॉडल में ऐसा नहीं है। आईएचसी एक ऐसी तकनीक है जो बायोमेडिकल अनुसंधान में अच्छी तरह से स्थापित है और रोग और पैथोलॉजिकल लक्ष्यों के सत्यापन, स्थानिक स्थानीयकरण के माध्यम से नई भूमिकाओं की पहचान और प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी है। ऐसे मामलों में जहां क्लीवर कैसपेज़ उत्पादों को पश्चिमी धब्बा या फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है, न ही स्थानीयकरण के माध्यम से अलग-अलग कैसपेज़ के विशिष्ट सेल स्थान या कैसपेज़ सिग्नलिंग मार्गों की पूछताछ, तो आईएचसी का उपयोग किया जाना चाहिए।
आरवीओ में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैस्पेस (ओं) को निर्धारित करने के लिए, आईएचसी का उपयोग कैसपेस और सेलुलर मार्करों के लिए मान्य एंटीबॉडी के साथ किया गया था। प्रयोगशाला में किए गए पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कैस्पेस -9 को इस्केमिक स्ट्रोक के एक मॉडल में तेजी से सक्रिय किया गया था और कैसपेज़ -9 के निषेध के साथ न्यूरोनल डिसफंक्शन और मृत्यु12 से संरक्षित एक अत्यधिक विशिष्ट अवरोधक था। क्योंकि रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का हिस्सा है, यह न्यूरोवास्कुलर चोटों13 में कैसपेज़ -9 की भूमिका को क्वेरी करने और आगे की जांच करने के लिए एक मॉडल सिस्टम के रूप में कार्य करता है। इसके लिए, आरवीओ के माउस मॉडल का उपयोग कैस्पेज़ -9 के सेल-विशिष्ट स्थान और वितरण और न्यूरोवास्कुलर चोट में इसके निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए किया गया था। आरवीओ कामकाजी वृद्ध वयस्कों में अंधापन का एक सामान्य कारण है जो संवहनी चोट14 के परिणामस्वरूप होता है। यह पाया गया कि कैसपेज़ -9 को एंडोथेलियल कोशिकाओं में गैर-एपोप्टोटिक तरीके से व्यक्त किया गया था, लेकिन न्यूरॉन्स में नहीं।
एक ऊतक के रूप में, रेटिना को या तो एक फ्लैटमाउंट के रूप में कल्पना करने का लाभ होता है, जो संवहनी नेटवर्क की सराहना की अनुमति देता है, या क्रॉस-सेक्शन के रूप में, जो न्यूरोनल रेटिना परतों पर प्रकाश डालता है। क्रॉस-सेक्शन में कैसपेज़ प्रोटीन अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण संदर्भ प्रदान करता है, जिसके बारे में रेटिना में कैसपेज़ (ओं) के स्थानीयकरण की पहचान करके रेटिना न्यूरोनल कनेक्टिविटी और दृष्टि समारोह में कैसपेज़ संभावित रूप से महत्वपूर्ण है। पहचान और सत्यापन के बाद, पहचाने गए कैसपेज़ के इंड्यूसेबल सेल विशिष्ट विलोपन का उपयोग करके रुचि के कैसपेज़ का लक्ष्यीकरण प्राप्त किया जाता है। संभावित चिकित्सीय पूछताछ के लिए, सक्रिय कैसपेज़ को रोकने के लिए विशिष्ट उपकरणों का उपयोग करके रुचि के कैसपेस की प्रासंगिकता का परीक्षण किया गया था। कैसपेज़ -9 के लिए एक सेल अत्यधिक चयनात्मक अवरोधक 7,15, पेन 1-एक्सबीआईआर 3 का उपयोग किया गया था। इस रिपोर्ट के लिए, सी 57बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि के साथ 2 महीने के, पुरुष सी 57बीएल / 6 जे स्ट्रेन और टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल एंडोथेलियल कैस्पेज़ -9 नॉकआउट (आईईसी कैस्प 9 केओ) स्ट्रेन का उपयोग किया गया था। इन जानवरों को आरवीओ के माउस मॉडल के संपर्क में लाया गया था और सी 57बीएल / 6 जे को कैसपेज़ -9 चयनात्मक अवरोधक, पेन 1-एक्सबीर 3 के साथ इलाज किया गया था। वर्णित पद्धति को केंद्रीय और परिधीय प्रणालियों 7,15 में रोग के अन्यमॉडलों पर लागू किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Caspase-7 488</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB-56529AF488</td>
			<td>use at 1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cl-Caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9505-S</td>
			<td>use at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Spinning Disc Microscope</td>
			<td>Biovision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI 2.3.0</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin (594, 649)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>DL-1207</td>
			<td>use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen1-XBir3</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9.1</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-a-View 4.0</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue

कैसपेस का परिवार कोशिका मृत्यु से परे कई सेलुलर मार्गों को मध्यस्थ करने के लिए जाना जाता है, जिसमें सेल भेदभाव, अक्षीय पाथफाइंडिंग और प्रसार शामिल हैं। कोशिका मृत्यु प्रोटीज के परिवार की पहचान के बाद से, विकास, स्वास्थ्य और रोग की स्थिति में विशिष्ट परिवार के सदस्यों के कार्य को पहचानने और विस्तारित करने के लिए उपकरणों की खोज की गई है। हालांकि, वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कैसपेज़ उपकरणों में से कई जो व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, लक्षित कैसपेज़ के लिए विशिष्ट नहीं हैं। इस रिपोर्ट में, हम इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रीड-आउट के साथ एक नए अवरोधक और आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके तंत्रिका तंत्र में कैसपेज़ -9 को पहचानने, मान्य करने और लक्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण को चित्रित करते हैं। विशेष रूप से, हमने कैसपेस की उपस्थिति और कार्य की पहचान और मान्य करने के लिए एक मॉडल के रूप में रेटिना न्यूरोनल ऊतक का उपयोग किया। यह दृष्टिकोण सेल-प्रकार विशिष्ट एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक कैसपेज़ -9 कार्यों की पूछताछ को सक्षम बनाता है और इसे अन्य जटिल ऊतकों और रुचि के कैसपेस पर लागू किया जा सकता है। कैसपेस के कार्यों को समझना सेल जीव विज्ञान में वर्तमान ज्ञान का विस्तार करने में मदद कर सकता है, और बीमारी में उनकी भागीदारी के कारण संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।

वर्णित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को रेटिना ऊतक में कैसपेज़ -9 के स्तर का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, यह कैसपेज़ -9 और डाउनस्ट्रीम सब्सट्रेट्स को पहचानने, मान्य करने औ?...

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Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

यहां प्रस्तुत जटिल ऊतकों में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैसपेस की पहचान, सत्यापन और लक्ष्य करने के लिए एक विस्तृत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल है।

रेटिना ऊतक में इम्यूनोस्टेन्ड कैस्पेज़ -9 का परिमाणीकरण

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

यह प्रोटोकॉल जटिल ऊतकों में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैसपेस की पहचान, सत्यापन और लक्ष्य करने के लिए एक विस्तृत इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधि प्रदान करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि सेल प्रकार विशिष्ट एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक कैसपेज़ -9 कार्यों की पूछताछ को सक्षम बनाता है और इसे अन्य जटिल ऊतकों और रुचि के कैसपेस पर लागू किया जा सकता है। कैसपेस के कार्यों को समझना सेल जीव विज्ञान में वर्तमान ज्ञान का विस्तार करने में मदद कर सकता है और बीमारी में उनकी भागीदारी के कारण संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।दाग वाले रेटिना वर्गों की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का उपयोग करके कैसपेज़ स्तरों की मात्रा निर्धारित करना शुरू करें। ऐसा करने के लिए, 405, 470, 555 और 640 चैनलों की छवि फ़ाइलों को फिजी के कंसोल पर खींचें। फ़ाइलों को रंग असाइन करने के लिए छवि, रंग और मर्ज चैनल टैब क्लिक करें.फिर छवि स्टैक और जेड प्रोजेक्ट पर क्लिक करके जेड स्टैक को संपीड़ित करें। अधिकतम तीव्रता के रूप में प्रक्षेपण प्रकार का चयन करें। रंगीन चैनल के टूल के बाद छवि पर क्लिक करके चैनल का इंटरफ़ेस खोलें।इसके बाद, चमक और कंट्रास्ट इंटरफ़ेस खोलें। प्रति चैनल पैरामीटर का चयन करने के लिए, चैनल के टैब पर जाएं और एक चैनल चुनें। पृष्ठभूमि के शीर्ष पर कर्सर रखें और पिक्सेल मान को एनोटेट करें।फिर कैस्पेज़ व्यक्त सेल पर कर्सर डालें और पिक्सेल मान को एनोटेट करें। पैरामीटर का परीक्षण करने के लिए, चमक और कंट्रास्ट इंटरफ़ेस पर जाएं और चयन करें पर क्लिक करें। न्यूनतम प्रदर्शित मान या कैसपेज़ व्यक्त कक्ष के पिक्सेल मान में प्लग करें.फिर ठीक क्लिक करने से पहले अधिकतम प्रदर्शित मान या पृष्ठभूमि पिक्सेल मान प्लग करें। अंधे ऊतक से यादृच्छिक छवियों का चयन करें और सभी चैनलों के लिए मापदंडों का परीक्षण करने के लिए प्रति चैनल मापदंडों का चयन दोहराएं। एक बार पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, छवि फ़ाइलों को खोलें, और जेड स्टैक को संपीड़ित करें।कैसपेज़ चैनल के लिए चमक और कंट्रास्ट पैरामीटर और संवहनी मार्कर चैनल के लिए आइसोलेक्टिन जोड़ें। बिंदु उपकरण का उपयोग करें और सकारात्मक क्षेत्रों के रीडआउट के रूप में कैसपेज़ अभिव्यक्ति के साथ संवहनी मार्कर के सह-स्थानीयकरण का उपयोग करके सकारात्मक संवहनी क्षेत्रों की संख्या निर्धारित करें। फिर सकारात्मक न्यूरोनल क्षेत्रों के मार्कर के रूप में हुक का उपयोग करते हुए, सकारात्मक संवहनी क्षेत्रों की संख्या निर्धारित करें।प्रति छवि स्प्रेडशीट पर मानों को एनोटेट करें और अनुभाग द्वारा मानों का औसत करें। अनुभाग मानों का औसत, जो प्रति आंख रीडआउट होगा। प्रोटोकॉल ने कैसपेस और न्यूरोनल रेटिना परतों के सेलुलर स्थानीयकरण की पहचान की जिसमें कैसपेस व्यक्त किए जाते हैं।रेटिना क्रॉस सेक्शन ने रेटिना गैंग्लियन परत या आरजीएल, इंटरन्यूक्लियर परत या आईएनएल में रेटिना नाभिक के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी, और हुक से सना होने पर बाहरी परमाणु परत या ओएनएल। क्रॉस सेक्शन में, रेटिना रक्त वाहिकाएं डिस्कनेक्ट दिखाई दीं और आरजीएल और आईएनएल के बीच और आईएनएल और ओएनएल के बीच प्लेक्सीफॉर्म परतों की आपूर्ति करने के लिए अलग-अलग दिखाई दीं। रेटिना क्रॉस सेक्शन ने रेटिना नस रोड़ा के एक दिन बाद अत्यधिक विनियमित कैसपेज़ -9 की भी पहचान की।कैसपेज़ -9 निषेध एंडोथेलियल सेल नॉकआउट चूहों में न्यूरोनल कैसपेज़ -7 अभिव्यक्ति को कम करने में अधिक प्रभावी था जिसने एंडोथेलियल कैसपेज़ -9 की कार्यात्मक प्रासंगिकता को मान्य किया। प्रतिनिधि विश्लेषण से पता चला है कि कैसपेज़ -9 गतिविधि के निषेध ने रेटिना नस रोड़ा के बाद कैसपेज़ -7 अभिव्यक्ति को औषधीय रूप से अवरुद्ध कर दिया। तकनीक की सफलता सावधानीपूर्वक ऊतक तैयारी के साथ-साथ आईएचसी और माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग पर निर्भर करती है ताकि डेटा की स्थिरता, वैधता और विश्वसनीयता सुनिश्चित हो सके।इस विधि को कैसपेज़ सिग्नलिंग की अर्ध-मात्रात्मक तुलना के लिए पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है। तकनीक ने आरवीओ में सक्रिय कैसपेज़ -9 को लक्षित करने वाले चिकित्सीय दृष्टिकोण की प्रभावकारिता से पूछताछ करने के लिए कदम प्रदान किए। इस दृष्टिकोण को मस्तिष्क सहित अन्य ऊतकों पर भी लागू किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

में Synaptic प्रतिदीप्ति स्वचालित में मात्रा<em&gt; सी. एलिगेंस</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

विच्छेदन, संस्कृति, और विश्लेषण<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; भ्रूण ऊतक रेटिना

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

चूहा cortical न्यूरॉन्स में filamentous actin (एफ actin) puncta की मात्रा

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

H3 और H4 हिस्टोन प्रोटीन और कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक में Acetylated हिस्टोन के निशान के ठहराव का शुद्धिकरण

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए माउस रेटिना लयाओ-अनुभागों की तैयारी

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

"एक बिल्ली के बड़े पशु मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक का सबरेटिनल प्रत्यारोपण

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

चूहा मस्तिष्क ऊतक के लिए एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...